全 文 ：生 物 工 程 学 报 9 ( 2) : 15 2一 13 1, 199 3
C孙I” ` s e OJ u r雌 a落 o f B 止。才ec h 凡 o ot 岁
宜昌橙与伏令夏橙种间体细胞杂种
邓秀新 肖顺元 邓占鳌 章文才
(华中农亚大学柑枯研究所 , 武汉 ` 3。。 7。 )
宜昌橙 (C “ r u s 东e h a o g e “ : 宜5 S w i n g l e )试管实生苗叶肉原生质休与伏令夏甜橙 ( C . s ` , -
抓“ : 0 5加ck ) 胚性悬浮细胞系原生质体 , 经聚乙二醇 ( P GE ) 诱导融合。 再生出的胚状体为畸形 , 转移到生芽培养基中诱导产生丛芽 。 丛芽微嫁接在 15 夭龄的积壳砧上成为完整植株 。
幼叶染色体检查表明 , 两亲本均为二倍体 Zn = Z x = 18 , 融合后再生出的植株为四倍体 2n = 4x
二 36
。 过氧化物酶 ( P O X )及谷草酞胺转氨酶 ( G O T ) 同工酶分析证明 , 这些四倍体均为体细
胞杂种 , 它们同时含有双亲的酶带。 杂种植株叶片形态更像甜橙 。 植 株 移 入 土 壤 后 生 长
旺盛 .
关 , 润 柑桔 , 原生质体融合 , 体细胞杂种 , 宜昌橙 , 甜橙
柑桔原生质体融合技术近年来取得了
很大进展 。 自1 9 85 年首次报道通过原生质
体融合培育出 柑 桔属 ( C` t r “ ) 与 积 属
( p o ” c i r o s )的属间体细胞杂种以来 【“ , ,
迄今 , 巳获得 30 余个种间及属间体细胞杂
种 ` ” 。 这一技术巳成为克服柑桔有 性 杂
交过程中所遇到的珠心胚干扰 , 花 粉 /胚
囊败育等困难的有效方法 。 使 一 些 以 前
无法进行杂交的亲 本 间 实 现 了 荃 因 重
组 t ` ’ … , 。
本研究室自 19 8 7年开始了这方面的工
作 , 巳培育出柑桔属与金 柑 属 ( F or t 。 , -
le la )属间以及租柠檬与哈姆林甜橙种间体
细胞杂种各一个 「 3 ’ “ ’ 。 本文报道 新 近 培
育的宜 昌 橙 ( C` t r : s s c h a , 夕 e n: i: S w in -
g le )与伏令夏甜橙 ( C . ; `。 e 。 : `5 o sb ce k )
种间体细胞杂种 。
宜昌橙为原产我国湖北等地的一个抗
寒野生柑桔种 。 它可抗 一 18 ℃的低温 , 其
抗寒性在柑桔属 中是最强的 , 但其果实有
异味 、 种子多 , 不能食用 。 伏令夏甜橙为
优良的晚熟品种 , 但不抗寒 _ 本研究的目
的在于培养抗寒优质的柑桔类型或为进一
步开展柑桔抗寒育种提供中间材料 。
材 料 与 方 法
(一 ) 原生质体的制备及瓜浮细脸系
的趁立
宜 昌橙种子经表面消毒后 , 播种于试
管中。 待叶片充分展开后 , 分 离 原 生 质
体 。 播种培养基及消毒方法同前 〔 “ ’ , 伏令
夏橙的愈伤组织 由胚珠诱导产生 , 美国佛
罗里达大学 G r os s er 博士提供。 愈伤组织
按G r os s er 的方法建立起悬浮细胞系 「. ’ 。
(二 ) 原生质休分离方法
叶肉及悬浮细胞系的原生质体分离方
法参照 G r os s er 等 【。 ’ 的做法 。 原生质体融
合及培养方法 与以 前 的 报道 〔 “ ’ 基 本 相
同 。 在下列方面作 了修改 。 融合后培养再
生的胚状体为畸形 , 没能萌发出茎芽 。 随
后 , 用刀片将这种畸形胚状体 分 割 成 几
块 ,转入诱导生芽培养基中产生丛芽 。 培养
基为M T 【` “ ’ 基本培养基 , 附加 。 . s m g / L
本文于 几9 0 2年 5 月“ 日收到。
国家教委资助 墓金及国家 自然科学基金项 日 。
2期 邓秀新等 :宜昌橙与伏令夏橙种间体细胞杂种
KT
、
0
.
smg/ L BA及 o . lmg/ N LA A。 选
取生长较健壮的丛芽微嫁接在 5 1天龄的积
壳 ( Po c n f r。 : r rf fo lfa ra Ra f. )砧木上 。
将丛芽 留 o . c sm长 , 用手术刀片将其基部
削成契形 , 与此同时 , 将试管中生长 15 天
龄 的砧木去掉主根 , 在子叶上 1 . sc m 处去
掉茎 , 并将其劈开 。 随后 , 将丛芽插入裂
口 。 整个操作均在无菌条件下进行 。 接好
的植 株培养于 M T基本培养基 中。 伤口愈
合后 , 及时清除砧木的萌孽 。 待伤口充分
愈合 , 并且从芽长出新叶后 , 移入土壤 。
刚移栽时 , 罩上烧杯 , 每隔一天喷施一次
1 / 3 浓度的 M T 大量元素 。 植株长出新叶
后拿去烧杯
(三 ) 染色体数观察
采用幼叶 , 染色方法为海 氏 苏 木 精
法 。 每一植株至少观察 5 个清 晰 的 中期
细胞 。
(四 ) 醉的分析
采用聚丙烯酞胺凝胶电泳分析亲本及
再生植 株叶片的过氧化物 ( P O X ) 及 谷 草
酸胺转氨酶 ( G O T ) 两种同工酶 。 取 样及
分析方法与以前报道相同 ` 招 ’ 。
结 果 与 讨 论
(一 ) 原生质休培养与再生
融合后的原生质体浅层培养 10 天时 ,
观察到原生质体恢复分裂 。 20 天时 , 观察
到分裂 2 一 3 次的多细胞团 。 随着培养基
渗透压降低 , 多细胞团生长加 块 。 培 养
1 0 0天时 , 再生出球形胚状体 。 按 以 前 的
方法 【3 ’ , 胚状体没能进一步发育至 子 叶
期 , 不能萌发出茎芽 。 其中一些胚状体增
殖产生许多子叶状结构 , 成为 畸 形 胚 状
体 。 这一种胚状体被分割成几块 , 在诱导
生芽培养基中 2 个月后 , 再生出不定芽 。
在使畸形胚状体改变再生途径 , 产生不定
芽过程 中 , 观察到已木质化的组织较易产
生不定芽 。 而未木质化的则较难 , 甚至在
生芽培养基 中产生 愈伤组织 , 回复到未分
化状态 。 因此 , 本试验在以后的诱导不定
芽过程中 , 将畸形胚状体切开后置于 M T
基本培养基中先培养 (木质化 )一段时问 ,
然后再诱导不定芽 。
(二 ) 徽嫁接产生完整植株
本试验获得的丛芽在生根培 养 基 ` 3 ’
中未能生根 。 丛芽经试管微嫁接后成为植
株 。 嫁接成活率在 7 0 % 以上 。 芽的质量与
嫁接 J划舌率有直接关系 。 嫁接时 , 选取生
长粗壮充实 , 巳有叶片的丛芽嫁接较易成
活 。 嫁接 10 天后 , 必须注意清除砧木上的
萌萦 , 以保证接上去的芽生长 。 一般嫁接
后 2 个月 , 位株可移入上壤 。 本研究采用
此法 巳获得 5 0余棵完整植株 , 其中 15 株已
移入土壤 中 , 植株生长旺盛 。 从融合到植
株移入土壤所需时间远比作者进行的另外
2 个组 合 【3 ’ “ ’ 长 。 这可能与宜吕 橙 生 长
较缓慢以及扦插不易生根等特点有关 。
本试验 目前获得的丛芽均来 f J该融合
最先再生出来的 2 个畸形胚状体 。 后来证
明均为体细胞杂种 。 这一结果 与 以 前 报
道 ’ “ ’ “ ’ 相类似 。 说 明杂种细胞在 生 长 过
程中具有优势 。 在柑桔属与其 近 缘 植 物
(种 )的融合中 , 常遇到胚状体畸形化 , 难
以生根等问题 〔 6 ’ . ’ . ’ ` 之’ 。 目前报 道 的 体
细胞杂种中 , 有一部分就是将畸形胚状体
诱导丛芽后再生成株的 。 因此 , 在开 展融
合时 , 特别是进行野生种的融合时 , 不仅
要建立起一套有效的融合及培养体系 , 而
且 , 还要注意畸形胚状体的成苗问题 。 改
变畸形胚状体再生途径 , 先诱导丛芽 , 然
后生根或试管嫁接成植 株 , 以提高体细胞
杂种的再生频率 。
(三 ) 体细胞杂种的确认
对移入土壤的 15 裸植株进行叶片形态
生 物 工 程 学 报 9卷
比较 , 见图版 I 一 1一 2 。 这些植株的叶片较
宜昌橙及伏令夏橙厚 , 叶色深。 其叶大小
是鉴别柑桔种类的重要指标。 从图版 I 一 2
看出 , 杂种植株的叶片典叶比 亲 本 伏 令
`夏橙大 , 但比另一亲本宜昌橙小 , 杂种叶
片大小及形态更像伏令夏橙 。 这 15 裸植株
之间 , 叶片形态上无 明显差异 。 对其中 5
株的幼叶进行染色体观察 , 结果 表明为四
倍体 , Zn = 4 x = 36 (图版 卜 5) , 而其亲
本伏令夏橙及宜昌橙均为二 倍 体 , 2n =
Z x = 1 8 (图版 I 一 3 ) 。
P O X及 G O T两种同工酶分析结 果 显
示 , 这 5 裸四倍体植株均为异源四倍体体
细胞杂种 。 伏令夏 橙 及宜昌橙的 P O X及
G口 r 同工酶带均有差异 (图版 I 一 4一6 ) ,
它们的体细胞杂种则同时含有 双 亲 的 酶
带 , 双亲的酶带在杂种中均得到表现 。 以
上几方面的结果证明本试验获得了宜昌橙
与伏令夏橙的种 间体细胞杂种 。
柑桔有性杂交 , 长期 以来因为珠心胚
干扰的障碍而进展缓慢。 柑桔属中的绝大
多数种 (品种 ) 是多胚的 〔 ’ 3 ’ 。 本试验采
用的宜昌橙为柑桔属中为数不 多的 单 胚
性野生种 「` 3 ’ , 是抗寒及矮化育种的宝贵
资源 。 华中农业大学六十年代试图将其抗
寒性通过有性杂交方式转转到 栽 培 品 种
去 。 结果发现以其作为母本的杂交方式没
有得到杂种 , 后来采用本地早 ( 多胚 )为母
本与它杂交得到了几 株杂种苗 。 这些有性
杂种个体问性状差异较大 。 果实性状表现
为不可食用 。
本试验通过融合方式得到了一批杂种
苗 , 解决了珠心胚干扰及伏令夏橙花粉和
珠囊部分败育种子少 【’ . ’ , 难以杂种的困
难 , 提高了育种效率 。 从目前植株的枝叶
看 , 其野生性状表现不强 , 而更趋向栽培
品种伏令夏橙 。 值得指出的是 , 这种异源
四倍体会不会像同源四倍体那样表现出果
实的 , 皮粗厚等不利特点 , 这还有待以后
观察 。 已有关于柑桔异源四倍体体细胞杂
种的报道 ` 2 , “ · ” ’ , 还不能对这一问 题 作
出结论 。
参
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rP姗 , W es t aL f ay et 吕 , IN . , p . 的?一 5 . , 19 7 5 .
2期 引`秀新等 :’八吕橙 ` j伏令夏冷种问休细饱杂种 13 1
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