全 文 ：收稿日期:2008-03-11
基金项目:信阳师范学院校青年科研基金项目(20070206)
作者简介:王玲(1980-), 女, 河南信阳人 ,硕士, 主要从事生
物化学及植物多样性方面的研究 , E-mail:wang-
ling1080@163.com
莲座蕨 ISSR—PCR扩增条件优化的研究
王 玲
(信阳师范学院 生命科学学院 ,河南 信阳 464000)
摘 要 以披针莲座蕨为材料 ,对 PCR-ISSR扩增条件中的各个因素进行了多梯度的优化研究 ,建立了引物浓度 1.3
mmol/L, Mg2 +浓度为 1.5 mmol/L, dNTP浓度为 0.2mmol/L, Taq聚合酶浓度为 2U, DNA模板用量为 32 ng/μL的最
佳扩增条件。
关键词 蕨;ISSR;反应体系
中图分类号:Q949.36+6.3 文献标识码:A 文章编号:1006-9690(2008)06-0047-03
OptimizationofISSR-PCRAmplification
inAngiopteriscaudatiformisHieron
WangLing
(SchoolofLifeScience, XinyangNormalColege, Xinyang464000, China)
Abstract ResearchesonthefactorsefectingamplicicationconditionsofISSRsuggestedthatin25μLre-
actionvolume, thebestonewasasfolows:1.3mmol/Lofprimer, 1.5mmol/LMg2+, 0.2mmol/LofDntp,
2UofqualifiedTaqDNApolymeraseand32ng/μLDNA.DNAisextratedfromAngiopteriscaudatiformis.
Keywords fern;ISSR;reactionsystem
1985年 ,由美国 PE-Cetus公司人类遗传实验室
Mulis等发明了具有划时代意义的多聚酶链式反应
(Polymerasechainreaction,简称 PCR)[ 1] 。以后在此
基础上发展各种利用该技术的 DNA分子标记技术。
1994年加拿大蒙特利尔大学的 Zietkiewicz提出 ISSR
(inter-simplesequencerepeat,简单重复序列),它用
锚定的微卫星 DNA为引物 ,即在 SSR序列的 3′端或
5′端加上 2 ～ 4个随机核苷酸 ,在 PCR反应中 ,锚定引
物可以引起特定位点退火 ,导致与锚定引物互补的间
隔不太大的重复序列间 DNA片段进行 PCR扩增。
所扩增的 interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺
凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨 ,扩增带多为
显性表现。按照扩增阳性(1)和扩增阴性(0)记录电
泳带谱 ,形成原始数据数阵。 ISSR具有下列优点:
(1)实验操作简单 、快速 、高效 ,不需要繁琐的构建基
因文库 、杂交和同位素显示等步骤;(2)扩增基因组
DNA,适用于任何富含 SSR重复单元和 SSR广泛分
布的物种 ,可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星
座位个体间变异的信息 。(3)遗传多态性高 ,重复性
好。ISSR标记技术采用了较长的引物(17 ～ 24 bp),
退火温度高 ,因此 ,引物具有更强的专一性 ,与模板结
合的强度提高 ,降低了杂带的干扰 ,随之提高了实验
结果的可重复性。(4)ISSR标记为显性标记 ,符合孟
德尔遗传规律 。(5)无需知道任何靶标序列的 SSR
背景信息 。ISSR标记技术在引物设计上比 SSR标记
技术简单得多 ,不需要知道 DNA序列即可以用引物
进行扩增 ,又可以揭示比 RFLP、RAPD和 SSR更多的
多态性。其引物可基于任何在微卫星位点发现的
SSR重复单元(2 ～ 4个核苷酸等),并且侧翼靶标简
单序列重复的任何一端均能够锚定基因组序列 。(6)
ISSR标记技术结合了 RAPD标记技术和 SSR标记技
术的优点 ,耗资少 ,模板 DNA用量少。因此 ISSR被
广泛用于植物分类 、进化和遗传多样性的分析 、遗传
—47—
第 27卷第 6期
2008年 12月 中 国 野 生 植 物 资 源ChineseWildPlantResources Vol.27 No.6Dec.2008
连锁图谱的构建 、基因定位 、种质资源鉴定 [ 2-3] 。
由于 ISSR技术也是基于 PCR的一种标记 ,所以
如同 RAPD标记一样 ,其反应条件易受各种因素的干
扰 , 如模板 DNA、TaqDNA聚合酶 、dNTP以及 Mg2+
的浓度等都能影响 ISSR的结果。若许多因子的条件
不适合则导致图谱弥散状背景的产生 、扩增产物的消
失以及电泳谱带位置的改变。这些现象都影响 ISSR
的扩增结果 ,从而影响整个实验的结果。本文以披针
莲座蕨(AngiopteriscaudatiformisHieron)为材料 ,探索
在 ISSR中 ,各种条件同产物之间的变化的规律 ,以获
得最佳的反应条件 ,为利用 ISSR方法进行生物学研
究提供一些参考 。
1 材料与方法
1.1 材料采集与处理
实验材料采自云南西双版纳植物园 、金平县等
地。采集的叶片用硅胶保存于密封的的塑料袋内 ,于
室温下保存 ,定时检查 、更换袋中的硅胶。叶片干燥
后连同密封袋放入 -20℃(-70 ℃保存效果更好)
冰箱中保存 ,以防 DNA降解。
1.2 DNA提取
采取改进的 CTAB法提取基因组 DNA[ 4] 。 DNA
经蛋白质及核酸含量测定仪测定浓度后放于 4℃冰
箱中待用。
1.3 PCR-ISSR扩增反应体系和程序
鉴于 ISSR的稳定性 , PCR在 eppendofPCR仪上
进行 ,聚合酶 , Mg2+和缓冲液购自宝生物公司 ,引物由
上海生工合成 ,反映体系为 25 μL, Mg2+浓度设为
0.9、1.2、 1.5、 1.8、 2.1mmol/L5个梯度 , dNTP设
0.16、0.20、 0.24、0.40mmol/L4个梯度 , 引物设为
0.65, 0.98, 1.3mmol/L, DNA模板设 24, 36, 48, 60,
72ng/μL, Taq酶设 0.5, 1, 2, 3U4个浓度梯度。扩增
程序为:第一阶段 , 94 ℃, 5 min;第二个阶段:94 ℃,
45s;50 ～ 52 ℃, 1min;72 ℃, 1min, 38个循;第三个
阶段:72℃, 5min, 4℃保存。
1.4 ISSR扩增片段的检测
扩增的 PCR产物用 1.5%的琼脂糖凝胶 (含
0.5%溴化乙锭)电泳检测 ,用 UV凝胶成像系统进行
凝胶成像。
2 结果与分析
2.1 缓冲体系 、Mg2+和 dNTP
缓冲体系主要是维持体系的 pH条件 ,不同厂家
生产的聚合酶最适 pH值不同[ 3] 。DNA聚合酶需要
Mg2+激活 , Mg2+的浓度对 Taq酶活性 、引物的退火 、模
板与 PCR产物的解链温度 、产物的特异性等都有影
响[ 5] 。Mg2+浓度过低 , Taq酶活性降低;Mg2+浓度过
高则会使引物错配频率增加。
实验中发现:Mg2+在 0.9、 1.2、 1.5、 1.8、 2.1
mmol/L浓度变化范围内均有扩增产物 ,只是各种扩
增片断的产量 、亮度有差异 ,随着浓度的增大或减少 ,
产物的特异性提高。
dNTP是 PCR反应的原料 ,在反应中能熬合体系
中游离的 Mg2+,从而影响体系中游离 Mg2+浓度 ,故
dNTP浓度变化对扩增产物的影响较大 ,试验中发现 ,
dNTP在 0.16、0.20、0.24、0.40 mmol/L,浓度范围内
都有扩增带 ,条带的清晰度 、多少有差异。
—48—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 27卷
2.2 引物
在 ISSR-PCR反应中 ,引物的种类是特定的物
种和特定的反应体系来确定的 ,一旦反应体系或研究
类群改变 ,引物也就有所改变 ,筛选恰当地引物能提
高体系的稳定性 [ 6] 。图 3:引物浓度也会对扩增产物
有所影响 ,随着浓度的增加 ,扩增带逐渐增加 ,并由弱
变强 。
图 3 不同引物浓度下的 PCR产物
注:引物的终浓度分别为:1-5, 0.98mmol/L;6-10, 0.65
mmol/L;11-15, 1.3mmol/L。
2.3 模板 DNA
模板 DNA是研究和检测的对象 ,其浓度和纯度
的高低都直接影响 PCR产物的数量和质量。作者在
实验中 ,发现模板在 24-72 ng/μL的浓度变化范围
内扩增出基本相同的带 ,扩增效率高(如图 4)。
图 4 不同 DNA浓度下的 PCR产物
注:DNA的终浓度分别为:1, 24 ng/μL;2, 36 ng/μL;3, 48
ng/μL;4, 60 ng/μL;5, 72ng/μL。
2.4 酶
聚合酶对 PCR的影响最明显 、最直接 ,而且 ,不
同生产厂家 ,甚至同一厂家不同批次产品的活性都
有差异 。试验中 25 μL体系 ,使用 0.5U、1U、2U、
3U的 TagDNA酶 。如图 5:浓度太低 ,扩增产物很
少或没有 ,随着酶浓度太高 ,扩增条带增加并且逐渐
清晰 ,但以浓度为 2U/25μL的 TagDNA聚合酶的扩
增条带最清晰 ,且稳定 。
图 5 不同酶浓度下的 PCR产物
注:聚合酶的终浓度分别为:1 -4, 3U/μL;5 -8, 2U/
μL;9-12, 1U/μL;13-16, 0.5U/μL。
3 讨论与结论
DNA产物的多少 、有无 、特异性好坏取决于同
PCR相关的各个条件共同作用的结果 ,而不是由某
一个组分浓度和质量决定的 。同时 ,某一组分的浓
度同产物间的变化规律也是由其他各种 PCR条件
决定的。例如 ,用上海生物工程公司生产的聚合酶 ,
Mg2+变化范围很窄 ,而在 Takara公司生产的聚合酶
的作用下 , Mg2+在很宽的变化范围都有产物 ,而且
产物相对稳定 。一个稳定的体系是一定条件下 ,各
种组分共同维持的一个动态平衡 ,一旦反应条件或
任何一个组分发生改变 ,平衡被破坏 ,体系不再稳
定 ,但是 ,总能通过调节其它组分的浓度达到一个新
的平衡 ,而这两个平衡下的产物不进行比较 。
实验通过对各因素的不同梯度比较 ,确定披针
莲座蕨 ISSR扩增条件:25μL体系中各成分的终浓
度分别为 ,模板 DNA:36ng/μL, dNTP:0.2 mmol/L,
引物:1.3 mmol/L,聚合酶:2U, Mg2+:1.5 mmol/L。
参考文献:
[ 1] MulisK.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecata-
lyzedchainreation[ J] .MethodsEnzymol, 1987, 155:350-355.
[ 2] 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用 [ M] .北京:
化学工业出版社 , 2005.
[ 3] 邹喻苹 ,葛 颂 , 王晓东.系统与进化植物学中的分子标记
[ M] .北京:科学出版社 , 2001.
[ 4] 姚明哲 ,王新超.茶树 ISSR-PCR反应体系的建立 [ J] .茶叶
科学 , 2004, 24(3):172-176.
[ 5] ClarkMS.植物分子生物学实验手册 [ M] .顾红雅 ,瞿礼嘉主
译 ,陈章良主校.北京:高等教育出版社 , 1998:3-11.
[ 6] AmmirajuJS, DholakiaBB, SantraDK, etal.Identificationof
intersimplesequencerepeat(ISSR)markersassociatedwithseed
sizeinwheat[ J] .TheorApplGenet, 2001, 102:726-732.
—49—
第 6期 王 玲 ,等:莲座蕨 ISSR—PCR扩增条件优化的研究