全 文 ：收稿日期: 2005-09-06
修回日期: 2005-11-15
作者简介:代文娟 ( 1981-) ,女 ,贵州黔西县人 ,硕士研究生 ,主要从事
植物保护生物学研究。
* 国家自然科学基金 ( 30260013)资助项目。
* * 通讯作者。
广西科学 Guangxi Sciences 2006, 13( 2): 151～ 155
叶绿体微卫星分析濒危植物资源冷杉的遗传多样性*
Study on Genetic Diversity of the Endangered Plant Abies
ziyuanensis by Using Chloroplast SSR Marker
代文娟1 ,唐绍清1* * ,刘燕华2
DAI Wen-juan
1
, TANG Shao-qing
1* *
, L IU Yan-hua
2
( 1.广西师范大学生命科学学院 ,广西桂林　 541004; 2.广西师范大学附属中学 ,广西桂林　
541004)
( 1. The Colleg e of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin, Guangxi , 541004, China; 2. The
High School Af filiated to Guangxi Normal Univ ersity , Guilin, Guangxi, 541004, China)
摘要:用叶绿体微卫星 ( cpSSR)分子标记研究资源冷杉 (Abies ziyuanensis)的遗传变异。资源冷杉分别取样于广
西资源县和湖南城步县交界的银竹老山 、湖南东安和新宁交界处的舜黄山、湖南炎陵县大院的 7个居群。样品采
用 CT AB法进行总 DN A的提取 ,用 6对 cpSSR引物进行扩增 ,扩增产物经 95℃变性后在 6%的变性聚丙烯酰胺
凝胶上进行电泳 ,然后应用 POPGEN Ver sion 1. 31软件计算资源冷杉各个居群的 Nei s基因多样性指数 ( He) ,
Shannon信息多样性指数 ( I ) ,基因分化系数 (Gst )以及 Nei s遗传距离。用 N TSYSpc Version 2. 10软件进行
UPGM A聚类分析 ,并对地理距离和遗传距离相关性进行 Mental检验。用 ARLEQUIN2. 000软件分析地区间、
居群间和居群内的遗传变异 ,统计有效单型模式数量。结果 6对 cpSSR引物中选出 3对多态性引物 ,共扩增出 7个
位点。Nei s基因多样度 He为 0. 2922,信息多样性指数 I为 0. 4428,基因分化系数 Gst为 0. 5805。资源冷杉的遗传
分化主要存在于居群间 ,分布在银竹老山和舜黄山的资源冷杉与分布在大院的资源冷杉之间产生了明显的遗传
分化 ,两地资源冷杉之间的遗传变异占总的 68. 87%。
关键词:资源冷杉　遗传变异　叶绿体 SSR
中图法分类号: Q16　　文献标识码: A　　文章编号: 1005-9164( 2006) 02-0151-05
Abstract: The genetic v ariation of Abies ziyuanensis was studied by using chloroplast simple-sequence
repeats ( cpSSR) markers. The individuals of sev en populations of A. ziyuanensis were sampled f rom
Yinzhulaoshan of Guangxi, Shunhuangshan of Hunan and Dayuan of Hunan. Total g enomic DN A
was ex t racted using CT AB protocol. The amplification reaction w as perfo rmed w ith six pai r
primers, and the fragments w ere denaturalized wi th 95℃ before being loaded and run on a 6%
denaturing polyacrylamide gel. The Nei s gene div ersi ty ( He) , Shannon information index ( I ) , the
coef ficient gene dif ferentiation (Gst ) and Nei s g enetic distance w ere computed by POPGEN Versin
1. 31. UPGM A deng rog ram was constructed by N TSYSpc Version 2. 10. The correlations between
genetic distance and geographical distance were investigated using a Mantel test. Analy sis of
molecular variance w as conducted to calculate variance components fo r variation betw een tw o
regions, among populations, and within populations using ARLEQUIN version 2. 000. Haplotypes
w ere analy zed using this sof tw are. Seven loci w ere amplified by three pair primers screened from six
pair primers. Nei s gene div ersity ( He) was 0. 2922, Shannon information index ( I ) w as 0. 4428
and the coefficient g ene differentiation (Gst ) was 0. 5805. Genetic v ariation of Abies ziyuanensis were
mainly existed among populations. High level of g enetic differentiation was detected betw een the
populations in Yinzhulaoshan and Shunhuang shan and in Dayuan, and the genetic v ariation between
the two regions totally accounted for 68. 87% .
Key words: Abies ziyuanensis , genetic variation,
cpSSR
　　资源冷杉 ( Abies ziyuanensis )是松科冷杉属植
物 ,被列于《中国植物红皮书》中 [1 ] ,在 1998年 ICUN
拟订的“针叶树行动计划”中被列为全球重点保护的
针叶树种 ,是国家一级保护植物 [2 ]。资源冷杉分布于
151广西科学　 2006年 5月　第 13卷第 2期
DOI : 10. 13656 /j . cnki . gxkx . 2006. 02. 020
广西与湖南交界的银竹老山 ,湖南舜黄山 ,湖南炎陵
县大院林场及江西井冈山 [ 3～ 5]。据文献记载 ,大院林
场曾有超过 1000株的资源冷杉 [6 ] ,银竹老山的数目在
百株以上 ,湖南舜黄山的数量较少 [3 ] ,井冈山的数量
则只有 4株 [5 ]。但是 ,现在的调查与记载有较大差异 ,
资源冷杉总共不到 600株 ,其中 ,大院林场的资源冷杉
数目在 450株左右 ,银竹老山不足 50株 ,舜黄山约 20
株 [7 ]。其分布呈斑点状或小块状 ,地域狭窄 ,数量少 ,
已成高度濒危状态 [2 ]。
　　对资源冷杉在木材解剖 [8 ]、地理成因 [ 2] ,种群保
育 [7 ]等方面的研究已有报道。苏何玲等 [9 ]应用 RAPD
分子标记分析了资源冷杉的遗传多样性。叶绿体微卫
星 ( cpSSR)是近年发展起来的一种新型分子标记。
cpSSR能显示高水平的种内多样性 ,可以用这一特性
来了解进化群体生物学、群体迁移模式、群体历史和
群体分化水平 [10 ] ,此外 ,还可以用于群体间单型模式
的变异分布 ,有助于对物种进化历史的理解并据此制
定出群体保存策略 [ 11]。由于 cpSSR兼具 SSR及叶绿
体 DNA的优点 ,近年来被应用于多种植物居
群 [12, 13 ] ,包括冷杉属 [14, 15 ]的遗传分析及系统发育分
析研究中。本研究以资源冷杉 7个居群为对象 ,用
cpSSR标记对其进行遗传变异研究。
1　材料和方法
1. 1　材料
　　根据资源冷杉的地理分布情况 ,分别在广西资源
县和湖南城步县交界的银竹老山、湖南东安和新宁交
界处的舜黄山、湖南炎陵县大院林场取样。共取了 7个
居群 ,各居群的代号、地理位置及取样个体数见表 1。
居群内个体间取样间隔尽可能远。采集资源冷杉的枝
叶 ,插入水中迅速带回实验室。将新鲜叶子洗净风干
后装入封口袋中于 - 70℃保存备用。
1. 2　 DNA提取
　　采用 CT AB法 [16 ]进行总 DNA提取 ,提取前在水
浴前用丙酮洗 2次。
1. 3　引物选取及 PCR反应条件及检测
　　参照文献 [17]用 6对 cpSSR引物进行扩增 ,引物
由上海生工合成 ,引物序列见表 2。
　　 PCR在 UNOП Thermoblock上进行 ,反应体系
参照文献 [ 18 ] ,并对 Mg2+ 浓度作适当调整。每个
cpSSR反应为每管 25μl,其中包括 1× PCR buffer,
0. 2μmol /L dN TPs, 1. 5μmol/L Mg2+ , 0. 2μmol /L引
物 , 1U Taq酶 (大连 , TaKaRa ) , 25～ 50ng 的模板
DNA。 PCR扩增程序: 95℃预变性 5min,加 Taq酶
85℃反应 5min,接着进行 25个循环: 94℃变性 1min,
55℃退火 1min, 72℃延伸 1min,循环结束后 72℃延伸
8min。
表 1　 7个取样居群的代码、地理位置、海拔及采样数
Table 1　 Location, altitude and sample size ( number of
individual s) of seven Abies ziyuanensis populations
居群
Population
地理位置
Location
海拔高度
Alti tud e
( m)
采样数
Sample size
(个 )
DA 湖南东安和新宁交界舜黄山
Shunhuangsh an, Dong An and
Xinning, Hunan
N 26°22. 414′, E 111°00. 553′
1701 19
YS 广西资源银竹老山圣堡塘
Shengbaotang, Yinzh ulaoshan ,
Ziyuan, Guangxi
N 26°15. 292′, E 110°33. 295′
1811 20
YH 广西资源银竹老山三角湖塘
Sanjiaoh utang, Yinzh ulaoshan ,
Ziyuan, Guangxi
N 26°15. 929′, E 110°33. 294′
1781 15
DM 湖南炎陵大院林场绵阳龙
Mianyanglong, Dayuan,
Yanling, Hunan
N 26°24. 470′, E 114°01. 756′
1470 21
DZ 湖南炎陵大院林场中牛石
Zhongniushi, Dayuan,
Yanling, Hunan
N26°25. 858′, E 114°02. 768′
1470 21
DX 湖南炎陵大院林场香菇棚
Xianggupeng, Dayuan,
Yanling, Hunan
N 26°26. 221′, E 114°03. 139′
1470 22
DJ 湖南炎陵大院林场鸡麻捷
Jimajie, Dayuan, Yanling,
Hunan
N 26°26. 328′, E 114°04. 017′
1470 21
表 2　 cpSSR引物号及序列
Table 2　 Primer code and sequence of cpSSR
引物号
Primer
code
序列 ( 5′-3′)
Sequence ( 5′-3′)
位点数
No. of loci
Pt63718
CAC AAA AGG AT T TT T T TT CAG T G
CGA CGT GAG T AA GAA TGG TTG
6
Pt30204
TCA TAG CGG AA GAT CCT CTT T
CGG AT T GA T CCT AAC CAT ACC
6
Pt71936
T TC AT T GGA AAT ACA CT A GCC C
AAA ACC GT A CAT GAG AT T CCC
7
Pt109567
T AT TAT CGA ACA ACG AGA ATA ATC C
TCA CTG TCA CTC TAC AAA ACC G
2
Pt15169
CT T GGA TGG AAT AGC AGC C
GGA AGG GCA T TA AGG TCA TT A
1
Pt110048
T AA GGG GAC T AG AGC AGG CTA
T TC GAT ATT GAA CCT TGG ACA
2
　　扩增产物经 95℃变性后在 6%的变性聚丙烯酰胺
凝胶上 ,于 75W恒功率电泳 1. 5h ,电泳后用银染的方
法进行染色 ,银染参照许绍斌等 [19 ]的方法并做适当
改进 ,即将胶剥离后 ,加入已经加热至 55℃的染色液
( 0. 6g AgNO3 , 600ml蒸馏水 ) ,摇床轻摇 10min;自来
水漂洗 2次 ;然后加入加热至 55℃的显色液 ( 0. 24g无
152 Guangxi Sciences, Vol. 13 No. 2, May 2006
水碳酸钠 , 0. 35g碳酸氢钠 , 12g氢氧化钠 , 2. 4ml甲
醛 ) ,轻摇 2～ 3min至条带清晰 ,然后漂洗 1次 ,用扫描
仪进行图像保存。
1. 4　数据统计与分析
　　在电泳图谱中同一位置的条带视为一个位点 ,按
凝胶上同一位置上条带的有无进行统计 ,有带的记为
1,无带的记为 0。应用 POPGEN Version 1. 31软件
( M olecular Biolog y and Biotechnology Centre,
Univ ersity of Alberta, Edmonton, Canada)计算资源冷
杉各个居群的等位基因观察数 ( A = ∑ Ai /n, Ai代
表第 i个位点上的等位基因数 ,n代表所测定的位点
的总数 ) ,有效等位基因数 ( Ae = ∑ ( 1 /∑ qi2 ) /n, qi
代表第 i个基因的频率 ,n为所测定的位点的总数 ) ,
等位基因频率 , Nei s基因多样性指数 ( He = ∑ ( 1
- ∑ qi 2 ) /n,qi代表第 i种纯合基因型的频率 ,n代表
所测定的位点总数 ) [20 ] , Shannon信息多样性指数
( I ) ,多态位点百分数 ( PPL ) ,基因分化系数 (Gst )以
及 Nei s遗传距离 [21 ]。用 N TSYSpc Version 2. 10
( Setauket, New York, USA) ,根据居群间的 Nei s遗
传距离 [21 ] ,对资源冷杉居群进行 U PGMA聚类分析 ,
并对地理距离和遗传距离相关性进行 Mental检
验 [22 ]。用 ARLEQUIN2. 000软 件 ( Genetics and
Biometry Laboratory, Univ ersity of Geneva, Geneva)
分析地区间 ,居群间和居群内的遗传变异 ,统计有效
单型模式数量 (ne = 1 /∑ Pi 2 , Pi代表第 i种单倍型
的频率 ) [23, 24 ]。
2　结果与分析
2. 1　资源冷杉的遗传多样性
　　 6对叶绿体 SSR引物中的 3对 ( pt63718, pt30204,
pt71936)扩增得到的位点有多态性 ,这 3对引物在 139
个样品中共扩增出 7个位点 , pt63718扩增出 2个位点 ,
pt30204扩增出 2个位点 , pt71936扩增出 3个位点。7个
位点均为多态位点。组合成 18种不同的单倍型。居群
的多态位点百分率为 0～ 85. 71% ,较高的是舜黄山居
群 ( DA)和银竹老山三角湖塘居群 ( YH) (均为
85. 71% ) ,无多态性的是香菇棚居群 ( DX)和鸡麻捷
居群 ( DJ) ,详见表 3。
　　在种的水平上 ,资源冷杉的 Nei s基因多样性指
数为 0. 2922, Shannon s信息多样性指数为 0. 4428
(表 3)。居群 Nei s的基因多样性指数在 0～ 0. 3254之
间 ,最高的是舜黄山居群 ( DA) ( 0. 3254) ,最低的是香
菇 棚居群 ( DX )和鸡麻 捷居群 ( DJ) ( 0. 000 ) ;
Shannon s信息多样性指数在 0～ 0. 4835之间 ,最高
的是舜黄山居群 ( 0. 4835) ,最低的是香菇棚居群和鸡
麻捷居群 ( 0. 0000) (表 3)。居群的等位基因观察数
( A) 平均值为 1. 4286,有效等位基因数 ( Ae) 为
1. 2096(表 4)。各个位点的等位基因频率见表 5。
2. 2　资源冷杉的遗传分化
　　 AMOVA分析结果 (表 6)表明 ,两两居群间的遗
传分化 (Hst ) 在 0. 0000～ 0. 9172之间 ,平均值为
0. 4876。银竹老山 ( YS)和大院香菇棚居群 ( DX)的遗
传分化程度最高 (Hst = 0. 9172, P < 0. 001) ;而大院
中牛石居群 ( DZ)和鸡麻捷居群 ( DE) ,香菇棚居群
( DX)和鸡麻捷居群 ( DJ)的叶绿体 SSR没有差异
(Hst = 0. 0000, P < 0. 001)。对资源冷杉居群的地理
距离和遗传距离进行了 Mental检验的结果表明 ,地
理距离和遗传距离呈显著性相关 ( r = 0. 8848, P =
0. 001)。
　　 POPGEN软件分析表明 , 7个居群总的基因多样
度为 0. 3060,其中居群内的基因多样性为 0. 1283,居
群间的基因多样度为 0. 1777。基因分化系数为
0. 5805,居群间的遗传变异占总的遗传变异的
58. 05% ,说明遗传变异主要存在于居群间。居群间基
因流 ( Nm )为 0. 3613, Nm小于 1,说明居群间基因交
流有限。将分布在银竹老山和舜黄山的 3个资源冷杉
居群作为一组 ,分布在大院的 4个居群作为一组 ,进行
AMOVA分析 ,组间的遗传变异占总遗传变异的
68. 87% ,组内居群间的遗传变异占 6. 88% ,居群内的
遗传变异占 24. 25% 。
表 3　资源冷杉 7个居群的遗传变异
Tabl e 3　 Genetic var iation of the seven popul ations of Abies ziyuanensis
居群
Population
总位点数
Total no. of loci
多态位点数
No. of polymorphic loci
PPL
(% )
He I
DA 6 6 85. 71 0. 3254( 0. 1655) 0. 4835( 0. 2321)
YS 6 4 57. 14 0. 0966( 0. 1544) 0. 1638( 0. 2226)
Y H 7 6 85. 71 0. 2591( 0. 1695) 0. 4033( 0. 2323)
DM 5 4 57. 14 0. 2099( 0. 2082) 0. 3146( 0. 3039)
DZ 4 1 14. 29 0. 0067( 0. 0178) 0. 0162( 0. 0429)
DX 3 0 0. 00 0. 0000( 0. 0000) 0. 0000( 0. 0000)
DJ 3 0 0. 00 0. 0000( 0. 0000) 0. 0000( 0. 0000)
总计 Total 7 7 100 0. 2922( 0. 1962) 0. 4428( 0. 2484)
括号中数值为标准差 Standard deviations in parenthesis.
153广西科学　 2006年 5月　第 13卷第 2期
表 4　资源冷杉 7个居群间的等位基因观察数 A,有效等位基
因数 (Ae )和单型模式的种类
Tabl e 4　Observed number of al leles(A ) , Ef fective number of
al leles(Ae ) and Effective number of hapl otypes among the
seven popul ations of Abies ziyuanensis
居群
Population
等位基因观察数 A
Observ ed num ber
of alleles
A
有效等位基因数 Ae
Effective
num ber of
alleles Ae
单型模式的种类
Ef fective
number of
haplotypes
DA 1. 8571 1. 5489 8
YS 1. 5714 1. 1471 4
Y H 1. 8571 1. 4145 7
DM 1. 5714 1. 3497 4
DZ 1. 1429 1. 0071 2
DX 1. 0000 1. 0000 1
DJ 1. 0000 1. 0000 1
平均值 Av erage 1. 4286 1. 2096 2. 5
表 5　资源冷杉 7个位点的等位基因频率
Table 5　 Frequency of alleles of the seven loci of Abies
ziyuanensis
等位基因
Allele
等位基因频率
Frequency of alleles
等位基因 1
Alleles 1
等位基因 2
Alleles 2
pt63718-a 0. 9658 0. 0342
pt63718-b 0. 0314 0. 9686
pt30204-a 0. 4037 0. 5963
pt30204-b 0. 7519 0. 2481
pt7193-a 0. 9263 0. 0737
pt7193-b 0. 6652 0. 3348
pt71936-c 0. 4064 0. 5936
表 6　资源冷杉 7个居群间的地理位置 ( km,对角线上方 )和遗传分化 (Υst ,对角线下方 )
Tabl e 6　 Geographic distance ( km, above diagonal ) and Nei s genetic dif f erentiation (Υst , below diagonal ) among the seven
popul ations of Abies ziyuanensis
居群
Population
DA YS YH DM DZ DX DJ
DA 　　 0. 0000 　　 47. 2 　　 46. 8 　　 300. 8 　　 302. 5 　　 303. 1 　　 304. 6
YS 0. 2311* * * 0. 0000 1. 2 346. 6 348. 4 349. 1 350. 5
Y H 0. 1150* * * 0. 2785* * * 0. 0000 346. 5 348. 3 349. 0 350. 4
DM 0. 3937* * * 0. 6322* * * 0. 5336* * * 0. 0000 3. 1 3. 9 5. 1
DZ 0. 6513* * * 0. 9016* * * 0. 8070* * * 0. 2688* * * 0. 0000 0. 9 2. 2
DX 0. 6720* * * 0. 9172* * * 0. 8267* * * 0. 3063* * * 0. 0023* * * 0. 0000 1. 4
DJ 0. 6660* * * 0. 9152* * * 0. 8244* * * 0. 3000* * * 0. 0000* * * 0. 0000* * * 0. 0000
* * * P < 0. 001。
2. 3　聚类分析
　　 UPGM A聚类分析结果 (图 1)表明 ,资源的两个
居群和舜黄山居群聚成一支 ,大院的 4个居群聚成一
支 ,两分布地彼此明显地区分开来。这进一步表明资
源冷杉居群间和分布地产生了较大的遗传分化。
　　图 1　基于 Nei s遗传距离构建的资源冷杉 7个居群
UPGM A聚类图
　　 Fig . 1　 UPGMA dendrog ram of seven populations of
Abies ziyuanensis based on Nei s unbiased measures of genetic
distance
3　讨论
　　叶绿体 SSR作为一种新型分子标记 ,在植物群
体遗传结构分析和系统演化分析中潜能较大 [12 ]。本
研究中扩增得到的 cpSSR带型清晰 ,遗传分化系数
平均值为 0. 4876,说明 cpSSR分子标记是适合研究
资源冷杉遗传变异的方法。
　　资源冷杉的叶绿体 SSR分析结果表明 ,资源冷
杉居群遗传变异主要存在于居群间 (Gst = 0. 5805) ,
分布在银竹老山和舜黄山的资源冷杉与分布在大院
的资源冷杉之间产生了明显的遗传分化 ,两地资源冷
杉之间的遗传变异占总的 68. 87%。聚类分析结果表
明 ,分布在东安、资源的居群与大院的 4个居群各聚成
一分支。这与 RAPD的分析结果 [9 ]相似。冷杉植物的
生长对温度有着严格的要求 ,第四纪冰期的气候变化
尤其是末次盛冰期对世界现代冷杉属植物的分布格
局的形成起着决定的作用。冰期过后 ,形成了我国资
源冷杉孤立、残遗分布于各局部地区高海拔地段的现
代分布式样 [2 ]。呈孤岛状分布的资源冷杉居群 ,其两
154 Guangxi Sciences, Vol. 13 No. 2, May 2006
间断分布地 (银竹老山和舜黄山 ,大院 )的地理距离在
300km以上 ,较长时间的地理隔离阻碍了它们之间
的基因交流。居群间的基因流较低 (Nm = 0. 3613)。
而 Nm < 1, 则遗传漂变可以导致居群间明显的遗传
分化 [25 ]。
　　目前分布有的资源冷杉总共不到 600株 [7 ] ,其分
布呈斑点状或小块状 ,地域狭窄 ,数量少 ,其灭绝的可
能性极大 ,已成高度濒危状态。根据现在研究结果 ,分
布在银竹老山和舜黄山的资源冷杉与分布在大院的
资源冷杉之间产生了较明显的遗传分化 ,在开展保护
工作时要同时重视两分布地的保护工作。
　　致谢
　　本研究在采样时得到湖南东安县舜黄山公园管
理局和资源县银竹老山自然保护区的大力协助 ,在此
表示衷心感谢!
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(责任编辑:邓大玉 )　　
155广西科学　 2006年 5月　第 13卷第 2期