全 文 ：收稿日期:2007-11-24;　修订日期:2008-02-18
基金项目:国家自然科学基金(No.30660157);
新疆维吾尔自治区高校科研计划青年教师启动基金项目(No.
XJEDU2006S21)
作者简介:刘　涛(1974-),女(汉族),安徽太和人 ,现任新疆医科大学公
共卫生学院副教授 ,博士学位 ,主要从事新疆特色药食兼用植物的开发应
用研究工作.
琐琐葡萄多糖对大鼠体外免疫性肝损伤保护作用的研究
刘　涛1 , 马　龙 1 , 赵　军 2 , 苏德奇1
(1.新疆医科大学公共卫生学院 ,新疆 乌鲁木齐　830011;　2.新疆药物研究所 ,新疆乌鲁木齐　830002)
摘要:目的 研究琐琐葡萄多糖(VVP)在体外对大鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法 采用热水提取 、乙醇沉淀 , Sevage
法除蛋白 、透析分离纯化提取 VVP,苯酚硫酸法测定多糖含量。采用 BCG整体致敏 , LPS离体攻击法建立大鼠原代肝细
胞免疫损伤模型 , 取细胞上清液测定其 ALT, AST活性和 NO含量。结果 琐琐葡萄中多糖含量为 8.19%;VVP5, 20,
80μg/ml均可程度不同地使 BCG+LPS损伤后升高的大鼠肝细胞上清 ALT, AST活性和 NO含量明显下降 , 其作用与阳性
对照药物甘立欣(Grz)相似。结论 VVP在体外对大鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用。
关键词:琐琐葡萄;　多糖;　肝细胞;　免疫性肝损伤
中图分类号:R291.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)10-2325-02
EffectofPolysaccharidefromvitisviniferalononImmunologicalLiverInjuryinvitro
LIUTao1 , MALong1 , ZHAOJun2 , SUDe-qi1
(1.ColegeofPublicHealth, XinjiangMedicalUniversity, Urumqi, China, 830011, China;2.XinjiangKeyLa-
boratoryforResearchandDevelopmentofUighurDrugs, InstituteofMateriaMedicaofXinjiang, Urumqi,
830002, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheeffectofpolysaccharideisolatedformVitisviniferalonimmunologicalliverinjurymodelin
vitro.MethodsVitisamurensisPolysaccharidewasobtainedbyextractingwithwater, precipitationwith95% ethanol, clearing
proteinwiththesevageassay, anddialyzingandphenol-sulphatecolorimetrywasusedtodetermineitscontent.Theimmuno-
logicalhepatotoxicitymodelwasinducedbyBacillusCalmeteGuerin(BCG)pluslipopolysaccharides(LPS)invitro.Thesuper-
natantofcelsafter3 ～ 24hincubationwithVVPweretakenfortheestimationofALT, ASTandNOrespectively.ResultsThe
contentofpolysaccharideinVitisamurensiswas8.19%.ElevatedALT, ASTactivitiesandNOlevelweredecreasedaftertreat-
mentwithVVP(5, 20, 80 μg/ml)indifferentdoses.TheefectsofVVPmentionedaboveweresimilartothoseofthestandard
drug, DinmmoniumGlycyrrhizinate(Grz).ConclusionVitisviniferalpolysaccharideshowssignificantprotectiveeffectsagainst
immunologicalliverdamageinducedbyBCGplusLPSinvitro.
Keywords:vitisviniferal;　Polysaccharide;　Hepatocyte;　Immunologicalliverinjury
　　琐琐葡萄为葡萄科葡萄属植物琐琐葡萄 VitisviniferalL.的
成熟果实 ,主产于新疆吐鲁番 、和田 、鄯善等地 , 是维吾尔医习用
的一种药食兼用植物 ,药用果实 , 具有健脾胃 、理肺 、生津 、养血等
作用。维医用于治疗脾胃不和 、神志不安等 , 民间用于小儿麻疹 、
肝炎等症 [ 1] 。琐琐葡萄中除含有大量的葡萄糖 、果糖 、维生素 、
氨基酸等营养成分外 ,还有鞣质类 、黄酮 、萜类 、多糖等多种生物
活性物质 [ 2 ～ 4] 。研究表明多糖(polysaccharides)具有增强免疫 、
抗氧化 、抗肿瘤 、降血脂 、抗衰老 、抗辐射等多方面的药理作
用 [ 5] , 是近年来天然药物研究的热点课题之一。为探讨多糖与
琐琐葡萄抗病毒免疫调节活性的相互关系 , 本研究采用热水提
取 、乙醇沉淀 , Sevage法除蛋白 、透析分离纯化提取了琐琐葡萄多
糖(VVP),苯酚硫酸法测定多糖含量 , 并采用 BCG整体致敏 , LPS
离体攻击法建立大鼠原代肝细胞免疫损伤模型 , 探讨了 VVP在
体外对大鼠免疫性肝损伤的保护作用。
1　器材
1.1　动物 SD大鼠 ,雄性 ,体重(200±20)g, 新疆医科大学实验
动物中心提供(SPF级 , 动物使用许可证号:SYXK[新 ] 2003 -
0001)。
1.2　药材 琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维药市场 ,
经专家鉴定为 VitisviniferalL.的果实。
1.3　仪器与试剂 UV2501PC型双光束紫外分光光度计(日本岛
津);SaBa18 AMS全自动生化分析仪(Roma-Italy);Forma二氧
化碳培养箱;XD711型酶标仪(上海迅达医疗器械有限公司);
DZK88-A型电热恒温真空干燥箱(上海医疗器械七厂);CQ-
50型超声波清洗器(上海超声波仪器厂);METTLERTOLEDO
AB104-N型分析天平(Metler-ToledoInstr.shanghaiLtd)。 甘
立欣(Grz, 江苏正大天晴药业股份有限公司 , 批号 060808);Ⅳ型
胶原酶 、LPS(Ecoli0555:B5)(Sigma公司);DMEM培养基(GIB-
CO公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司 , 批号
061205);卡介苗(BCG, 上海生物制品检定所 , 批号 0601001);谷
草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(中生北控生物科技
股份有限公司), N-萘基 -乙烯二胺 、对氨基苯磺酰胺(Fluka进
口分装)。其余试剂均为国产分析纯。
2　方法
2.1　VVP的提取及含量测定 琐琐葡萄药材 300 g,粉碎 ,过 40
目筛 , 加 10倍体积的水回流提取 3次 , 3 h/次 , 提取液合并后减
压浓缩至适量 ,再加入 5倍体积的 95% 乙醇 , 静置过夜。抽滤 ,
沉淀经无水乙醇 、丙酮 、乙醚洗涤 ,置 60 ℃真空干燥箱中干燥 , 得
粗多糖 。将粗多糖溶于水 , 以 Sevage法除蛋白 , 透析 , 透析液中
加入 5倍体积的 95%乙醇 , 静置过夜 , 抽滤 , 所得沉淀用无水乙
醇 、丙酮 、乙醚洗涤数次 ,置 60 ℃真空干燥箱中干燥 , 即得精制多
糖。以半乳糖为对照品 , 采用苯酚 -硫酸法 [ 6]测定琐琐葡萄中
多糖的含量为 8.19%。
2.2　大鼠原代肝细胞培养方法 [ 7] 采用两步灌流法取大鼠原代
肝细胞进行培养。取SD雄性大鼠 6只 , 随机分为两组 , 模型组经
尾静脉注射 BCG8 mg/只致敏 ,正常组经尾静脉注射等体积生理
盐水。第 12天分别取正常和 BCG致敏的大鼠 ,腹腔麻醉 , 酒精
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.10 时珍国医国药 2008年第 19卷第 10期
消毒后开腹 , 分离肝门静脉并行门静脉插管 , 以 37℃无钙灌流液
灌流肝脏 , 迅速剪断下腔静脉 , 作在位灌流 5 min, 边灌流边切断
肝与周围组织的联系 , 将肝移置无菌托盘内继续灌流。冲尽残血
后 , 换为 37℃ Ⅳ型胶原酶灌流液循环灌流 10 min。取出肝脏转
移至超净工作台中进行无菌操作。
撕去肝包膜后将肝在培养液中轻轻振摇 , 散落肝细胞 , 收集
细胞悬液 , 500 r/min, 离心 3 min, 弃上清液 , 向沉淀中加入含
20%胎牛血清的 DMEM培养液同条件重复清洗两次 , 最后用
DMEM培养液重悬细胞。用 0.4%等张台朌蓝溶液染色 , 计算细
胞活率 , 细胞活率在 90%以上者可用于实验。
将分离的正常或 BCG致敏的大鼠肝细胞悬液用 DMEM培
养液稀释成 2.5×105个细胞 /ml,接种于 24孔培养板中 , 每孔加
入 1 ml。于 37℃, 5%CO2孵箱中培养 16 h后 ,取出 , 弃培养上清
液 , 正常组换以不含血清的 DMEM培养液 1 ml, BCG致敏大鼠的
肝细胞用 10μg/ml的 LPS攻击的同时 , 分别加入以不含血清的
DMEM培养液配制的各浓度阳性药物或 VVP受试药物溶液 1ml
进行防护 ,继续培养 , 每组平行 6复孔。分别于 3, 6, 12和 24 h时
间点收集以上各组细胞上清液 ,置 -70℃冰箱保存 , 待测。
2.3　指标检测 AST, ALT采用连续监测法测定;NO采用 Griss
法 [ 8]测定。
2.4　数据处理 使用 SPSS12.0软件包 , 采用方差分析 ANOVA,
LSR进行统计分析处理 , 结果以 x±s表示。
3　结果
3.1 　VVP对 BCG+LPS诱导的大鼠原代培养肝细胞上清液中
AST和 ALT活性的影响 表 1 ～ 2结果显示 , 正常大鼠肝细胞上
清液中 AST和 ALT活力随时间的延长变化不大;与正常对照组
比较 , BCG+LPS损伤后模型组大鼠肝细胞上清液中 AST和 ALT
活力随时间的延长逐步明显升高 ,在 24 h虽有所下降 , 但仍显著
高于正常对照组(P<0.01)。除低 、中剂量组在 3 h时间点未明
显抑制 AST活性外 , VVP各剂量组在 6, 12, 24 h各时间点均可不
同程度地抑制 AST和 ALT活性(P<0.01或 P<0.05), 其降酶
作用与阳性对照药物 Grz相似 , 并存在明显的剂量依赖关系 , 即
随着药物浓度的增加 ,降酶活性逐步增强。
表 1　VVP对大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤后细胞上清液中 AST活性的影响( x±s)
组别 剂量C/μg· ml-1
AST/U· L-1
3h 6h 12h 24h
正常 - 21.45± 2.92 24.17± 3.21 40.87±6.01 41.00±8.07
BCG+LPS模型 - 57.03± 2.88★ 90.55±10.46★ 101.88±10.71★ 63.34±8.90★
BCG+LPS+Grz低剂量 5 65.15±16.64 59.89± 8.66○ 73.84±10.89○ 37.67±6.16○
BCG+LPS+Grz中剂量 10 48.53±10.34△ 43.55±12.02○△ 60.66±6.05○△ 41.12±16.37○
BCG+LPS+Grz高剂量 20 57.34±9.57 59.68±16.59○□ 55.06±8.17○■ 33.38±7.92○
BCG+LPS+VVP低剂量 5 45.44±10.70 45.06±11.26○ 43.04±10.76○ 32.02±4.70○
BCG+LPS+VVP中剂量 20 55.08±4.65 36.43±8.48○ 34.32±3.54○ 26.28±5.18○
CG+LPS+VVP高剂量 80 31.16±5.80○△◆ 21.62±5.62○■□ 22.09±1.35○■□ 11.84±1.66○■◆
　　与对照组比较 , ★P<0.01;与 BCG+LPS组比较, ○P<0.01;与低剂量组比较 , ■P<0.01, △P<0.05;与中剂量组比较 , ◆P<0.01;n=6
表 2　VVP对大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤后细胞上清液中 ALT活性的影响( x±s)
组别 剂量C/μg· ml-1
ALT/U· L-1
3h 6h 12h 24h
正常 - 3.16±0.58 3.68±0.42 4.68±0.31 3.65±0.53
BCG+LPS模型 - 5.69±0.91★ 7.68±0.74★ 9.43±1.23★ 6.58±0.83★
BCG+LPS+Grz低剂量 5 5.12±1.36 4.08±1.00○ 6.61±1.01○ 3.11±0.59○
BCG+LPS+Grz中剂量 10 3.62±0.73○△ 3.29±1.05○ 5.14±0.85○△ 3.80±1.42○
BCG+LPS+Grz高剂量 20 3.98±0.64○ 4.80±1.65○□ 4.87±0.80○■ 3.20±1.24○
BCG+LPS+VVP低剂量 5 4.35±2.29○ 3.27±1.18○ 4.00±1.18○ 3.06±0.61○
BCG+LPS+VVP中剂量 20 4.83±o.40○ 3.28±0.88○ 3.37±0.57○ 2.83±0.69○
BCG+LPS+VVP高剂量 80 2.84±0.21○△◆ 1.85±0.42○△□ 2.15±0.25○■□ 1.68±0.14○■□
　　与对照组比较 , ★P<0.01;与 BCG+LPS组比较, ○P<0.01;与低剂量组比较 , ■P<0.01, △P<0.05;与中剂量组比较 , ◆P<0.01, □P<0.05;
n=6
3.2　VVP对 BCG+LPS诱导的大鼠原代培养肝细胞上清液中
NO含量的影响 图 1结果显示 ,正常大鼠肝细胞上清液中 NO的
含量随时间的延长基本保持平稳;与正常对照组比较 , BCG+LPS
损伤后模型组大鼠肝细胞上清液中 NO的含量随时间的延长逐
步明显升高 , 在 24 h虽有所下降 ,但仍显著高于正常对照组(P<
0.01)。除低 、中剂量组在 3 h时间点未明显降低 NO含量外 ,
VVP各剂量组在其它各时间点均可不同程度地使升高的 NO含
量下降 , 并存在明显的剂量依赖关系。
4　讨论
多糖广泛分布于多种生物体中 , 尤其是动物细胞膜 、植物和
微生物细胞壁中 , 是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天
然高分子多聚物 , 是构成生命的分子基础之一 [ 5] ,也是一种重要
的信号或信息分子的受体 , 它参与分子识别 、细胞粘附及防御等
生理过程的调节活动 , 具有抗病毒 、免疫促进 、抗肿瘤及降血糖等
作用。因其独特的药理活性和低毒效应 ,在临床应用中具有极大
的潜力。目前 , 对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。
本实验研究结果证实 , VVP各剂量组在 6, 12和 24h均可不
同程度地降低由BCG+LPS诱导引起的原代培养大鼠肝细胞上清
与对照组比较 , ★P<0.01;与 BCG+LPS组比较 , ○P<0.01, ■P<0.05;
与低剂量组比较 , △P<0.01, ◆P<0.05;与中剂量组比较 , □P<0.05
图 1　VVP对大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤后
细胞上清 NO含量的影响( x±s, n=6)
液中转氨酶水平的升高 , 提示 VVP对免疫性肝损伤具有较好的
降酶作用。 NO是许多肝脏疾病中重要的炎性介质之一。据报
道 ,肝细胞在体外可经特异性细胞因子及 LPS协同诱导 , 持续产
生大量的 NO,介导多种病理生理效应 , 包括肝细胞毒性效应 [ 8] 。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 10期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.10　
本实验发现在 BCG和 LPS诱发原代培养大鼠肝细胞损伤致 AST
和 ALT升高的同时 , NO含量也显著高于正常对照组 , 与文献报
道 [ 9]一致 , 表明 NO可能介导了肝细胞毒性效应 , 而 VVP各剂量
组在不同时间点均可不同程度地使 NO生成量减少 ,提示 VVP可
能由于抑制了诱生型 NO的生成而抑制了 AST和ALT的活力 ,显
示出较好的护肝降酶作用。
通过本研究发现琐琐葡萄中多糖含量为 8.19%, 且其对
BCG+LPS诱导引起的原代培养大鼠免疫性肝细胞损伤具有显
著的保护作用 , 提示 VVP作为天然生物活性免疫调节剂具有一
定的开发应用价值。而多糖作为琐琐葡萄的主要活性成分 , 其免
疫调节作用机制还有待于进一步开展深入研究 ,为探明维药琐琐
葡萄发挥药理作用的物质基础及其可能的作用机制提供理论依
据 , 也为充分利用新疆葡萄的资源优势 , 开发出安全 、价廉 、有效
的民族新药提供实验依据。
参考文献:
[ 1] 　新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准(上册)[ S] .乌鲁木
齐:新疆科技卫生出版社 , 1993:347.
[ 2] 　Van-Tol-A, GroenerJE, ScheekLM, etal.Inductionofnetmass
lipidtransferreactioninplasmabywineconsumptionwithdinner[ J] .
EurJclin-Invest, 1995, 25(6):390.
[ 3 ] 　ShapePC, McGrathLT, McCleanE, etal.Efectofredwinecon-
sumptiononlipoprotein(a)andotherriskfactorsforatherosclerosis
[J].QJM, 1995, 88(2):101.
[ 4 ] 　Pace-AsciakCR, HahnSE, DiamandisEP, etal.Theredwinephe-
nolicstransresveratrolandquercetinblockhumanplateletaggregation
andeicosanoidsynthesis:implicationsforprotectionagainstcoronary
heartdisease[ J] .ClinChimActa, 1995, 235:207.
[ 5 ] 　邓小云 ,丁登峰 ,戴美红 , 等.植物多糖药理作用研究进展 [ J] .中
医药导报 , 2006, 12(9):86.
[ 6 ] 　王忠民 ,吴谋成 ,尹经章, 等.葡萄多糖 -2(VLP-2)的分离及其组
成单糖的分析[ J] .河南农业大学学报 , 2003, 37(1):94.
[ 7 ] 　徐淑云 ,卞如濂 ,陈　修.药理实验方法学 ,第 3版 [ M].北京:人民
卫生出版社 , 2002:1354.
[ 8 ] 　王根生 ,刘耕陶.一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用 [ J] .中华医学
杂志 , 1996, 76(3):203.
[ 9 ] 　ZhengQZ, LouYJ.Pathologiccharacteristicsofimmunologicinjuryin
primaryculturedrathepatocytesandprotectiveefectofglycyrrhizinin
vitro[J] .ActaPharmacolSin, 2003, 24(8):771.
收稿日期:2007-11-26;　修订日期:2008-04-03
基金项目:国家自然科学基金(No.30472210)
作者简介:任永丽(1979-),女(汉族),山西灵石人 ,现为天津中医药大学
2005级硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药药理研究工作.
姜黄素对家鸭脂肪肝模型肝脂与血脂的
干预效果及机制研究
任永丽 ,徐宗佩 ,梁汝圣 ,刘　鹏 ,李玉红 ,苏　菁
(天津中医药大学 ,天津　300193)
摘要:目的 考查姜黄素对家鸭脂肪肝模型肝脂 、血脂的干预效果 ,并研究其作用机制。方法 复制家鸭脂肪肝模型 , 并
用姜黄素进行干预 , 考查肝脂 、血脂 、肝脂酶 、肝病理变化 、一般情况 , 并进行统计分析。结果 姜黄素具有降低家鸭脂肪
肝模型肝 TG、血 TG、体重 、肝指数 , 改善肝组织病理的作用 ,其中高 、中剂量组显著低于模型组(P<0.01, P<0.05)。姜
黄素有升高家鸭脂肪肝模型肝脂酶的作用 ,其中高剂量组显著高于模型组(P<0.05)。结论 姜黄素具有降低家鸭脂肪
肝模型肝脂 、血脂的作用 ,且具有剂量依赖性。其作用机制可能与增加肝脂酶活性 ,促进脂质代谢 ,保护肝细胞有关。
关键词:姜黄素;　脂肪肝;　家鸭;　肝脂;　血脂;　肝脂酶
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)10-2327-03
MechanismandInterventionalEffectsofCurcuminonLiverLipidandSerumLipidin
ModelDuckswithFattyLiver
RENYong-li, XUZong-pei,LIANGRu-sheng, LIUPeng,LIYu-hong,SUJing
(TianjinUniversityofTCM, Tianjin300193 , China)Abstract:ObjectiveToobservetheinterventionaleffectsofcurcuminonliverlipidandserumlipidinamodelduckswithfaty
liveranditsmechanism.MethodsDuckmodelwithfatyliverwasestablishedfirstly.Aftertreatmentwithcurcumin, liverlipid,
serumlipid, hepaticlipase, hepaticpathologicalchangesandthegeneralphysicalstatewereobservedinmodelduck.Re-
sultsComparedwiththemodelgroup, highandmediumdoseofcurcumincouldobviouslydecreaselivertriglyceride, serumtri-
glyceride, thebodyweight, liverindexandameliorateliverpathologicalchangesofmodelducks.(P<0.01, P<0.05).Compared
withthemodelgroup, highdoseofcurcumincouldobviouslyincreasetheHLactivitiesofmodelducks, (P<0.05).Conclusion
Curcuminmaydecreaseliverlipid, serumlipidinadose-dependentmannerandthetherapeuticmechanismmayberelatedto
ImprovingtheHLactivities, increasinglipidmetabolismandprotectinglivercels.
Keywords:Curcumin;　Fattyliver;　Duck;　Liverlipid;　Bloodlipid;　HL
　　天津中医药大学张伯礼院士根据中医理论和多年临床经验
建立了治疗脂肪肝的经验效方 “降脂清肝方” 。在前期实验中已
经成功地建立了家鸭脂肪肝模型 , 并对 “降脂清肝方”全方及拆
方进行了实验研究。实验结果表明 “降脂清肝方”全方及拆方中
姜黄 、何首乌具有显著的抗脂肪肝作用。为了深入研究该方的抗
脂肪肝作用 , 本次实验主要考查了姜黄中主要成分姜黄素对家鸭
脂肪肝模型肝脂 、血脂的干预效果及作用机制。现报道如下。
1 　材料与仪器
1.1　动物及分组 45日龄北京鸭 70只 , 雌雄各半 , 由天津市精
武禽类养殖有限公司提供。 采用随机列表法分为 7组 , 每组 10
只 , 即空白对照组(空白组);脂肪肝模型组(模型组);姜黄素高
剂量组(高剂量组);姜黄素中剂量组(中剂量组);姜黄素低剂量
组(低剂量组);水煎姜黄组(姜黄组);东宝甘泰组(东宝组);
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.10 时珍国医国药 2008年第 19卷第 10期