全 文 ：辽宁农业科学　2010(3):11 ～ 15LiaoningAgriculturalSciences
文章编号:1002-1728(2010)03-0011-05
HPD-722大孔树脂纯化葎草总黄酮的工艺研究
＊ 董江涛 ,李　燕 ,徐慧强 ,蒋橙华
(上海海洋大学食品学院 , 上海　201306)
摘要:为纯化葎草黄酮 ,以吸附率与解吸率为指标 ,考察 6种不同性质的大孔树脂对葎草黄酮的吸附与解析能
力 , 最终确定 HPD-722为较理想的树脂。并对 HPD-722树脂的纯化条件进行优化 , 得到最佳工艺条件为:以 3
mg/ml的浓度(溶液 pH=4)、1.5BV/h的速率 3BV上样 ,以 4BV的 70%乙醇 、2 BV/h的速率洗脱。经 HPD-
722处理后的葎草总黄酮可达 47.3%,纯化了 30.5%。
关键词:葎草;黄酮;大孔树脂吸附;HPD-722;纯化
中图分类号:R284.2 文献标识码:A
　　葎草 [ Humulusscandens(Lour.)Merr]具有
清热解毒 、利尿通淋的功效 ,主治肺热咳嗽 、肺痈 、
虚热烦渴 、热淋 、水肿 、小便不利 、湿热泻痢 、热毒
疮疡 、皮肤搔痒等 。
药理研究证明 ,其具有抗茵 、抗炎 、止泻抑菌 、
降压 、镇痛等作用 [ 1] 。
已报道的从葎草全草中分离出的主成分为黄
酮类化合物 [ 2] 。因此葎草黄酮类化合物开发意
义重大 ,但现有的提取方法所得黄酮纯度一直不
高 ,因此需要选择一种较为经济快速的方式提高
黄酮的纯度 。
大孔树脂由于物理化学性能稳定 、吸附选择
性好 、解吸条件温和 、再生简便等优点 ,被广泛应
用于天然产物的分离纯化 [ 3] 。试验通过对 6种不
同性质的大孔树脂对比 ,确定了 HPD-722树脂作
为纯化葎草黄酮的树脂 ,并对其纯化参数进行了
优化。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
葎草:11月中旬采自安徽亳州 ,自然晾干;
芦丁标准品 ,中国药品生物制品检定所;NaNO2
(分析纯)、Al(NO3)3(分析纯)、NaOH(分析纯),
国药公司。
1.2　仪器与设备
树脂:D101型 、 HPD-826 型 、 HPD-722 型 、
HPD-600型 、ADS-17型 (沧州宝恩化工有限公
司);NKA-2型(上海华震科技有限公司);2.0 cm
×60 cm层析柱(上海锦华层析设备厂);HL-2恒
流泵(上海青浦沪西仪器厂);WFZ-UV2000紫外
可见分光光度计 , (尤尼柯仪器有限公司);sartori-
usBS210S电子天平(北京塞多利斯天平有限公
司);高速冷冻离心机(H2050R-1长沙湘仪离心
机仪器有限公司)。
2　试验方法
2.1　树脂的选择
大孔树脂分离物质是依赖于其表面基团的极
性选择性地结合待分离物质的 。根据黄酮类化合
物的极性 , 选取了 D101、 HPD-826、 HPD-722、
HPD-600、ADS-17、NKA-2, 6种不同极性的大孔树
脂 。
2.2　树脂的预处理
经筛选后的各树脂 ,先用 95%乙醇浸泡 24 h
充分溶胀 ,然后加入去离子水洗至洗出液无白色
浑浊;用 4倍体积的 5%HCl溶液浸泡 12 h,而后
用去离子水速洗至出水 pH值为中性;再用 4倍
体积的 5%NaOH溶液浸泡 12h,而后用去离子水
＊收稿日期:2010-05-05
基金项目:上海海洋大学骆肇荛大学生科技创新基金(G-7101-00-000737)
作者简介:董江涛(1983-),男 ,山东威海 ,硕士在读 ,主要从事天然产物研究与开发。
Tel:15121048986　E-mail:dongjiangtao2007@126.com
辽 宁 农 业 科 学 　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
洗至 pH值中性 ,滤去水室温晾干即得 [ 3 ～ 4] 。
2.3　芦丁标准曲线制作
准确称取 0.0100 g芦丁标准品以 60%的乙
醇溶解 ,定容至 50 ml,得 0.200 mg/ml的芦丁标
准液。分别移取 0.0、1.0、 2.0、3.0、 4.0、5.0、
6.0、7.0 ml的芦丁标准液于 8个 25 ml容量瓶
中 ,各加 1.0 ml5%的 NaNO2溶液 ,摇匀后静置
6 min,再各加 1.0 ml10%的 Al(NO3)3溶液 ,摇
匀后静置 6min,继续各加入 10.0ml4%的 NaOH
溶液 ,用 60%的乙醇稀释到刻度 ,静置 15 min。
在 510nm处测定吸光度(A),以浓度(mg/ml)为
横坐标 , A为纵坐标制作标准曲线 [ 5] 。
2.4　配制已知浓度的黄酮溶液
用微波辅助乙醇提取葎草中的总黄酮 ,将黄
酮提取液旋转蒸发后冷冻干燥 ,得到粗黄酮粉末 ,
取 1 g粉末溶解在 50 ml60%的乙醇中 ,量取
0.2ml,测定吸光值换算黄酮含量 ,经计算得提取
粗粉中黄酮含量为 16.8%。根据含量配制浓度
为 1.5 mg/ml和 4mg/ml的黄酮溶液用于静态 、动
态吸附试验 。
2.5　黄酮含量测定原理及方法
2.5.1　黄酮含量测定原理
黄酮含量测定采用硝酸铝络合分光光度法 ,
其原理是先用亚硝酸钠还原黄酮 ,再与硝酸铝络
合生成稳定的红橙色化合物 ,然后以芦丁作标准 ,
于 510 nm(符合定量分析的比尔定律)波长处测
定吸光度 ,换算黄酮的含量 。
2.5.2　黄酮含量测定方法
准确量取黄酮溶液 1ml于 50 ml容量瓶中 ,
加 1.0ml5%的 NaNO2溶液 ,其余操作同 2.3芦
丁标准曲线制作 ,在 510 nm处测定吸光度 ,根据
标准曲线计算黄酮含量[ 6] 。
2.6　6种树脂对葎草黄酮的吸附率与解吸率的
测定
2.6.1　吸附率测定
将选择的 6种不同极性的大孔树脂进行吸附
率的测定比较 。测定方法为:准确称取经预处理
的树脂各 1g于 50 ml具塞磨口三角瓶中 ,加入葎
草总黄酮溶液 30 ml(黄酮浓度为 1.5mg/ml),置
摇床上振荡 24 h,振荡频率为 180次 /min,充分吸
附后过滤 ,测定滤液中剩余黄酮浓度 ,按下式计算
各树脂的吸附率:Q=(Co-Cr)VW 式中:Q—吸附
率(mg/g), C0—初始浓度(mg/ml), Cr—剩余浓
度(mg/ml), V—溶液体积(ml), W—树脂的质量
(g)[ 7] 。
2.6.2　解吸率测定
取经上述方法充分吸附黄酮后的树脂各 1g,
准确加入 70%的乙醇 30ml,置摇床上振荡 12 h,
振荡频率为 180次 /min,过滤 ,测定滤液中黄酮浓
度 ,根据黄酮解吸量计算解吸率(%)。
2.7　树脂纯化参数的优化
对 2.6.2选取的树脂的纯化参数工艺进行优
化 ,分为静态吸附与动态吸附两部分 。静态吸附
试验主要考察上样液 pH值 、吸附时间 、解吸乙醇
的浓度的影响 。动态吸附试验主要从上样浓度 、
上样流速 、上样量 、洗脱流速 、洗脱终点等方面进
行考察 。当流出液吸光度达上样液的 1/10时 ,认
为达到穿透点停止上样 ,计算吸附量 。
3　试验结果
3.1　6种树脂对葎草黄酮的吸附率与解吸率
如表 1所示:吸附率较高的树脂有:ADS-7、
HPD-722,解吸率较高树脂有:D-101、HPD-722。
综合比较吸附率与解吸率选取 HPD-722作为纯
化黄酮的较理想树脂 。
3.2　芦丁标准曲线
从图 1中可以看出 ,芦丁标准曲线回归方程
为:A=9.4122C-0.0054(R2 =0.9997),其中 C
为黄酮浓度(mg/ml), A为吸光度 , 线性关系良
好 。
3.3　HPD-722树脂的静态吸附试验
3.3.1　上样液 pH值考察
分别考察了 pH为 2、3、4、5、6条件下黄酮的
吸附率 ,结果见图 2。
从图 2可知 ,当溶液的 pH为 4时 ,黄酮的吸
附率较高 ,吸附率随着 pH值继续增加而降低。
这由于在酸性较强时易形成 “佯盐 ”,偏碱性时分
子中酚羟基 H+易失去 ,形成离子结构 ,不易被吸
附 。
3.3.2　吸附时间考察
分别考察了 1、2、3、4、5、6、8、10、12 h后黄酮
的吸附率 ,结果见图 3。
·12·
第 3期　　　　　　　　 董江涛等:HPD-722大孔树脂纯化葎草总黄酮的工艺研究
从图 3中得知 ,吸附率在前 4 h内增长较快 ,
到达 6h树脂基本达到吸附平衡 。这是因为在吸
附的最初阶段 ,树脂表面与黄酮接触充分 ,但随着
吸附时间的继续延长 ,由于孔容的极限 ,吸附量的
增加速率减小。
3.3.3　解吸乙醇的浓度
分别以浓度为 30%、40%、50%、60%、70%、
80%、90%的乙醇 ,进行解吸 ,测定解吸液浓度计
算解吸率 ,结果见图 4。
从图 4中可以看出 ,随着乙醇浓度的不断增
加 ,黄酮的解吸率不断上升 ,这是由于葎草中黄酮
类化合物的极性决定的。当乙醇浓度达到 70%
后 ,解吸率增加不明显 ,从节省原料的角度考虑 ,
选取 70%作为解吸乙醇的浓度 。
3.4　HPD-722树脂的动态吸附试验
3.4.1　上样液浓度的考察
分别以浓度为 4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10
mg/ml的黄酮溶液上样 ,计算黄酮的吸附率 ,结果
见图 5。
由图 5可知 ,随着上样液浓度的增加 ,黄酮的
吸附率降低 。大孔吸附树脂的吸附量一般与上样
液浓度成反比 ,在低浓度下对吸附有利。在相同
流速和相同吸附时间下 ,若上柱液浓度过大 ,由于
孔容的限制了吸附极限 ,所以会有更多的有效物
质未被充分吸附而流出。
3.4.2　上样量的考察
分别以 1 BV、 2BV、3BV、4BV、 5 BV、6 BV、
7 BV、8BV的量上样 ,检测上样后流出液的黄酮
浓度 ,计算 HPD-722树脂的吸附率 ,结果见图 6。
如图 6所示 ,在上样量较小的情况下 ,树脂对
黄酮的吸附基本与上样量成正比 ,这是由于起始
阶段树脂表面有足够的基团吸附黄酮 ,随着上样
量的不断增大 ,树脂表面基团不断饱和 ,吸附能力
逐渐减弱 。当 C /C=1/10时即达到吸附穿透
点 ,认为吸附饱和 ,当上样体积为 3BV时 C /C>
1 /10,因此选择 3BV作为上样体积 。
3.4.3　上样流速的考察
分别以 1 BV/h、 2 BV/h、3 BV/h、4BV/h、
5 BV/h的流速通过 HPD-722树脂柱 ,计算树脂对
黄酮的吸附率 ,结果见图 7。
图 7反应了黄酮的吸附率随流速增加而降
低 ,上样流速通过影响溶质向树脂表面扩散 ,而决
定了吸附量的大小。上样流速过大 ,树脂的吸附
量下降 。因为在相同的上样速度下 ,加快流速使
得相对吸附时间减少 ,溶质分子还未被树脂内表
面吸附 ,就已经洗脱下来 ,造成样品的流失;如果
流速过小 ,试验周期延长 ,效率降低 。考虑到吸附
效果与试验周期的要求 , 选择的上样流速为
2 BV/h。
3.4.4　洗脱速度的考察
分别以 1 BV/h、 2 BV/h、 3 BV/h、 4 BV/h、
5 BV/h的流速进行洗脱 ,收集洗脱液检测黄酮含
量 ,计算总黄酮的解吸率 ,结果见图 8。
从图 8可以看出 ,以 1 BV/h和 2 BV/h的流
速洗脱时 ,黄酮解吸率相近 ,流速加快解吸率下
降 ,这是由于较低流速下乙醇能够充分溶解树脂
已吸附的黄酮 ,而过高的流速使得乙醇未黄酮充
分接触就流走 ,没有充分溶解黄酮 。结合试验周
期的需求 ,以 2BV/h的流速进行洗脱。
3.4.5　洗脱终点的考察
取葎草样品液(总黄酮含量为 4.0 mg/ml),
调节 pH=3,以 2BV/h的流速 、5BV的上样量加
入 HPD-722树脂柱 ,进行吸附 ,再以 5 BV水洗脱
后 ,用 70%乙醇以 2 BV/h的速度洗脱 ,按树脂床
体积收集洗脱液 ,计算含量 ,结果见图 9。
从图 9可以看出 ,在起始阶段 ,随着乙醇体积
的增大 ,黄酮的解吸率增加很快 ,当洗脱液用量为
5 BV时 ,解吸率增加缓慢 ,通过计算得知基本达
到解吸平衡 ,因此选定 5BV作为洗脱体积。
表 1　6种大孔树脂对黄酮类化合物的吸附率与解吸率Table1　Theadsorptioncapacitiesanddesorptionratiosof6 kindsofmacroporousresinstowardsfla-vonoidsfromhumulus
树脂型号 总黄酮吸附量(mg/g) 总黄酮吸附率(%) 总黄酮解析率(%)
D-101 32.82 72.94 82.75
NKA-2 35.38 78.62 76.83
ADS-17 37.22 82.71 72.38
HPD-722 38.94 86.54 78.84
HPD-600 36.61 81.36 73.83
HPD-826 34.41 76.47 71.57
3.5　分离的葎草总黄酮纯度考察
取葎草样品液(总黄酮含量为 1.5 mg/ml)
20ml平行 3份 ,调节 pH=4,以 1.5BV/h的上样
流速通过 HPD-722树脂柱(2 cm×20 cm),上样
体积为 3BV,以 2 BV/h的洗脱流速用 70%的乙
·13·
辽 宁 农 业 科 学 　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
醇洗脱 ,收集洗脱液 ,测定黄酮含量 ,经计算总黄
酮的纯度分别为 46.7%、47.5%、47.6%,平均为
47.3%,测定结果稳定 ,偏差不大 ,说明经 HPD-
722大孔树脂处理后的总黄酮含量可达 46%以
上 ,且具有良好的重现性。
图 1　芦丁标准曲线图Figure1　Standardcurveofrutin
图 2　pH值对吸附率的影响Figure2　TheeffectofadsorptionrateatdifferentpHvalue
图 3　静态吸附动力学曲线Figure3　Thestatic-adsorptiondynamiccurveofHPD-722macroporousresin
图 4　乙醇浓度对解吸率的影响Figure4　Theeffectofdesorptionrateatdifferentethanolconcentration
图 5　上样液浓度对吸附率的影响Figure5　Theeffectofadsorptionrateatdifferentsampleconcentration
图 6　上样量的考察Figure6　Theinvestigationofsamplevolume
图 7　上样流速对吸附率的影响Figure7　Theeffectofdesorptionrateatdifferentsamplespeed
图 8　洗脱流速对吸附率的影响Figure8　Theeffectofdesorptionrateatdifferentelutionspeed
·14·
第 3期　　　　　　　　 董江涛等:HPD-722大孔树脂纯化葎草总黄酮的工艺研究
图 9　洗脱终点的考察Figure9　Theinvestigationofterminalelution
4　结论
通过对大孔树脂动态吸附及解吸的相关因素
研究 ,最后确定了 HPD-722大孔树脂分离葎草总
黄酮的最佳工艺:树脂型号为 HPD-722型大孔树
脂 ,上样液浓度为 4mg/ml(溶液 pH=4),吸附速
率为 1.5BV/h,上柱量为 3BV;洗脱最佳工艺为:
以 4 BV的 70%乙醇 , 2 BV/h的速率洗脱 。经
HPD-722处理后的葎草总黄酮可达 47.3%。
参考文献:
[ 1] 　倪士峰 ,则惠 ,魏博 ,等.葎草药学研究 [ J] .吉林中医药 ,
2009, 29(2):162～ 163.
[ 2] 　李俊婕 ,王晓静 ,付义成.葎草化学成分的研究 [ J] .食品与
药品 , 2008, 10(05):5 ～ 7.
[ 3] 　刘志祥 , 曾超珍.大孔树脂法纯化苦丁茶总黄酮的研究
[ J].时珍国医国药 , 2009, 20(9):2183～ 2184.
[ 4] 　LiuJun, LuoJian-guang, SunYi, etal.Asimplemethodfor
thesimultaneousdecolorat-ionanddeproteinizationofcrude
levanextractfromPaenibaciluspolymyxaEJS-3 bymacro-
porousresin[ J] .bioresourcetechnology, 2010, 19(3):1～ 7.
[ 5] 　熊曼萍 ,梁静 ,周蓉 ,等.超声波提取葎草总黄酮的工艺研究
[ J].安徽农业科学 , 2007, 35(30):9708～ 9709.
[ 6] 　汪河滨 ,郭志愿 ,赵小亮 ,等.超声 -微波协同萃取灰叶胡杨
花粉中总黄酮的工艺研究 [ J] .食品科学 , 2009, 30(2):61
～ 64.
[ 7] 　ZhangFeng-xiang, WanZhang, XuShi-ying.Macroporous
resinpurificationofgrassc-arpfish(Ctenopharyngodonidel-
la)scalepeptideswithinvitroangiotensin-Iconvertingen-
zyme(ACE)inhibitoryability[ J] .FoodChemistry, 2009, 15
(4):387 ～ 392.
PurificationofFlavonoidsfromHumulusbyMacroporousResin sAbsorption
DONGJiang-tao, LIyan, XUHui-qiang, JIANGCheng-hua
(CollegeofFoodScience＆Technology, ShanghaiOceanUniversity, Shanghai　201306)
Abstract:Thepurposeofthispaperistopurifyflavonoidsfromhumulus.Theexperimentdeterminedwithab-
sorptionanddesorptionrateasindexestoobserve6typesofmacroporousresin sabsorptionanddesorptiona-
bilityforflavonoidsfromhumulus.ResultsshowedthattheHPD-722 macroporousresinhasgoodabsorbing
anddesorbingefect.Andtheexperimentestablishedtheoptimumprocesconditionsforpurification:Theliq-
uidconcentrationofabsorbingandseparatingis4mg/mlattheinjectionrateof2BV/h, Andthesamplevol-
umeis5BV.Theelutionefectof70% alcoholwith5BVatthespeedof2 BV/histhebest.Afterpurifiedby
HPD-722 macroporousresin, thepurificationoftotalflavonoidsfrompersimmonleavesisupto52%, whichis
purifiedby33.8%.
Keywords:Persimmonleaves;Flavonoids;Macroporousresins;HPD-722;Purification
·15·