全 文 ：毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析
苏　波
(长沙外国语学校 , 湖南 长沙　410001)
摘　要:采用 D-101 大孔树脂吸附和正丁醇萃取两种不同的方法对毛茛皂苷进行提取分离 , 对分离纯化后的样
品采用紫外可见光全波长扫描分析和高效液相色谱纯度和含量鉴定.结果表明分离纯化后的毛茛皂苷在 209 nm 处有
最大吸收峰 , 正丁醇萃取的毛莨皂苷含量比大孔树脂吸附分离的较高.以毛茛皂苷对 9 种不同细菌进行抑菌实验 ,
显示毛茛皂苷对绿脓杆菌 、 粪肠球菌 、 产气肠球菌 、 金黄色葡萄球菌均具有较明显的抑菌作用.
关键词:毛茛皂苷;　大孔树脂吸附;　正丁醇萃取;　抑菌作用
中图分类号:R284　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-9743 (2011)02-0053-04
收稿日期:2011-02-11
作者简介:苏　波 (1969-), 男 , 湖南岳阳人 , 湖南农业大学硕士生 , 主要研究环境生物学.
　　毛 茛 (Ranunculus japonicusThunb)是 毛 茛 科
(Ranunculaceae)毛茛属 (Ranunculus)植物 , 以带
根全草入药 , 又名老虎脚迹 、 五虎草等 .生于田沟旁
和林缘路边的湿草地上 , 除西藏外 , 在我国各省区广
布.味辛 , 性温 , 有毒 .具有利湿 、 消肿 、 止痛、 退
豁 、截疟 、 杀虫之功效 , 中医临床用于主治疟疾 、 黄
疽 、偏头痛 、 胃痛 、 风湿关节痛 、 鹤膝风 、 痈肿、 恶
疮 、疥癣 、 牙痛 、 火眼等疾病.毛茛始载于 《本草拾
遗》 , 在 《本草纲目》 中也有记载 , 应用历史悠久[ 2] .
毛茛种类多 , 在我国分布广 , 其药用价值逐渐得
到重视 , 迄今为止 , 国已内相继从毛茛中分离得到了
20个化合物.近年来对毛茛的研究表明其具有抗菌杀
菌 、抗组胺 、 抗肿瘤 、 松弛血管或子宫平滑肌以及在
农业方面具有杀灭病虫害等作用[ 1] .皂苷广泛分布于
自然界 , 包括三萜皂苷和甾体皂苷 , 因水溶液振摇后
可生成胶体溶液 , 并有持久性似肥皂溶液的泡沫而得
名[ 2].药理研究证明 , 皂苷具有抗炎 、 抗肿瘤 、 抗菌
和抗病毒 、 降低胆固醇 、 降血糖和免疫调节等多方面
的生物活性和药理作用[ 3] .由于毛茛皂苷提取物往往
被认为有效成分含量低 、 杂质多 、 质量不稳定 , 用药
多建立在经验的基础上 , 难以与现代医学接轨.为解
决这个问题 , 研究并优化毛茛皂苷的提取与纯化工艺
十分必要.
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　材料采集与处理
本研究所用材料于 2009 年 7-9 月份采自当地田
野 、道旁 , 经专家鉴定为毛茛 (Ranunculus japonicus
Thunb).毛茛采回后用自来水洗净 , 去根 , 置于阴凉
通风处自然干燥 , 然后用 DS—1 组织粉碎机粉碎 , 40
目筛子过筛并保藏待用.
1.1.2　供试菌种及试剂
供试大肠杆菌 、 金黄色葡萄球菌 、 藤黄八叠球菌 、
枯草芽孢杆菌 、 绿脓杆菌 、 粪肠球菌 、 产气肠杆菌 、
副甲硫杆菌 、鸡沙门氏菌 9菌种均来自于湖南师范大
学;实验药品均为国产试剂.
1.2　实验方法
1.2.1　毛茛粗提物制备
精密称取 50 g毛茛粉末两份 (分别用于正丁醇萃
取和树脂吸附制备皂苷), 分别加 500 ml 70%乙醇浸泡
24小时后超声波辅助提取 (超声波条件 t=45 min , T
=30℃, W=750 w , 超声间隙 2 s), 然后用四层纱布
过虑.将滤渣再加 500 ml 70%乙醇重复此操作 , 合并
提取液.将提取液抽滤后 , 旋转蒸发 (130 pa , 60℃)
浓缩 , 得到毛茛粗提液.将粗提液先用等体积的石油
醚萃取 1-2 次 , 再用等体积的乙酸乙酯萃取 4-5次 ,
第 30卷第 2 期　　 　 　　　　　　怀化学院学报　　 　 　　　　　　Vol.30.No.2
2 0 1 1 年 2 月　 　 　 　 　JOURNAL OF HUAIHUA UNIVERSITY 　 　 　 　 　 　Feb., 20 11
DOI :10.16074/j.cnki.cn43-1394/z.2011.02.014
直至上层 (乙酸乙酯)为浅绿色 , 留下层液待用 (待
用液).
1.2.2　毛茛皂苷的制备
参考文献 [ 2] 中皂苷的提取 , 将以上待用液用等
体积的正丁醇萃取 2-3 次 , 合并萃取液后低温旋转蒸
发得到浸膏 , 加 20 ml蒸馏水溶解得到棕红色水溶液 ,
其浓度为 2.5 g ml.
将用 5%NaOH处理好的 D-101 大孔树脂装填层
析柱后 , 按文献 [ 4] 方法进行毛茛皂苷的分离提取 .
将三次乙醇洗脱液合并后低温旋转蒸发浓缩至 20 ml ,
得到棕红色液体 , 其浓度为 2.5 g ml.
1.2.3　毛茛皂苷的鉴定与分析
采用泡沫试验法鉴定毛茛皂苷[ 2].
将上述制备得到的棕红色液体 (皂苷溶液)稀释
100倍 , 在波长为 200 ～ 800 nm下紫外全程扫描 , 记录
其最大吸收峰的波长.以此最大吸收峰的波长为检测
波长进行高效液相色谱分析.用HNTX-Ⅲ为内标.
1.2.4　抑菌实验
采用牛肉膏蛋白胨培养基培养 9 种供试细菌 , 将
每一菌种均同时划线接种于一个斜面培养基和两个平
板固体培养基上 , 37℃恒温培养 24 h.用药敏纸片扩散
法[ 5] 对有效菌株的筛选 , 测定抑菌圈直径;采用二倍
稀释法[ 6] 测最低抑菌浓度 (MIC).
2　结果
2.1　毛茛皂苷的鉴定
经正丁萃取和经大孔树脂吸附所得的棕红色液体
加热煮沸约 10 min后过滤于一试管中 , 剧烈振荡 , 产
生大量泡沫并长时间不消失 (大于 30 min), 说明该液
体含有高浓度皂苷.
2.2　毛茛皂苷的提取分析
对提取得到的毛茛皂苷在 200 ～ 800 nm下紫外全程
扫描显示 , 其最大紫外吸收波长为 209 nm (图 1).
经HPLC 分析 , 内标 HNTX -III 和毛茛皂苷的
HPLC各峰保留时间与各峰面积分别见图 2 与图 3 , 其
量化数据如表 1所示.
图 1　毛茛皂苷的紫外扫描图谱
注:A 为紫外扫描全图 , B为 200 ～ 220 nm 紫外扫描的放大图
图 2　内标和毛茛皂苷的 HPLC峰保留时间图谱 图 3　内标和毛茛皂苷的HPLC 峰面积图谱
注:A、 B与 C 依次分别为内标 、 树脂吸附与正丁醇萃取制备的皂苷 HPLC 图谱.
·54· 怀化学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　2011 年 2月
　　从图 2、 3与表 1 可见 , 正丁醇萃取的毛茛皂苷粗
品比树脂吸附分离得到的毛茛皂苷粗品的成分要复杂 ,
前者共有 10 个明显的保留峰.根据各峰的保留时间 ,
初步可推断树脂吸附分离得到的毛茛皂苷粗品HPLC中
的 1、 2 、 3 、 4 、 5 、 6号分别对应正丁醇萃取的毛茛皂
苷粗品HPLC中的 1、 2 、 5 、 8、 9 、 10号峰 , 说明正丁
醇萃取的毛茛皂苷粗品中还存在其他 4种不同的杂质
成分.根据峰面积大小基本判断 1 号峰为毛茛皂苷的
保留峰 (主峰), 正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品和树脂吸
附分离得到的毛茛皂苷粗品的HPLC中 1号峰与内标峰
的保留时间相近 , 且与内标 1 号峰的相对面积之比分
别为 0.1961和 0.8789 , 可见正丁醇萃取毛茛皂苷收获
率是树脂吸附分离毛茛皂苷收获率的 4.48倍 , 且与毛
茛皂苷粗品中其他成分比较 , 正丁醇萃取毛茛皂苷的
纯度整体大于树脂吸附分离毛茛皂苷的纯度.
表 1　HPLC 图谱分析数据
Peak#
内标 树脂吸附 正丁醇萃取
R.Time
内标 树脂吸附 正丁醇萃取
Area
内标 树脂吸附 正丁醇萃取
1 1 1 3.041 3.302 3.040 948792 1079558 4839328
— 2 2 — 3.486 3.502 — 41870 196318
— 3 3 — 7.695 5.394 — 110180 112403
— 4 4 — 9.493 5.935 — 300503 165334
— 5 5 — 10.613 7.375 — 162918 69369
— 6 6 — 11.242 7.723 — 253031 202947
— — 7 — — 8.145 — — 105016
— — 8 — — 9.530 — — 375841
— — 9 — — 10.646 — — 186787
— — 10 — — 11.303 — — 200950
2.3　毛茛皂苷的抑菌能力分析
利用HPLC对正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品进行多次
纯化得到较纯净的毛茛皂苷用作抑菌试验.在选取的
九种菌株中 , 毛茛皂苷对绿脓杆菌 、 粪肠球菌 、 产气
肠球菌 、 金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用 , 测得其
平均抑菌圈的大小与空白对照的比值分别为 2.5 、 2.0 、
1.7、 1.5 (表 2), 而对其他 5种细菌没有明显的抑制
生长的效果.由此可知毛茛皂苷对绿脓杆菌抑制能力
最大 , 其次分别是产气肠球菌 、 粪肠球菌 、 金黄色葡
萄球菌.其中绿脓杆菌和产气肠杆菌均为革兰氏阴性
菌 , 所以毛茛皂苷可能对革兰氏阴性菌的抑制力大于
对革兰氏阳性菌的抑制作用.
通过二倍稀释法测定了毛茛皂苷对筛选的 4 种有
效菌株的最低抑菌浓度 (MIC), 实验结果表明 , 毛茛
皂苷对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的 MIC均为 62.50
mg ml , 而对其他 2种细菌的MIC都为 31.25 mg ml (表
2).同样可证明毛茛皂苷对绿脓杆菌和产气肠杆菌生
长的抑制作用比对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌生长的
抑制作用要强.
表 2　毛茛皂苷的抑菌效果
有效菌株 绿脓杆菌 产气肠杆菌 粪肠球菌 金黄色葡萄球菌 对照
抑菌圈 (mm) 15.0 12.0 10.0 9.0 6.0
比值 2.5 2.0 1.7 1.5 —
MIC (mg ml) 31.25 31.25 62.50 62.50 —
3　讨　论
通过用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附分离法对毛
茛皂苷提取含量和纯度进行综合比较 , 尽管大孔树脂
吸附分离法得到的毛茛皂苷样品含杂质较少 , 但毛茛
皂苷的相对含量不高 , 按HPLC峰面积计算 , 毛茛皂苷
的峰面积与其他杂质总峰面积比为 1.243 (1079558
868502);相反 , 正丁醇萃取法得到的毛茛皂苷样品含
杂质成分个数虽然较多些 , 但毛茛皂苷的相对含量明
显较前者高 , 其与其他杂质总峰面 积比为 2.997
(4839328 1614965).因此 , 正丁醇萃取对毛茛皂苷的
提取率明显高于大孔树脂吸附的分离 .而且 , 结合
·55·第 30 卷第 2 期　　　　　　　　　　苏 波:毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析
HPLC的多次纯化 , 单位数量的原材料毛茛中可更多地
收获到较高纯度的毛茛皂苷.然而 , 正丁醇萃取法需
要耗费较多的剂试 , 提取成本较 , 且对环境有一定的
污染.因而 , 如何更加有效地获取毛茛皂苷还需更近
一步研究.
抑菌结果显示毛茛皂苷对绿脓杆菌 、 粪肠球菌 、
产气肠球菌 、 金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用 , 而
对其他 5种菌株没有明显的生长抑制性 , 说明其缺乏
广谱抑菌作用 .然而 , 它对绿脓杆菌和产气肠球菌的
MIC都仅为 31.25 mg ml , 明显小于其他植物成分抑菌
的MIC[ 6-8] , 表明它对绿脓杆菌和产气肠球菌生长可
能存在较特异的抑制作用 , 为其药理药学开发起到一
定的提示作用.
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A Research on the Extraction of Saponin from Rnauneuusl
and Its Preliminary Bacteria Functions
SU Bo
(School of Foreign Languages in Changsha , Changsha , Hunan 410001)
Abstract:Saponin was extracted and purified by D-101 macroporous resin adsorption and n-buoh alcohol extraction from
Rnauneuusl .And saponin was analyzed through Uv , which indicate that its maximum absorption wavelength is 209 nm.As the
same time , the purity and content of saponin which obtained by two different methods were tested by HPLC.The results showed
that the effect of n-butyl alcohol extraction is better than that of the macroporous resin adsorbent.Then , the saponin was to be
examined its preliminary bacteriostasis ability on 9 different bacteria by measuring the size of the circle of bacteriostasis , the results
showed that saponin has the obvious bacteriostatic action on Bacillus subtilis , P.aeruginosa , E.faecalis ,Gas aureus
Staphyloccocus aureus Rosenbach.
Key words:saponin of Ranunculus japonicus ;　macroporous resin adsorption;　n -butyl alcohol extraction;　
bacteriostasi
·56· 怀化学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　2011 年 2月