全 文 ：图 3　糯米芽全草粉末图
1.淀粉粒　2.导管　3.纤维　4. 木栓细胞碎片　5. 木薄
壁细胞碎片　6.棕色细胞　7.棕色块状物
μm ,胞腔狭窄 。导管主要为网纹导管 ,直径 20 ～ 80
μm;可见少数具缘纹孔导管 ,环纹和螺纹导管极少
见 。有较多棕色细胞 ,圆形 、椭圆形 ,直径 13 ～ 26
μm。可见棕黄色木栓细胞碎片。木薄壁细胞纹孔
明显 。偶见石细胞 ,棕色团块散在 ,形状不规则 ,大
小不等。 (图 3)
3　小结
通过对荨麻科糯米团属植物糯米芽的性状及显
微特征的鉴定 ,观察到糯米芽茎横切面中 ,皮层内侧
环状排列的非木化厚壁细胞特征明显 ,导管呈辐射
状排列 ,全草粉末中有淀粉粒 、棕色细胞 、木薄壁细
胞 、木栓细胞碎片 ,以上特征可作为鉴定糯米芽药材
的重要依据 ,为糯米芽的进一步开发利用打下基础。
参 考 文 献
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(2006 - 10 -08收稿)
基金项目:国家自然科学基金项目(30470193)作者简介:李娟 ,女 , 2004级在读硕士。*通讯作者:陈科力 , E-m ai l:kelichen@ 126. com , Tel:027-62326589。
8种卷柏属药用植物的 RAPD分析
李　娟 ,万定荣 ,陈科力*
(湖北中医学院药学系 ,湖北武汉 430061)
　　摘要　目的:用分子标记技术鉴别 8种卷柏属药用植物并进行亲缘关系分析。方法:从 60个随机引物中筛选
出 8个引物 , 采用随机引物扩增多态 DNA(RAPD)技术 ,对 8种卷柏属植物的 17份样品的 DNA提取物进行扩增和
分析。结果:共扩增出 58个位点 ,获得清晰的 RAPD图谱 , 建立了 8种卷柏属植物类群亲缘关系的树系结构图。结
论:该方法显示了 8种卷柏属植物之间明显的种间差异 ,以及同一种植物在不同产地产生的变异 , 能为这些植物种
以及种下的分类鉴定提供遗传学依据。
关键词　卷柏;RAPD分析;分类鉴定;亲缘关系
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)04-0403-04
RAPD Analysis of8Med icinal Spec ies ofSelag inella
L I Juan, WAN Ding-rong, CHEN Ke-li
(Departim en t o f Pha rm acy, H ubei Co llege of T raditiona l ChineseM edic ine, W uhan 430061, China)
Abstrac t　Objective:To iden tify 8 m edicina l species o fSe lag inella w ith m e thod of mo lecu la rm arker and to explore the ir genetic
re lationship. M ethods:8 prim ers w ere se lec ted from 60 random prime rs to amp lify the to tal DNA extracts o f 17 sam ples w ith RAPD
m ethod and then the am plified w ere ana lyzed. Resu lts:A to tal of am plified 58 bands and RAPD m ap w ere ob ta ined. Based on them ,
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DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牱牣牥牬牣牥牨牨
a Jaccards genetic sim ilarity m a trix and a dendrog ram fo r the 8 plan ts w ere estab lished using SPSS 11. 5 softw are. Conc lusion:The
m ethod revealed distinct differences o f d iffe rent species and the va riation o f the sam e species of Selaginella from differen t habitats. I t
can providew ith genetic proo f fo r au then tication of som e species and un its below spec ie s.
K ey words　S elag inella;RAPD;C lassification;Gene tic re la tionsh ip
　　卷柏属 (Selaginella)植物属于蕨类植物门石松
纲卷柏科 ,为多年生草本植物 ,在全世界共有 700多
种 ,我国分布约有 60-70余种〔1〕 ,其中有 22种具有
药用价值〔2〕。现代药理研究表明:卷柏属药用植物
不仅具有传统的清热解毒作用 ,还具有抗肿瘤 、降血
糖 、抗病毒 、止血 、免疫调节等多种功能 〔3〕。由于该
属某些植物的形态较为类似 ,鉴别时容易引起混淆 。
近年来分子标记技术被引入中药鉴定研究 ,以与形
态组织学和化学分析方法得到的结果进行验证 。其
中 RAPD分析是一种有效的 DNA分子标记方法 ,对
亲缘关系分析有良好效果〔4 ～ 7〕。因此 ,本文在用形
态 、组织和化学方法进行鉴定研究的基础上 〔8、 9〕 ,对
8种卷柏属药用植物进行分子标记研究 ,探索彼此
间的亲缘关系和遗传距离 ,了解其变异程度 ,为卷柏
属药用植物的鉴定和资源合理开发提供参考依据。
1 　材料与试剂
1.1 　材料　实验材料样品的采集地点和时间见表
1,每份样品采集 6 ～ 10株植物的新鲜叶片 ,用硅胶
快速干燥保存。样品的植物学名由万定荣教授鉴
定 ,采集的标本留存于湖北中医学院标本室〔8、9〕。
1.2 　仪器和试剂　仪器:TGL-16G型高速离心机
(上海安亭科学仪器厂 ):DYY-6B型电泳仪 (北京市
六一仪器厂 ):GENEAMP 5700PCR扩增仪 (AP-
PLIED B IOSYSTEM S, 美国 );MG IAS-1000D多媒体
凝胶成像分析系统。试剂:琼脂糖 (Promega公司);
SYBR-G reenl(达科为生物技术有限公司 );随机扩
增引物 、 Taq DNA聚合酶 、 dNTPs、M arker(100bp-
3000bp)、CTAB(上海 Sangon公司 );Tris(Amres-
co)。
2 　方法和结果
2.1 　DNA模版的提取 (参考文献 〔4〕)　取干叶片
约 50 mg,置 1.5m lEp管中 ,加入液氮研碎 ,立即加
入 500 μl预热至 56℃的 2 ×CTAB提取缓冲液
[ CTAB2%, Tris-HC l(pH8.0)100 mmo l /L, EDTA 20
mmo l /L, N aC l 1.4mo l /L,巯基乙醇 2%]及巯基乙醇
20 μl混匀 , 56℃水浴保温 30 m in,其间轻微翻动浮
板三次;加入等体积的氯仿-异戊醇 (24∶1)抽提 ,轻
轻颠倒混匀 , 12000 r /m in离心 10m in,吸取上清液 ,
加入 0.1倍的 10%CTAB溶液 ,室温下放置 10 m in,
再用氯仿-异戊醇(24∶1)抽提一次;取上清液加入等
体积的 1 ×CTAB沉淀缓冲液 [ CTAB1%, Tris-HC l
(pH8.0)50 mmol /L, EDTA 10 mmo l /L, 巯基乙醇
1%] ,室温下放置 3 h;12000 r /m in离心 30 m in,小
心去掉上清液 ,分别用 65%乙醇和 85%乙醇各洗涤
2次 ,然后于 60℃烘箱中干燥 30m in。加入 TE缓冲
液溶解 DNA ,存于 -20℃冰箱备用 。
　表 1 　样品来源与采集时间 、地点
样品编号 样品名称 样品来源
1　 异穗卷柏ⅠS. heterostachys Bak. 2004年 8月采自湖北宜昌车溪
2　 异穗卷柏ⅡS. heterostachys Bak. 2005年 8月采自湖北鹤峰 (孢子叶尚未长出)
3　 异穗卷柏ⅢS.heterostachys Bak. 2005年 8月采自湖北鹤峰(有孢子叶)
4　 异穗卷柏ⅣS. heterostachys Bak. 2005年 8月采自湖北宜昌雾渡河
5　 异穗卷柏ⅤS. heterostachys Bak. 2005年 8月采自湖北宜昌雾渡河 (仅有孢子叶)
6　 翠云草ⅠS. uncinata(Desv.)Spring 2004年 8月采自湖北宜昌(阴湿环境)
7　 翠云草ⅡS. uncinata(Desv.)Spring 2005年 8月采自湖北宜昌车溪(向阳环境)
8　 小翠云S. kraussiana A. B ram 2005年 9月采自广东广州
9　 伏地卷柏S. nipponica F ranch. et Sav. 2004年 8月采自湖北宜昌
10　 疏叶卷柏ⅠS. remotifolia Spring 2005年 8月采自湖北鹤峰
11　 疏叶卷柏ⅡS. remotifolia Spring 2005年 8月采自湖北鹤峰
12　 疏叶卷柏ⅢS. remotifolia Spring 2005年 8月采自湖北恩施猫耳洞
13　 疏叶卷柏ⅣS. remotifolia Spring 2005年 8月采自湖北宜昌车溪
14　 薄叶卷柏ⅠS. de licatula(Desv.)A lston 2005年 8月采自湖北鹤峰(变异类型)
15 薄叶卷柏Ⅱ
S. de licatula(Desv.)A lston 2005年 8月采自湖北恩施猫耳洞
16　 江南卷柏S. moellendorfiiH ie ron 2005年 8月采自湖北宜昌雾渡河
17 细叶卷柏
S. labordeiH ie ron. ex Christ 2004年 7月采自江西庐山
2.2　RAPD扩增反应　反应体系:总体积为 25μl,
其中 10×PCR buffe r 2.5 μl, Mg2+(20 mmol /L)1.9
μl,引物 (20 μmol /μL)1 μl, dNTP(10 mmo l /L)0.5
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μl, Taq酶(5U /μl)0.3 μl, DNA模板 (50 ng /μl)0.5
μl, ddH2O18.3 μl。
扩增程序:94℃预变性 5 m in, 94℃变性 45s,
36℃退火 1m in, 72℃延伸 1.5 m in, 40个循环 , 72℃
后延伸 5 m in。扩增产物加入 1%的荧光染料
SYBER-G reen l于 2%琼脂糖凝胶上用 1×TAE缓冲
液电泳 ,在凝胶成像分析系统上观察并拍照。
2.3 　引物的筛选　从 60个 10 bp随机引物中 ,筛
选出扩增性强 、重复性好 、多态性明显的 8个引物 ,
用于全部卷柏属样品基因组 DNA的扩增 。所用引
物序列见表 2。图 1、 2为卷柏样品的两个扩增图
谱。
　表 2 　RAPD分析所用引物序列及扩增结果
引物名称 序列 检测的位点数
S45 TGAGCGGACA 5
S83 GAGCCCTCCA 7
S266 AGGCCCGATG 10
S2006 GGACGACCGT 8
S2020 GAGCGCTACC 7
S2033 CTTCGGTGTG 11
S2044 CCACGTGCCA 5
S2049 GTCATGCGAC 5
图 1　引物 45的扩增产物(样品编号从左到右为 1～ 17,M)
图 2　引物 2033的扩增产物(样品编号从左到右为 1 ～ 17, M)
图 3　8种 17份卷柏样品的 RAPD聚类分析
2.4 　数据处理　对每一个样品根据在凝胶上同一
位置所扩增的 DNA条带的有或无分别标记为 1或
0(条带存在为 1,条带不存在为 0),在相同条件下 ,
迁移相同的条带视为同源位点 ,统计的二元数据用
SPSS11.5分析软件中的 Jaccard方法〔6〕计算样品间
的相似系数 , 用 W ithing roups linkage聚类方法分
析〔5〕 ,得到各样品的亲缘关系树系图 (图 3)。
8个引物共扩增出 58个条带 ,见表 2,扩增产物
多集中在 100 ～ 1500 bp。
3　讨论
3.1　总 DNA提取方法　在提取总 DNA时 ,比较
了文献介绍的 CTAB法与高盐低 pH 值法 , 发现
CTAB法对新鲜样品的提取效果优于高盐低 pH值
法。最终选择了改良 CTAB法 ,操作简便 ,易于提
取 ,扩增条带较清晰 。在提取时 ,抽提液一般使用苯
酚-氯仿-异戊醇 (25∶24∶1),但实验中发现不用酚也
能完全达到要求 ,含有酚的话反而会因其残留问题
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影响后面的实验过程 ,故抽提液选择为氯仿-异戊醇
(24∶1)。
3.2 　不同种间遗传距离分析　聚类分析表明:8
种卷柏属植物有较明显的分界 ,其中薄叶卷柏与疏
叶卷柏 ,伏地卷柏与异穗卷柏 ,小翠云与翠云草两两
之间的遗传关系较近 ,分别聚为一类 ,这些分析结果
具有一定合理性 ,其中最明显的是小翠云与翠云草
样品的空间距离虽然最远 ,但分析表明遗传距离很
近 ,聚为一类 ,与实际情况和传统分类方法完全一
致 。细叶卷柏 、江南卷柏与薄叶卷柏分别是三种具
有显著疗效的药用植物 ,它们的形态极为相似而易
于混淆 。其中 ,细叶卷柏多生于高海拔地区 ,江南卷
柏生于一般丘陵山坡 ,而薄叶卷柏多生于丘陵河谷
或潮湿地区 。分析结果表明 ,这三个种分别为较独
立的类群 ,它们之间既具有显著的遗传差异 ,但遗传
距离又比较接近 ,与实际情况相符。
3.3 　同种及种下样品的 RAPD分析　从实验结果
及聚类分析图可发现 ,相同产地的同一种样品的
RAPD图谱基本一致。同一产地 (鹤峰卷柏 , 10、11
号样品 )的疏叶卷柏首先聚类 ,然后与恩施产疏叶
卷柏(12号样品 )聚类 ,再与产地相对较远的宜昌产
疏叶卷柏(13号样品 )汇聚 ,说明疏叶卷柏样品的地
理分布越远 ,其遗传差距越明显 。在同种植物中 ,异
穗卷柏和薄叶卷柏有 2份样品与主分类群出现了游
离 ,正好反映了种下变异 。其中样品 5为仅有独立
孢子枝的异穗卷柏 ,样品 4则为兼具营养枝和孢子
枝的异穗卷柏(孢子叶尚未长出 ),尽管它们为同一
个种 ,但并没有简单地聚为一类 ,提示两者在所含遗
传信息上有所差异;样品 2和 4聚为一类 ,样品 1和
3在近距离另聚为一类 ,我们发现这些样品在形态
上就有所不同 ,样品 2和 4孢子叶尚未长出 ,而样品
1和 3有孢子枝 。两个薄叶卷柏样品没有完全聚为
一类 ,也说明二者在遗传基础上有所差异 ,这一结果
同样支持将变异类型的薄叶卷柏作变种处理 ,与用
形态学方法获得的结果基本吻合〔7、8〕。
以上 ,本属 8种植物 17份样品的 RAPD研究及
聚类分析结果表明 , RAPD技术能较好地用于分析
卷柏属植物种间或种下样品的遗传距离 ,能灵敏地
揭示两个关系相近的个体之间的遗传差异 ,适合解
决种下等级鉴定等问题 〔10〕。同时 ,由遗传距离获得
的有关药用植物间的亲缘关系 ,为扩大资源和活性
研究 ,提供了新线索 。在本研究中 ,对某些关系还不
能很好解释 ,如具独立孢子枝的异穗卷柏与普通的
异穗卷柏的距离过远等 。这是由于类群的总体平均
差异取决于群内变异的积累 ,因此 ,用一 、二个样品
代表一个种群来进行分析可能造成结果的某些偏
差〔10〕 ,针对某些具体品种 ,还需要应用足够多的样
品进行分析。
参 考 文 献
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