全 文 ：收稿日期:2014-03-27; 修订日期:2014-08-20
基金项目:《中国药典》2015 版一部标准研究项目
作者简介:黄文平(1989-) ，男(汉族) ，江西南昌人，中药固体制剂制造技
术国家工程研究中心实习研究员，学士学位，主要从事天然药物分离及其
质量控制工作．
* 通讯作者简介:张武岗(1979-) ，男(汉族) ，陕西宝鸡人，中药固体制剂
制造技术国家工程研究中心副教授，博士学位，主要从事天然药物研究工
作．
不同产地拳参中没食子酸和绿原酸的含量比较
黄文平1，肖光清2，宋永贵1，2，何明珍1，2，张武岗1，2* ，冯育林1，2，钟国跃2
(1．中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006;
2．江西中医药大学，江西 南昌 330004)
摘要:目的 采用 ＲP － HPLC测定不同产地拳参药材中没食子酸和绿原酸的含量。方法 采用色谱柱:Cosmosil C18(4． 6
mm × 250mm，5μm) ，以乙腈 － 0． 1%磷酸水溶液(10∶ 90)作流动相，流速:1． 0 ml /min;检测波长:274nm;柱温:25℃。结
果 不同产地拳参中没食子酸的含量在 0． 0117% ～1． 0908%;绿原酸的含量在 0． 0270% ～ 1． 5229%。结论 该方法简便、
快速、准确可靠，不同产地拳参中没食子酸和绿原酸含量有较大差异，其中以江西(130711)的含量最高。
关键词:拳参; 没食子酸; 绿原酸; 高效液相色谱法
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 01． 084
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)01-0207-02
To compare Gallic acid and Chlorogenic acid in Polygonum bistorta L． from different are-
as
HUANG Wen-ping1，XIAO Guang-qing2，SONG Yong-gui1，2，HE Ming-zhen1，2，ZHANG Wu-gang1，2* ，FENG Yu-lin1，2，
ZHONG Guo-yue2
(1． Solid Preparation of Traditional Chinese Medicine Manufacturing Technology National Engineering Center，
Nanchang Jiangxi 330006，China;2 Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang Jiangxi
330004，China)
Abstract:Objective To establish an ＲP － HPLC determination of gallic acid in Polygonum bistorta L． from different sources．
Methods Cosmosil C18(4． 6mm × 250mm，5μm) ，methanol － 0． 1 % phosphoric acid solution (10:90 )as the mobile phase;
flow rate:1． 0 ml /min;detection wavelength:274nm;column temperature:25℃ ． Ｒesults The content of gallic acid was in 0．
0117% ～ 1． 0908% and the Chlorogenic acid in 0． 0270% ～ 1． 5229% of Polygonum bistorta L． from different areas．
Conclusion The method is simple，rapid，accurate and Polygonum bistorta L． from different areas of gallic acid and chlorogenic
acid has a bigger difference，with the highest content of Jiangxi (130711)．
Key words:Polygonum bistorta L．; Gallic acid; Chlorogenic acid ; HPLC
拳参为蓼科植物拳参 Polygonum bistorta L．的干燥根茎。春
初发芽时或秋季茎叶将枯萎时采挖，除去泥沙，晒干，去须根。
苦、涩，微寒，归肺、肝、大肠经;清热解毒，消肿，止血;用于赤痢热
泻，肺热咳嗽，痈肿瘰疬，口舌生疮，血热吐衄，痔疮出血，蛇虫咬
伤［1］。临床上具有抗菌、治疗痢疾等作用［2 ～ 6］。2010 年版《中国
药典》一部中拳参项下无含量测定项，虽有文献［7］报道了拳参中
没食子酸和绿原酸的含量测定，但所用的药材比较单一，无法验
证其方法的可行性，本文在对其方法进行改进基础上，对不同产
地拳参中没食子酸和绿原酸含量进行测定，即比较了不同产地拳
参药材质量，又为 2015 年版《中国药典》拳参含量测定项的建立
提供基础研究。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪系列，AUW220D 型电子天平(十万分之一，
日本岛津公司) ;BS224S 型电子天平(万分之一，Sartorius) ;
KQ250DB型数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限责任公
司) ;KQ5200 型水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)。
没食子酸对照品(批号:M05 － 20130113，中国食品药品检定
研究所) ，绿原酸对照品(批号:L07 － 20131115，中国食品药品检
定研究所) ，乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。
本实验收集到不同批次的拳参样品共 10 批(见表 1) ，样品
经江西中医药大学钟国跃教授鉴定为拳参植物 Polygonum bistor-
ta L．
表 1 10 批拳参药材
批号 产地 批号 产地
130602 江西 130825 安徽
130711 江西 130825 安徽
130712 安徽 130906 云南
130712 安徽 130825 江西
130825 河南 131011 江西
2 方法与结果
2． 1 拳参药材供试品溶液 取拳参药材粉末 0． 3g，精密称定，置
具塞锥形瓶中，精密加 20%乙醇 25ml，称重，放置过夜，超声提取
40min，称重，用 20%乙醇补足减失重量，抽滤，滤液经 0． 45μm微
孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
2． 2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、绿原酸对照品适量，
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加重蒸水分别制成每毫升各含没食子酸 1． 32mg、绿原酸 9． 8mg
的溶液，按不同比例进行稀释，即得。
2． 3 色谱条件 色谱柱:Cosmosil C18(4． 6mm × 250mm，5μm) ;流
动相为乙腈 － 0． 1%磷酸溶液(10∶ 90) ;检测波长 274nm;体积流
量 1． 0ml /min，柱温 25℃。理论塔板数按没食子酸计算不低于
1000，绿原酸不低于 2000。如图 1 ～ 2。
图 1 没食子酸和绿原酸混合对照品 HPLC图
图 2 拳参供试品溶液 HPLC图
由图 1 ～ 2 可见，拳参药材供试品溶液中没食子酸保留时间
约为 5min，绿原酸保留时间约为 18min，两者与相邻峰的分离度
均大于 1． 5，对称性接近于 1，可用于定量分析。
2． 4 线性关系试验 精密吸取没食子酸和绿原酸混合对照品溶
液 10μl注入液相色谱仪中，按“2． 3”项下色谱条件测对照品峰面
积，将样品浓度与峰面积进行回归处理，回归方程为:没食子酸
为:Y = 2000734858． 8158X － 2874． 6529，r = 0． 9998(n = 5) ，没食
子酸对照品在 0． 002112 ～ 0． 66mg /ml 范围内进样量与峰面积呈
良好的线性关系;绿原酸为:Y = 762318066． 8558X － 18179． 5071，
r = 0． 9998(n = 5) ，绿原酸对照品在 0． 001568 ～ 0． 49mg /ml 范围
内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2． 5 精密度试验 精密吸取没食子酸和绿原酸混合对照品溶液
10μl，按“2． 3”项下色谱条件，重复进样 6 次，测定混合对照品溶
液中没食子酸和绿原酸峰面积值，结果显示没食子酸 ＲSD 为
0． 56%，绿原酸 ＲSD为 0． 55%。表明仪器的精密性较好。
2． 6 稳定性试验 取供试品溶液，精密吸取供试品溶液 10μl，按
“2． 3”项下色谱条件，在 12 h内每隔 1 h或 2 h或 4 h，测定供试
品溶液中没食子酸和绿原酸峰面积值，结果显示没食子酸的 ＲSD
为 1． 34%，绿原酸的 ＲSD 为 0． 91%。表明供试品在 12 h 内稳
定。
2． 7 重复性试验 取已知含量拳参药材 0． 3g，共 6 份，照“2． 1”
项下实验方法制成供试品溶液，按“2． 3”项下色谱条件进行测
定，计算溶液中没食子酸和绿原酸的含量，结果显示没食子酸平
均含量为 0． 57%(ＲSD 为 0． 98%) ;绿原酸平均含量为 0． 41%
(ＲSD为 0． 46%)。表明该方法重现性良好。
2． 8 平均加样回收率试验 称取已知含量的样品约 0． 3g 6 份，
精密称定，置具塞锥形瓶中，按 80%、100%、120%的量加入没食
子酸和绿原酸对照品，按照“2． 1”项下实验方法制成供试品溶
液，测定溶液中没食子酸和绿原酸的含量，计算回收率。结果见
表 2 ～ 3。
2． 9 样品的含量测定 取 10 批不同拳参药材，分别照“2． 1”项下
方法平行制备供试品溶液，按“2． 3”项下色谱条件进行测定，每
份进样 3 次，计算各没食子酸和绿原酸含量的质量分数。结果见
表 4。
表 2 没食子酸加样回收率
样号
样品中没
食子酸量 /mg
加入没食子
酸量 /mg
测出没食子
酸含量 /mg
回收率
/%
统计处理
1 0． 0529 0． 0042 0． 0953 100． 38
2 0． 0531 0． 0042 0． 0953 99． 34 珋x =100． 92%
3 0． 0536 0． 0536 0． 1079 101． 14
4 0． 0529 0． 0529 0． 1077 103． 53 ＲSD =1． 40%
5 0． 0540 0． 0635 0． 1193 100． 72
6 0． 0529 0． 0635 0． 1167 100． 4
表 3 绿原酸加样回收率
样号
样品中绿
原酸量 /mg
加入绿原酸
/mg
测出绿原酸量
/mg
回收率
/%
统计处理
1 0． 1244 0． 0995 0． 2224 98． 54
2 0． 1249 0． 0999 0． 2230 97． 84 珋x =100． 85%
3 0． 1262 0． 1262 0． 2540 101． 16
4 0． 1245 0． 1245 0． 2537 103． 66 ＲSD =2． 54%
5 0． 1271 0． 1526 0． 2802 99． 97
6 0． 1245 0． 1494 0． 2799 103． 95
表 4 10 批拳参药材中没食子酸和绿原酸含量测定结果
样品 批号 产地
没食子酸含量
/%
绿原酸含量
/%
拳参 1 130602 江西 0． 0117 0． 1749
拳参 2 130711 江西 1． 0908 1． 5229
拳参 3 130712 安徽 0． 0196 0． 0462
拳参 4 130712 安徽 0． 0394 0． 3132
拳参 5 130825 河南 0． 0945 0． 3689
拳参 6 130825 安徽 0． 0512 0． 0808
拳参 7 130825 安徽 0． 0339 0． 1311
拳参 8 130906 云南 0． 0411 0． 0892
拳参 9 130825 江西 0． 0313 0． 5034
拳参 10 131011 江西 0． 0130 0． 0270
3 讨论
根据指示性成分的理化性质，考察了 50%甲醇、70%甲醇以
及 20%乙醇作为溶媒对测定结果的影响，结果发现采用 20%乙
醇作为溶媒，没食子酸和绿原酸的保留率相对较佳;比较了超声
提取、冷浸法及冷浸过夜后超声进行没食子酸、绿原酸提取的考
察，发现冷浸过夜后超声没食子酸和绿原酸的溶出率大。经试用
乙腈 － 0． 1%磷酸(10∶ 90) ，甲醇 － 0． 5%磷酸(20∶ 80) ，甲醇 －
0． 4%醋酸(25∶ 75)作为流动相进行筛选，比较其分离效果与基
线平稳状态，结果确定乙腈 － 0． 1%磷酸(10 ∶ 90)作为流动相。
综上确定了供试品溶液的制备方法及流动相组成。采用二极管
阵列检测器对检测波长进行选择，结果表明，检测波长为 274nm
时，混合对照品吸收较良。
经过比较，江西(130711)含没食子酸和绿原酸最大(没食子
酸为 1． 0908%，绿原酸为 1． 5229%) ，其次是河南(没食子酸为
0． 0945%) ，江西(绿原酸为 0． 1749%)。由以上四个产地可得，
不同产地拳参中没食子酸和绿原酸含量皆有差异，有的没食子酸
含量高，绿原酸含量却低，同样的，绿原酸含量高的药材，没食子
酸含量又低。对于评价药材的质量，本文所选的指示性成分略有
不足，药材含量未随指示性成分发生正性改变，也可能由于所选
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 1
药材批次少;同时不同地域的差异，也会导致药材所含的有效成
分有一定的差异，因此，对临床用药时，选择药材的道地属性及质
量的优劣具有一定的意义。本实验通过高效液相色谱法建立了
拳参中没食子酸和绿原酸测定方法，并测定了四个产地 10 批次
药材中没食子酸和绿原酸的含量，该含量测定方法准确、简便、灵
敏、重复性好、精密度高;对用药来源的选择提供了一定的依据。
参考文献:
［1］ 肖培根． 新编中药志，第二卷［M］． 北京:化学工业出版社，2002:
487．
［2］ 曾 靖，黄志华，叶和杨，等． 拳参正丁醇提取物中枢抑制作用的
研究［J］． 赣南医学院学报，2003，23(4) :359．
［3］ 黄玉珊，曾 靖，叶和杨，等． 拳参正丁醇提取物的镇痛作用的研
究［J］． 赣南医学院学报，2004，24(1) :12．
［4］ 曾 靖，单热爱，钟 声，等． 拳参水提取物镇痛作用的实验观察
［J］． 中国临床康复，2005，9(6) :80．
［5］ 叶和杨，黄志华，汪秀荣，等． 拳参正丁醇提取物保护大鼠心肌缺
血再灌注损伤的剂量依赖性效应［J］． 中国临床康复，2005，9
(38) :118．
［6］ 屈良斋． 复方拳参片治疗胃十二指肠炎及溃疡 255 例疗效观察
［J］． 中级医刊，1985，9:49．
［7］ 刘 瑞，何方奕，李 磊，等． 高效液相色谱法同时测定拳参药材
中没食子酸和绿原酸的含量［J］． 药物分析杂志，2005，25(4) :
390．
收稿日期:2014-02-27; 修订日期:2014-10-20
基金项目:广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项(No． GZPT1206) ;
广西自然科学基金创新研究团队项目
(No． 2011GXNSFF018006)
作者简介:朱 华(1959-) ，男(汉族) ，广西柳州人，广西中医药大学教授，
博士学位，主要从事中药品种、品质及资源开发研究工作．
* 通讯作者简介:王孝勋(1973-) ，男(汉族) ，湖南常德人，广西中医药大
学副教授，博士学位，主要从事中药品种、品质及资源开发研究工作．
对叶百部基因组 DNA提取及 ISSＲ － PCＲ体系优化
朱 华，周雨晴，杜沛霖，王孝勋*
(广西中医药大学，广西 南宁 530022)
摘要:目的 建立适合对叶百部基因组 DNA提取方法及 ISSＲ － PCＲ最佳反应体系。方法 通过改良的 CTAB法提取对叶
百部基因组 DNA，并采用正交试验设计方法对影响 ISSＲ － PCＲ反应体系的 5 种因素(dNTP、模板 DNA、引物、Mg2 +和 Taq
聚合酶)4 个水平进行正交试验，优化 ISSＲ － PCＲ反应体系。结果 确立了对叶百部最佳反应体系，即在 20μl的总反应体
积中含有 10 × PCＲ buffer 2μl，dNTP 175μmol /L，Mg2 + 1． 7mmol /L，引物 0． 6μmol /L，Taq 酶 1． 0U，模板 DNA 15ng。结论
建立并优化了对叶百部基因组 DNA 提取方法及 ISSＲ － PCＲ反应体系。
关键词:对叶百部; DNA提取; ISSＲ; 正交设计; 体系优化
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 01． 085
中图分类号:Ｒ284． 2;S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)01-0209-02
对叶百部 Stemona tuberosa Lour．为百部科百部属植物［1］，是
《中国药典》所收载的中药百部 3 个来源品种之一［2］。百部在我
国药用历史悠久，为中医临床常用中药，主要用途为内服止咳、外
用杀虫［3］。据王孝勋［4］进行的百部商品调查显示:百部在国内
各大药市均有销售，其中以对叶百部(大百部)居多。但对叶百
部基本野生，由于破坏性采收以及生态环境的破坏，资源锐
减［5］。因此有必要对对叶百部进行系统的遗传多样性分析，保
护现有的对叶百部野生资源，并进行繁殖研究，该工作具有重要
的生态和经济意义。
简单重复序列间区 (Inter － Simple Sequence Ｒepeat，ISSＲ)
是由 Zietkiewicz等于 1994 年创建的一种新型分子标记技术，与
ＲFLP 和 ＲAPD 技术相比有更高的重复性和稳定性，具有多态性
高、稳定性好、产物特异性强、及操作简单等特点［6］，现已广泛应
用于药用植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性
与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、分子标记辅助育种等
方面研究［7］。由于 ISSＲ主要是由单一引物且以重复序列为主要
引物序列的 PCＲ标记，所以其反应体系易受到 Taq DNA聚合酶、
Mg2 +、引物、模板浓度、dNTP 等因素的影响，建立最佳的 ISSＲ －
PCＲ反应体系对保证试验结果的准确可靠非常重要。
1 材料
1． 1 药材 用于优化体系的为对叶百部嫩叶，2013 年 5 月采自
广西药用植物园，经广西中医药大学中药鉴定教研室王孝勋副教
授鉴定为对叶百部 Stemona tuberosa Lour．。
1． 2 试剂 ISSＲ引物由上海生工合成，Taq DNA聚合酶、dNTPs、
Marker 2000(TaKaＲa －公司 )。经初步筛选将引物 U826［(AC)
8C］作为此次正交试验的引物。
2 方法
2． 1 基因组 DNA的提取 本实验参考改良的 CTAB法［8］提取基
因 DNA。方法适当改进如下:①剪取 1 ～ 2g对叶百部嫩叶放在研
钵中，加 PVP适量，加液氮研磨成粉末;②将粉末转入 2． 0ml 离
心管中，加入 800μl 2% CTAB缓冲液混匀;③65℃水浴 40min，每
隔 10min振摇一次;④取上清液转至新离心管中，加入 1000μl 的
氯仿∶ 异戊醇(24∶ 1) ，颠倒混匀，10000r /min 离心 5min;⑤重复
④操作 1 次;⑥取上清液加入 2 倍体积经 － 20 ℃预冷的无水乙
醇混匀，－ 20℃ 冰箱沉淀 DNA 30min;⑦4℃ 10000r /min 离心
10min，弃上清，沉淀用 70%乙醇漂洗 2 次;⑧室温干燥后 DNA溶
于 200μl 1 × TE中，4℃ 贮存备用。
2． 2 对叶百部基因组 DNA质量检测 使用 1． 5% 琼脂糖凝胶电
泳和紫外分光光度计检测 DNA 纯度与浓度，并将提取的 DNA 稀
释到 60ng /μl备用。
2． 3 ISSＲ － PCＲ反应体系的正交试验设计与扩增程序 采用 L16
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