全 文 ：洋桔梗小孢子培养初步研究
王小巧1，朱 芮3，李琼洁1，朱永平2，赵兴富1，肖靖译1，贾 茸1，秦小杰4，和凤美1* (1．云南农业大学园林
园艺学院，云南昆明 650201;2．云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201;3．福建农林大学艺术园林学院，福建福州 350000;4．云南师
范大学文理学院城市学院，云南昆明 650201)
摘要 ［目的］探索预处理和培养基类型对小孢子离体培养的影响。［方法］以洋桔梗为材料进行小孢子培养，研究预处理和培养基类
型对小孢子离体培养的影响，并筛选胚性愈伤组织适宜诱导培养基、不定芽植株培养基以及最佳生根培养基。［结果］利用 4 ℃低温预
处理 24 h 有利于小孢子愈伤组织的形成。愈伤组织适宜诱导培养基为:MS +3 mg /L KT + 2． 5 mg /L 2，4 － D;不定芽植株培养基为 MS
+1 mg /L 6-BA +0． 2 mg /L NAA;最佳生根培养基为:MS +0． 2 mg /L 6-BA +1． 0 mg /L NAA +1． 5 mg /L IBA + 0． 3 g /L活性炭。经过染
色体倍性鉴定，显示小孢子培养后染色体数目减半。［结论］该方法研究了预处理和培养基类型对小孢子离体培养的影响，为洋桔梗游
离小孢子培养体系的建立以及单倍体育种奠定基础。
关键词 洋桔梗( Eustoma grandiflorum) ;小孢子;离体培养;愈伤组织
中图分类号 S682． 3 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2014) 08 －02291 －04
Preliminary Study on Microspore Culture of Eustoma grandiflorum
WANG Xiao-qiao，HE Feng-mei et al ( College of Horticulture and Landscape，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan
650201)
Abstract ［Objective］To explore effects of pretreatment and culture medium types on microspore in vitro culture． ［Method］With Eustoma
grandiflorum as material，effects of pretreatment and culture medium types on microspore culture were studied． The appropriate induction culture
medium，adventitious bud plant culture medium and optimum rooting culture medium for callus were obtained． ［Ｒesult］The result showed that
treating microspore 4℃ for 24 hours benefited the growing of callus． Solid-liquid medium containing MS +3mg /L KT +2． 5 mg /L 2． 4-D was con-
ducive to callus induction，medium containing MS +1 mg /L 6-BA +0． 2 mg /L NAA +30 g /L Sucrose +6． 1 g /L Agar was beneficial to adventi-
tious buds’induction，suitable medium for root growth contained MS +0． 2 mg /L 6-BA +1． 0 mg /L NAA + 1． 5mg /L IBA + 30 g /L Sucrose +
6． 1 g /L Agar +0． 3 g /L Active carbon． Ｒesult of the chromosome ploidy identification showed that the chromosome numbers were halved through
microspore culture． ［Conclusion］The effects of pretreatment and culture medium types on microspore in vitro culture were studied，which will
lay a foundation for establishment of Eustoma grandiflorum microspore culture system and haploid breeding．
Key words Eustoma grandiflorum; Microspore; Culture in vitro; Callus
基金项目 云南省教育厅重点项目( 2013Z027) 。
作者简介 王小巧( 1987 － ) ，女，安徽宿州人，硕士研究生，研究方向:
国园林植物遗传育种。* 通讯作者。
收稿日期 2014-02-20
洋桔梗(Eustoma grandiflorum)又名草原龙胆，为龙胆科
草原龙胆属(Eustoma)植物，瓶插期长、耐长途运输，花姿雅
丽，花形别致，花色丰富，具有较高的观赏价值，是世界上十
分流行的高档切花之一［1］。我国各地也竞相引种栽培，极具
市场开发前景。但其种源主要是从国外进口 F1 代杂种，价
格昂贵［2］。洋桔梗是异花授粉植物，容易授粉，种子量多，自
交存在衰退现象，自交系之间杂交(F1)表现出超强杂种优
势。由于国外引进洋桔梗品种复杂的遗传背景，使其 F1 代
杂交种子后代分离严重，不能留种种植，因此，传统的洋桔梗
花卉育种常采用杂交一代(F1)育种程序进行。在杂种优势
利用中，亲本必须是纯合的，经组配后才能得到性状一致具
有强杂种优势的杂交种。洋桔梗常规的育种方法选育自交
系，获得一个纯系需要 6 ～8年，时间期限长，选择效率低，耗
费大量的人力和物力，再加之洋桔梗为异花授粉，存在自交
衰退现象，从而导致洋桔梗自交系的获得较困难［3］。
通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需要 1 ～ 2 年时
间，大大缩短自交系选育年限，加速育种进程，提高育种效
率，是现代植物育种中快速、高效的育种途径之一［4 －5］。国
内外已有利用小孢子培养获得植物自交系的报导［6 －8］，但关
于洋桔梗小孢子培养获得单倍体自交系的研究鲜有报道。
笔者开展洋桔梗小孢子培养技术研究，以期为解决我国洋桔
梗杂交种子生产问题提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。供试洋桔梗材料，来自玉溪市通海县瑞
园园艺有限公司，经鉴定为龙胆科草原龙胆属(Eustoma)植
物洋桔梗(Eustoma grandiflorum)。
1． 1． 2 主要试剂。所用试剂均为遇分析纯，市售。
1． 2 方法
1． 2． 1 小孢子的分离纯化。采集田间健壮植株上的花蕾，
在 4 ℃的冰箱中放置 1 ～2 d，进行抗寒锻炼。取出后用洗涤
液清洗外表面并用流动水冲洗 5 min，在超净工作台上用浓
度 75%乙醇处理 30 s，再用 0． 1% HgCl2 溶液浸泡 10 ～ 15
min，无菌水洗涤3次，每次5 min。沥干水分后，在 B5 培养基
中用玻璃棒碾压花蕾，挤出小孢子。小孢子悬浮液经孔径
300目的尼龙网 1 000 r /min下离心 3 次，时间分别为 15、10
和 5 min，弃上清液，加入MS培养液混合，用移液器取 3． 0 ml
混合液于 MS固体培养基中，25 ℃下暗培养 1 周，转至光照
培养。
1． 2． 2 愈伤组织诱导芽分化的培养。将在光照下培养长出
的愈伤组织转接至含有不同浓度6-BA和 NAA的MS培养基
上进行固体培养，诱导芽分化。温度 25 ℃，光照 2 000 lx，pH
值 5． 8 ～6． 0。
1． 2． 3 生根培养。将上述长出的小苗，转入含有 6-BA、NAA
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(8) :2291 － 2294 责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.08.082
和 IBA的 MS生根培养基上进行培养。采用 5 组处理，处理
1:MS +0． 2 mg /L 6-BA +0． 2 mg /L NAA +0． 3 g /L活性炭;处
理 2:MS +0． 2 mg /L 6-BA +1． 0 mg /L NAA +1． 5 mg /L IBA +
0． 3 g /L 活性炭;处理 3:MS + 0． 05 mg /L NAA + 1． 0 mg /L
IBA +0． 3 g /L 活性炭;处理 4:MS + 1． 0 mg /L 6-BA + 1． 0
mg /L NAA + 1． 0 mg /L IBA + 0． 3 g /L活性炭;处理 5:MS +
0． 5 mg /L 6-BA + 1． 0 mg /L NAA + 1． 0 mg /L IBA + 0． 3 g /L
活性炭，2周后进行生根统计。
1． 2． 4 小孢子再生植株倍性鉴定。取田间生长的“ceremony
orange”植株和小孢子再生植株根尖 1． 0 ～1． 5 cm放入 0． 002
mol /L的 8-羟基喹啉中固定 24 h，用无菌水冲洗 3次，放入卡
诺氏溶液中(无水乙醇∶冰醋酸 = 3∶ 1，V /V)2 h，无菌水冲洗
干净后，在 1 mol /L的 HCl 中浸泡 5 ～ 10 min，无菌水冲洗 3
次，制片，卡宝品红染色，显微镜下检测染色体数目变化。
2 结果与分析
2． 1 不同因素对小孢子胚性愈伤组织诱导率的影响
2． 1． 1 花蕾大小对小孢子胚性愈伤组织诱导率的影响。小
孢子的发育时期是影响小孢子培养的关键因素之一，选择合
适的花粉发育时期可极大地提高植株小孢子胚性愈伤组织
发生的诱导频率。图 1 表明，随着花蕾的长度的增加，胚性
愈伤组织诱导率增加，当花蕾大小在2． 0 ～2． 5 cm时，胚性愈
伤组织诱导率达到最大;当花蕾长度超过 3 cm时，胚性愈伤
组织诱导率降低。因此，当花蕾大小2． 1 ～2． 5 cm时，胚性愈
伤组织诱导率高，达到 76%。对花蕾的小孢子进行检测，证
实此时期正是小孢子单核靠边期。
图 1 花蕾大小对小孢子胚性愈伤组织诱导率的影响
2． 1． 2 低温预处理对小孢子愈伤组织诱导率的影响。低温
预处理是小孢子培养的一个关键，适宜的低温和处理时间可
改善小孢子代谢活动，有利于小孢子适应离体后的培养环
境，促使小孢子正常生长。图 3 表明，不同的低温处理对小
孢子愈伤组织诱导有一定作用，当温度处于 4 ℃，愈伤组织
诱导率最高。随着处理时间的增加，愈伤组织诱导率增加，
当处理时间达到 24 h时，愈伤组织诱导率达到最大，随着时
间的再增加，诱导率降低。因此，最佳的预处理时间和温度
分别为 24 h和 4 ℃。
2． 1． 3 不同水平的生长调节剂激素对小孢子愈伤组织诱导
率的影响。培养基成分对小孢子胚的诱导和形成影响极大，
其中蔗糖浓度、不同植物生长调节物质及添加有机营养成分
至关重要。每个配方重复 5次。由表 1和图 3 可知，培养 20
图 2 低温预处理对小孢子愈伤组织诱导率的影响
d后，MS +3． 0 mg /L KT + 2． 5 mg /L 2． 4-D 诱导的胚性愈伤
组织最多，其诱导率达 75%。MS + 2． 0 mg /L KT + 2． 5 mg /L
2． 4-D诱导的胚性愈伤组织最少，其诱导率为 28%。
表 1 不同水平的植物生长调节剂对小孢子胚性愈伤组织诱导率的
影响
处理
KT
mg /L
2． 4-D
mg /L
愈伤组织
数量∥个
诱导率
%
1 2． 0 2． 0 15 30． 0
2 2． 0 2． 5 14 28． 0
3 2． 0 3． 0 17 34． 0
4 2． 5 2． 5 28 56． 0
5 2． 5 2． 0 22 44． 0
6 2． 5 3． 0 21 42． 0
7 3． 0 2． 0 30 60． 0
8 3． 0 2． 5 39 75． 0
9 3． 0 3． 0 23 46． 0
图 3 洋桔梗小孢子诱导的愈伤组织
表 2 不同水平的植物生长调节剂对芽的诱导
处理
6-BA
mg /L
NAA
mg /L
诱导芽
数量
诱导率
%
1 1． 0 0． 1 13 65
2 1． 0 0． 2 17 85
3 1． 0 0． 5 8 40
4 1． 5 0． 1 5 25
5 1． 5 0． 2 4 20
6 1． 5 0． 5 2 10
7 2． 0 0． 1 1 5
8 2． 0 0． 2 0 0
9 2． 0 0． 5 0 0
2． 2 芽诱导及生根培养
2． 2． 1 不同水平的植物生长调节剂对诱导芽的影响。采用
不同水平的植物生长调节剂诱导愈伤组织出芽，每个处理设
5次重复，每个重复接种 4 个胚性愈伤组织，共 20 个愈伤组
2922 安徽农业科学 2014 年
织。由表 2可知，MS +1． 0 mg /L 6-BA +0． 2 mg /L NAA诱导
芽的效率最好，达到 85%。MS + 2． 0 mg /L 6-BA + 0． 2 mg /L
NAA和 MS +2． 0 mg /L 6-BA +0． 5 mg /L NAA均未出苗。
图 4 愈伤组织诱导芽分化
2． 2． 2 不同水平的植物生长调节剂对植株生根的影响。采
用 5个不同处理，观察不同水平的植物生长调节剂对生根的
影响。结果表明:不添加 IBA或者 6-BA生根率都很低;当 6-
BA的浓度超过 0． 2 mg /L IBA或浓度低于 1． 5 mg /L植株的
生根率都不佳。因此，6-BA 浓度过高、IBA 浓度过低都影响
洋桔梗生根率。选择合适的浓度是植株生根的关键。诱导
植株生根的最佳配方为:MS + 0． 2 mg /L 6-BA + 1． 0 mg /L
NAA +1． 5 mg /L IBA + 0． 3 g /L 活性炭生根率最佳，可达到
80%以上。
图 5 不同浓度培养基对生根的影响
图 6 洋桔梗再生植株
2． 3 染色体数目的比较 对小孢子培育植株及田间四倍体
植株进行染色体数目检测［9］，共检测 10 棵植株，30 条根，观
察 60个细胞。发现小孢子培育植株根尖染色体数均为 36
条，田间四倍体植株根尖染色体数为 72 条。由此说明，试验
进行的小孢子组织培养苗是二倍体。
图 7 二倍体体细胞染色体(2n =2x =36)
图 8 四倍体体细胞染色体(4n =4x =72)
3 结论与讨论
通过花药和小孢子离体培养技术开展植物单倍体育种
工作是现代生物技术育种最有效的手段之一，但在植物花药
组织培养中，很多情况下获得的再生植株中并没有单倍体植
株的存在，花药培养获得的再生植株绝大部分是来自于花药
壁的二倍体细胞，也有可能少量来自单倍性的花粉粒。因
此，单倍体出现的频率很低，甚至没有，因而，不能形成足够
的选择群体，同时也导致再生植株混杂(混倍) ，要从这样的
混杂植株中再挑选出单倍体植株费工费时。从培养过程来
392242卷 8期 王小巧等 洋桔梗小孢子培养初步研究
看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，而小孢子离体
培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特
殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获
得成功［10］。
小孢子培养技术是一种高效、安全的育种新途径，能快
速地从大量群体中获得新的种资源。并且有力地缩短了杂
交育种的年限。另一方面该技术的应用可以为植物的新种
质的创建和新品种的快速选育提供新的思路、途径和
方法［11］。
花蕾中小孢子发育的一致性对胚状体或愈伤组织的再
生有很大影响。不同品种单核靠边期的花蕾发育时期是不
一样的，同一品种生长环境不一致，其单核靠边期的花蕾发
育时期也不一致。试验通过莱卡显微镜镜检发现，采集的洋
桔梗“ceremony orange”花蕾在 2． 0 ～2． 5 cm时处在单核靠边
期，处在该时期的花蕾胚性愈伤组织诱导率高达到 76%;再
生植株诱导率 100%。与其他小孢子培养不同的是胚性愈伤
组织诱导并非采用 NLN-13 液体培养基，而是采用 MS 固液
培养，一方面胚性愈伤组织诱导率相对液体培养提高很多，
另一方面可以大大降低污染率。组织培养过程中愈伤组织
易出现褐化以及活力不足，但在培养基中加入 0． 1 g /L的活
性炭并且及时的更换新鲜培养基可以有效的减轻褐化现象。
对于再生植株根尖染色体的鉴定，根尖在 9 点前取要比在其
他时间取得根尖效果好，能够较清楚的看清染色体的条数。
随着小孢子培养条件的不断改善 和培养技术的进一步改
进。小孢子培养技术和单倍体育种手段将在草原龙胆属作
物的育种领域中发挥出更大的作用。
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－375．
( 上接第 2253页)
单产超12 000． 0 kg /hm3 的实绩，2012 ～ 2013 年在安徽舒城
千人桥超级稻示范方采用50 cm宽行配20 cm窄行获得平均
单产 13 411． 5 kg /hm2(其中最高田块单产达 14 388． 0
kg /hm2)的实绩。可见，宽行是超大穗型超级稻超高产栽培
的一项关键技术措施。该研究在试验和示范验证基础上提
出的超级稻 33 cm的行距，目前平盘毯苗插秧机上尚未有这
种设置(我国 2010年引进的钵育苗机摆栽的行距设置为 33
cm) ，该研究结果可为插秧机行距调整提供农艺学依据。目
前笔者所在项目组的农机研究小组正在试制行距可调高速
插秧机，并据此研制了新机型正待生产验证。
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