全 文 ：毛茛总苷对血管紧张素 Ⅱ致心肌肥大的影响
王榕乐 ,谭毓治 (广东药学院 药理学教研室 ,广东 广州 510006)
摘要:目的 研究毛茛总苷对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大的影响。方法 采用正交试验设计法考察 AngⅡ浓度 、心肌
细胞密度和 AngⅡ干预时间对心肌肥大模型构建的影响 , 确定心肌肥大模型的构建条件 , 考查毛茛总苷对 AngⅡ诱导的心肌
肥大的影响。结果 心肌肥大模型的条件为:AngⅡ浓度为 1 μmol· L-1 ,心肌细胞密度为 2×105个· mL-1 , AngⅡ干预时间为
48 h。 50 、100 、200μg· mL-1毛茛总苷有抑制 AngⅡ诱导的心肌肥大的作用。结论 毛茛总苷有抗心肌肥大的作用。
关键词:毛茛总苷;心肌肥厚;血管紧张素Ⅱ;正交试验
中图分类号:R965　文献标识码:A　文章编号:1006-8783(2008)02-0154-03
EffectsofranunculinonangiotensinⅡ-inducedmyocardialhypertrophy
WANGRong-le, TANYu-zhi
(DepartmentofPharmacology, GuangdongpharmaceuticalUniversity, Guangzhou, Guangdong510006 , China)
Abstract:ObjectiveTostudyefectsofangiotensinⅡ-inducedmyocardialhypertrophyoftotalglycosidesofRanunculusjaponicus.
MethodsOrthogonalexperimentwasusedtoinvestigateeffectsofthreefactors(concentrationofangiotensinⅡ , thedensityof
cardiocytes, andoptimaltimeofinterventionbyangiotensinⅡ)onestablishmentofmyocardialhypertrophymodel.Andefectof
ranunculinonangiotensinⅡ-inducedmyocardialhypertrophywerestudiedaftermyocardialhypertrophymodelwasestablished.Results
TheconditionsformyocardialhypertrophymodelincludeconcentrationofangiotensinⅡ:1μmol· L-1 , thedensityofcardiocytes:2×
10
5 · mL-1 , andoptimaltimeofinterventionbyangiotensinⅡ:48 h.50, 100μg· mL-1 , ranunculinat200μg· mL-1 inhibitedthe
processofmyocardialhypertrophyinducedbyangiotensinⅡ.ConclusionRanunculinhadtheinhibitingeffectonmyocardial
hypertrophy.
Keywords:ranunculin;myocardialhypertrophy;angiotensinⅡ;orthogonalexperiment
基金项目:广东省科技厅课题(2004B30101002 ), 广东中医
药局课题(1040083)
作者简介:王榕乐(1982 -), 男 , 硕士 , 现在中山大学中山医
学院工作;通讯作者:谭毓治(1956-), 男 , 教授 ,
硕士生导师 , 主要从事药物筛选与新药研究。 E-
mail:tanyuzhi@163.com。
　　心肌肥厚是高血压病最常见的并发症之一 ,但
其发病机制迄今尚不十分清楚。现已明确 ,血管紧
张素Ⅱ (angiotensinⅡ , AngⅡ)、肾上腺素受体激
动剂 、内皮素 -1及某些细胞因子是导致心肌肥大的
重要因子[ 1] ,循环血中和 /或心肌局部 AngⅡ是引
起心肌细胞肥大和引起心肌成纤维细胞增殖致心肌
纤维化的最重要活性物质 [ 2, 3 ] ,该作用可被血管紧
张素 Ⅱ受体亚型 1 (AT1)拮抗剂所阻断 。毛茛总
苷对 AngⅡ所致心肌肥大有无影响 ,尚未见报道 。
为此 ,本实验利用体外细胞培养技术 ,用血管紧张素
Ⅱ构建心肌肥大模型 ,观察毛茛总苷对血管紧张素
Ⅱ致心肌肥大影响。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂 　酶标仪 (850型 , Biotech
Laboratories), AngⅡ (Sigma, 批号:125K51011), Ⅱ
型胶原酶(Invitrogen,批号:DH071), 5-溴脱氧尿嘧
啶(5-BrdU, Roche, 批号:280879), 磺基罗丹明 B
(Sigma-Aldrich,批号:3520-42-1)。
1.2　实验动物　SD乳鼠(出生 1 ～ 3 d),由广东省
医学实验动物中心提供 ,许可证号:SCXK(粤)2003
-002,粤监证字 2005A010。
1.3　药物制备　毛茛全草晾干切碎 , 85%(φ)乙醇
回流提取 3次 ,过 80目筛 ,合并提取液 ,减压浓缩回
收溶剂 ,等体积的醋酸乙酯萃取若干次至醋酸乙酯
层为浅绿色。下层(水层)蒸干溶剂 ,得膏状物经 D
-101大孔树脂吸附 ,水洗 ,弃去 ,再用纯乙醇洗脱 ,
收集此部位 ,蒸干乙醇得膏状物即毛茛总苷。毛茛
总苷原液配制:取毛茛总苷膏状物用 DMEM培养液
溶解 ,配制成 5, 10, 20 mg· mL-1的原液 ,无菌过
154
第 24卷第 2期 广　东　药　学　院　学　报 Vol.24 No.2
2008年 4月 JOURNALOFGUANGDONGCOLLEGEOFPHARMACY Apr.2008
滤 ,备用。
1.4　细胞分离和培养 [ 4] 　用 75%(φ)酒精消毒乳
鼠 ,在无菌工作台中取其心脏 , 放入预冷的 D-
Hanks液中 ,剔除心脏周围的肺 、大血管及结缔组
织 ,剪碎心脏至沙粒状 。加胰酶和胶原酶混合消化 ,
37 ℃, 6min,用小牛血清终止消化 ,静置片刻 ,吸去
上清。再加入等体积消化酶继续消化 ,收集上清 。
如此连续消化多次 ,收集所有的上清 , 1 000 r/min
离心 ,弃去上清 ,用 D-Hanks液再悬浮细胞 , 1 000 r/
min离心 ,弃去上清 。收集沉淀 ,用 10%(φ)胎牛血
清混悬 ,过 120目细胞筛 ,接种至培养瓶中培养 2 h
后 ,吸出上清 ,调整细胞密度到 1×105 ～ 4×105个
· mL-1 ,加 0.1mmol·L-1 BrdU(终浓度)。细胞培
养 72h后换成低血清培养基培养 24 h即可进行下
面的实验。
1.5　心肌肥大模型的构建　用正交实验设计法 [ 5]
考查细胞密度 , AngⅡ浓度和 AngⅡ干预时间 3个
因素对肥大心肌细胞的影响 ,确定心肌细胞肥大模
型构建的最佳条件 。实验重复 2次 。具体方法如
下:将细胞接种至 96孔中 ,分成 9个组 ,按照上述正
交实验设计法确定的方案对细胞加药处理 。细胞培
养若干时间后 ,取出 96孔板 ,吸走培养基 ,采用 SRB
染色法 [ 6]并用酶标仪测定吸光度 A值 。
1.6　形态学鉴定　将细胞按照上述实验得到的密
度培养在底部置有 2cm×2cm载玻片的直径为 3.5
cm的培养皿中 ,分成 3个组:(1)正常组:不加任何
药物处理;(2)模型组:加 AngⅡ孵育;(3)药物组:
同时加 AngⅡ和洛沙坦处理 ,洛沙坦的终浓度均为 1
μmoL·L-1 ,干预 48 h。苏木素 -伊红染色 ,拍照 ,
从形态学角度观察细胞的肥大程度。
1.7　抗心肌细胞肥大药物筛选　心肌细胞接种培
养至 96孔板中 , 72h后 ,培养液换成 5%(ρ)FBS培
养 24 h,对细胞分组(每组设 8个复孔)加药干预:
(1)正常组(加等体积的 DMEM);(2)肥大模型组:
AngⅡ终浓度为 1 μmol· L-1 , (3)洛沙坦组:同时加
AngⅡ和洛沙坦 ,终浓度均为 1μmol· L-1;(4)毛茛
总苷组:AngⅡ终浓度均为 1 μmol· L-1 , 毛茛总苷
浓度均为 50 、100 、200 μg· mL-1 ,加药干预 48 h
后 ,采用 SRB染色法考查各组细胞吸光度值 。实验
重复 3次。
1.8　统计学处理　所有数据均以 x±s表示 ,统计
学处理采用 t检验 ,以 P<0.05为差异有显著性。
2　结果
2.1　构建心肌肥大模型的最佳条件
表 1　9次试验的吸收值
Tab.1　Absorbancesofninetests
序
号
A
(AngⅡ)
B
(细胞密度)
C
(培养时间)
吸光度
(A)
1 1 1 1 0.269 5
2 1 2 2 0.472 6
3 1 3 3 0.370 2
4 2 1 2 0.271 5
5 2 2 3 0.376 0
6 2 3 1 0.394 2
7 3 1 3 0.230 7
8 3 2 1 0.520 3
9 3 3 2 0.502 3
T1 1.112 3 0.771 7 1.184 0
T2 1.041 7 1.391 9 1.246 4
T3 1.276 3 1.266 7 0.960 9
ΔT1 0.370 7 0.257 2 0.394 7
ΔT2 0.347 2 0.464 0 0.415 5
ΔT3 0.425 2 0.422 2 0.320 3
R 0.078 0.206 8 0.095 2
　　表 1结果表明:以 R值大小来判断主次因素 ,
细胞密度是主要因素 ,依次是加药培养时间和 Ang
Ⅱ浓度。最佳条件为 A3B2C2 ,即 AngⅡ浓度为 10-6
mol·L-1 ,细胞密度为 2×105 · mL-1 ,加药干预培
养时间为 48h。这个组合在正交表中未出现 ,为了
证明其可靠性 ,按 A3B2C2条件进行试验 ,试验结果
得到的吸光度值为:0.543 3,比表 1中任何一组试
验得到的吸光度值都大 ,证明所得到的最佳条件是
可靠的。
2.2　HE染色结果(20×10)
从 HE染色结果可以看出 ,由血管紧张素 Ⅱ诱
导的肥大心肌细胞(图 1B)的表面积比正常组显著
增大 ,肥大心肌细胞经洛沙坦干预 48h,心肌细胞表
面积基本恢复至正常水平(图 1C)。
2.3　毛茛总苷抗心肌肥大作用研究
各组细胞经 1 μmol· L-1的 AngⅡ孵育 48 h
后 ,经 SRB染色的 A值明显比正常组大 , 表明经
AngⅡ诱导后的细胞总蛋白含量增高 ,即心肌细胞
经过 1 μmol· L-1的 AngⅡ孵育 48 h后 ,细胞发生
了肥大。毛茛总苷 50 、100 、200 μg·mL-1均具有
显著抑制心肌肥大的作用 ,与模型组比较 ,差异有显
著性(P<0.01)。见表 2。
155
第 2期　王榕乐 ,等.毛茛总苷对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大的影响
A正常细胞组;BAngⅡ诱导的肥大细胞组;C洛沙坦治疗组
图 1　乳鼠心肌细胞的苏木素 -伊红染色图(20×10)
Fig.1　Hematoxylin-eosinstainingofcardiocytesfromneonatalSDrats
表 2　毛茛总苷对肥大心肌细胞的抑制作用
Tab.2　Inhibitoryeffectofranunculinonhypertrophic
myocardialcell( x±s)
　　组别 A
DMEM对照组 0.410±0.057
模型组 0.520±0.056＊＊
洛沙坦(10 -5 mol· L-1) 0.434±0.067##
毛茛总苷(50 μg· mL-1) 0.429±0.0167##
毛茛总苷(100μg· mL-1) 0.387±0.032##
毛茛总苷(200μg· mL-1) 0.358±0.036##
与 DMEM对照组比:＊＊P<0.01;与模型组比:##P<0.01
3　讨论
本实验采用胰蛋白酶 、胶原酶混合消化法及差
速贴壁法 ,培养 48 ～ 72 h,即可得到搏动性和贴壁良
好的心肌细胞。文献 [ 4]表明用此分离培养方法得到
的心肌细胞可以用来构建心肌肥大模型。
心肌细胞是一种高度分化的终末细胞 ,一般情
况下不能增殖 ,伴有体积或长度的增加。心肌肥大
是心肌细胞和间质细胞对神经体液因素或机械牵张
所作出的应答反应 ,这些神经体液因素包括血管紧
张 素 Ⅱ (angiotensin Ⅱ , AngⅡ )、 内 皮 素 -1
(endothelin-1, ET-1)、儿茶酚胺类递质 、胰岛素样生
长因子 -1(insulin-likegrowfactor-1)、肿瘤坏死因子 -
α等 ,这些是心肌肥大发生发展的正性调控因素。
其相应的受体则成为目前心肌肥大防治的主要靶分
子 。血管紧张素 Ⅱ与其Ⅰ型受体(AT1)结合后能够
直接诱导心肌细胞肥大。心肌细胞肥大后在形态上
表现为体积的增大 ,内在表现为细胞内的总蛋白含
量 、蛋白合成量和 DNA合成量增加。
磺基罗丹明 B(SRB)[ 7]是一种蛋白结合染料 ,
可与碱性氨基酸结合而显色 ,呈现一种明亮的粉红
色 ,用酶联免疫检测仪测定吸光度 ,可提供一个敏感
的细胞蛋白含量的数值。SRB法避免使用放射性元
素 ,实验方法与 MTT法比较 ,操作所需时间更短 ,检
测更灵敏[ 8] ;与传统的考马斯亮蓝法 、双缩脲法和
lory-酚试剂法相比 ,操作方法更加简单 ,敏感度高。
本文用 SRB对心肌细胞染色 ,以测定其吸收值 ,间
接反映细胞内的总蛋白含量 ,观察毛茛总苷对肥大
心肌细胞的影响 。根据正交实验设计和 HE染色检
测确定肥大模型构建的最佳方案 ,并以此模型。结
果显示 50 、100 、200 μg· mL-1毛茛总苷具有显著
的抗心肌肥大作用 ,与 10-5mol· L-1洛沙坦抑制效
应相当 。
本实验结果表明 ,毛茛总苷在体外能抑制心肌
肥大 ,为毛茛抗心肌肥大提供了实验基础 ,至于是什
么成分以及毛茛总苷在相应的整体动物模型中的作
用如何 ,还有待于进一步研究。
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(收稿日期:2008-03-05;修回日期:2008-04-02)
156
广东药学院学报 , 2008, 24(2)