全 文 ：第 34卷　第 2期
2010年 3月
南京林业大学学报(自然科学版)
JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.34, No.2
Mar., 2010
htp://www.nldxb.com
　收稿日期:2009-07-07　　　　修回日期:2009-10-22
　基金项目:“十一五 ”国家科技支撑计划(2006BAD08A19122)
　作者简介:朱丽华(1970—),博士后。吴小芹(通信作者),教授。 E-mail:xqwu@njfu.com.cn。
　引文格式:朱丽华,吴小芹,戴培培,等.赤松离体培养植株再生体系的建立 [ J] .南京林业大学学报:自然科学版 , 2010, 34(2):11-14.
赤松离体培养植株再生体系的建立
朱丽华 1, 2 ,吴小芹 1, 2＊ ,戴培培1, 2 ,张红岩 1, 2
(1.南京林业大学森林资源与环境学院 ,江苏　南京　210037;2.江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室 ,
江苏　南京　210037)
摘要:以无菌条件下萌发 21 ～ 28d的赤松(Pinusdensiflora)幼苗子叶 -胚轴材料为起始外植体建立了
植株再生体系。结果表明:在添加 4mg/L6-BA和 0.05mg/LNAA的 GD培养基上培养 5周可诱导
丛生芽形成 ,无 6-BA但添加 0.1mg/LNAA的 DCR培养基促进了芽的进一步生长 , DCR培养基中
添加 0.5 ～ 1.0g/L活性炭促进了芽的伸长 ,在添加 2mg/L6-BA和 0.1 ～ 0.2mg/LNAA的 GD培养
基上丛生芽大量增殖。伸长的丛生芽接种在附加 0.2mg/LNAA的 1/2GD培养基中培养 4周后 ,不
定根发生率达 68.4%,转移至无激素但添加 0.5g/L活性炭的 1/2GD中不定根迅速伸长。将完整的
再生植株移栽于蛭石 -珍珠岩 -河沙等比混合的基质中 , 12周后成活率约为 60%。
关键词:赤松;丛生芽诱导;丛生芽增殖;不定根;植株再生
中图分类号:S718;Q948　　　文献标志码:A　　　文章编号:1000-2006(2010)02-0011-04
InvitroplantletregenerationfromseedlingexplantsofPinusdensiflora
ZHULi-hua1, 2 , WUXiao-qin1, 2＊ , DAIPei-pei1, 2 , ZHANGHong-yan1, 2
(1.ColegeofForestResourcesandEnvironment, NanjingForestryUniversity, Nanjing210037, China;
2.JiangsuKeyLaboratoryforPreventionandManagementofInvasiveSpecie, Nanjing210037, China)
Abstract:AplantletregenerationprotocolwasdevelopedforP.densiflorabyusingCotyledon-hypocotylexplantsfrom
21— 28 daysoldasepticalygrownseedlings.TheexplantswereculturedonaGDmediumcontaining4 mg/L6-BA(6-
benzylaminopurine)and0.05mg/LNAA(α-naphthylaceticacid)for5 weekstoobtainbudinduction.Budgrowthwas
enhancedbytheeliminationof6-BAandtheinclusionof0.1mg/LNAAinDCRmedium.Shootselongationwasachieved
onDCRmediumsupplementedwith0.5— 1.0g/Lactivatedcharcoal(AC).Multipleshootsinsubcultureswereprolifera-
tedonGDmediumwith2mg/LBAPand0.2mg/LNAA.Rootprimordiawereinducedin68.4% ofshootsafter4weeks
ofcultureon1/2 GDmediumcontaining0.2mg/LNAA.Rootselongatedrapidlyafterthetransmissionofrootedplantlets
to1/2 GDmediumwith0.5g/LAC.Therootedplantletsweresuccessfullytransferredtocupscontainingamixtureofver-
miculite-perlite-sand.Thesurvivingratewasapproximate60% after12 weeksinthegreenhouse.
Keywords:Pinusdensiflora;budinduction;shootmultiplication;adventitiousroot;plantletregeneration
　　松树是世界上分布与种植最为广泛的树种 ,由
于受松材线虫病的严重危害 ,日本 、韩国及我国的
松树大量死亡 ,对林业生产 、森林资源和生态环境
造成了严重的破坏[ 1] 。为此 ,自 1978年起 ,日本进
行了大量的抗松材线虫病赤松和黑松选育工作并
建立了抗病种子园[ 2] 。然而 ,抗病种子产量供应
非常有限 ,难以满足大规模林业生产的需要。开展
松树离体组织培养技术研究 ,可快速大量繁殖已选
优良抗病基因型 ,在短周期内实现生产增益。
植物组织培养植株再生最常见的途径是器官发
生(腋芽萌发或不定芽形成)和体细胞胚胎发生。
自从 Sommer等[ 3]首次获得长叶松试管苗以来 ,松
属树种组织培养植株再生研究取得了很大进展。据
初步统计 ,到目前为止 ,各国学者已对松属的 60多
个种或变种 、杂种分别进行了组织培养 ,近 40个经
器官发生或体细胞胚胎发生获得了再生成植株[ 4] 。
国内外关于赤松离体培养植株再生的报道比较少:
1987年 Isikawa[ 5]研究了赤松下胚轴和幼苗根尖的
器官分化情况 ,仅在胚轴上发现有不定根的形成;
Choi等[ 6]对赤松离体微繁殖进行了研究 ,获得少量
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 34卷
完整植株;Taniguchi[ 7] 、Maruyama等[ 8] 、Shoji等[ 9]
以赤松未成熟胚外植体建立了体细胞胚胎发生体
系 ,但存在胚性愈伤诱导率低 、体胚成熟与转化率低
等问题。该研究所用的材料为从日本引进的抗松材
线虫病赤松成熟种子 ,种子昂贵而稀少 ,鉴于松树很
难以成熟种子建立起体细胞胚胎发生植株再生体
系 ,试验确定采用器官发生方式对其进行研究 ,旨在
为快速繁殖抗病材料提供技术支持。
1　材料与方法
1.1　供试赤松种子及外植体制备
试验所用赤松成熟种子来自赤松抗松材线虫病
种子园 ,于 2004年 2月从日本引进。使用前经 4℃
低温处理 ,参照朱丽华等[ 10]关于湿地松组织培养及
植株再生的方法将其培养成无菌苗。将萌发生长
21 ～ 28d的无菌苗在子叶着生部位以下 5 ～ 8mm处
将根切除后作为外植体(称子叶 -胚轴外植体)。
1.2　初代丛生芽的诱导
参照文献 [ 10] ,将外植体接种到附加 4 mg/L
6-BA与 0.05 mg/LNAA的改良 GD培养基上 ,
5周后观察外植体生长状况及丛生芽分化情况 ,计
算诱导率(有芽外植体数 /接种外植体数)及每个
外植体所形成的平均芽数 。
1.3　丛生芽的生长 、伸长及增殖
在诱导培养基上培养 5周后 ,将外植体连同已
分化的丛生芽转移至不同培养基上进行生长 、伸长
试验。测试了不添加或添加 0.1 mg/LNAA或
0.5 ～ 1.0g/L活性炭(AC)的 GD、SH、DCR培养基
对丛生芽生长 、伸长的影响;将伸长的丛生芽单个
切下 ,接种至添加不同浓度的 6-BA与 NAA的改
良 GD培养基上进行增殖试验 。
1.4　不定根的诱导
将伸长的丛生芽单个切下 ,接种至添加不同质
量浓度 NAA(0、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L)的 1 /2
GD培养基上诱导不定根 , 4周后 ,转移至无生长素
但添加活性炭的培养基上促进不定根伸长。
以上培养基除生根培养基中蔗糖质量浓度为
20mg/L外 ,其余均添加蔗糖 30mg/L、水解酪蛋白
(CH)500 mg/L、谷氨酰胺(Gln)450 mg/L、卡拉胶
6g/L, pH=5.8 , 121 ℃灭菌 16 min。培养温度
(24±1)℃,光照度 2 000lx,每日光照 16h。
每试验重复 3 ～ 5次 ,每重复包含 10 ～ 30个外
植体 。数据采用 SPSS软件进行分析。
2　结果与分析
2.1　初代丛生芽的诱导结果
赤松子叶 /胚轴外植体接种到附加 4 mg/L的
6-BA与 0.05 mg/L的 NAA的改良 GD培养基上
16d后 ,可见到大部分赤松顶芽稍稍膨大。随着
培养时间的延长 ,子叶间及子叶基部见到有绿色小
凸起 , 5周后 ,子叶基部长出 2 ～ 5mm大小的小芽 ,
诱导率为 96.54 %, 平均每个外植体可形成芽
(7.7±0.7)个。从外观形态上看 ,部分外植体长
势茂盛 ,针叶嫩绿;部分外植体针叶灰绿 ,长势欠佳
(图 1A),在随后的试验中适当提高培养基中的
NAA浓度 ,外植体长势有了很大的提高 。
图 1　赤松离体植株再生过程
Fig.1　VariousstagesofplantletregenerationinP.densiflora
注:A.初代芽的形成;B.丛生芽的生长;C.丛生芽的伸长;D.丛生芽的增殖;E.完整的再生植株;F.移栽至瓶外的再生植株。
12
　第 2期 朱丽华 ,等:赤松离体培养植株再生体系的建立
2.2　生长素 、活性炭对赤松丛生芽生长 、伸长的影响
在诱导培养基上培养 5周后 ,将带有丛生芽的外
植体转入所设计的不同生长培养基中。培养 4周后 ,
在不添加 NAA或活性炭的培养基中 ,外植体切口处
被一层薄薄的褐化致密的愈伤组织所包裹 ,丛生芽长
势较差;在添加 0.5 ～ 1.0g/L活性炭的培养基中 ,外
植体切口处有一些淡绿色 、疏松的愈伤组织 ,丛生芽
长势相对较好;在添加 0.1mg/L的 NAA培养基中 ,
外植体切口处有一些黄白色的疏松愈伤组织 ,丛生芽
长势比较旺盛。所测试的 3种基本培养基中 , DCR最
适合于丛生芽的生长(图 1B),其次为 SH。
在上述培养基中生长 4周后 ,将外植体上的丛生
芽切割成 3 ～ 4小块 ,分别转入添加 NAA或活性炭的
培养基中继续培养。 4周后观察结果表明 ,活性炭对
赤松丛生芽的伸长具有明显的促进作用 ,在添加
0.5 ～ 1.0 g/L活性炭的培养基中丛生芽生长旺盛
(图 1C);从继代方式看 ,由添加 NAA的培养基到添
加活性炭的培养基优于连续 2次继代于添加 NAA的
培养基以及连续 2次继代于添加活性炭的培养基。
2.3　6-BA和 NAA对丛生芽增殖的影响
将伸长的丛生芽单个或成丛切下 ,继代在添加
不同浓度 6 -BA和 NAA的培养基上进行增殖。
培养 4周后 ,无激素培养基中丛生芽仅进行伸长生
长 ,没有丛生芽分化;含 6-BA和 NAA的培养基
中丛生芽基部继续分化出丛生芽(图 1D)。统计
结果(表 1)表明:6-BA对丛生芽增殖有显著影
响 , 6-BA为 2.0 mg/L的培养基中丛生芽增殖率
最高 ,每外植体平均增殖 4.6芽;6 -BA质量浓度
低于 2.0 mg/L的培养基中丛生芽增殖较少;NAA
对丛生芽增殖影响不大 ,但超过 0.2mg/L时 ,外植
体基部产生大量愈伤组织 ,不利于丛生芽的生长。
表 1　6-BA与 NAA对赤松丛生芽增殖的影响
Table1　Effectof6-BAandNAAonthebudsprolifera-
tionofP.densiflora
c6-BA/
(mg·L-1)
cNAA/
(mg·L-1)
平均每外植体芽数
mean±SE
sig.
6-BA NAA
0　 0　 0d ＊＊ NS
0.5 0.1 0.3±0.3c
0.5 0.2 0.5±0.3c
0.5 0.4 0.3±0.2c
1.0 0.1 1.9±0.5c
1.0 0.2 2.6±1.9abc
1.0 0.4 0.6±0.4c
2.0 0.1 4.6±0.8a
2.0 0.2 4.0±0.2ab
2.0 0.4 3.3±2.1ab
　　注:同一列中相同字母表示差异不显著 ,不同字母表示差异极
显著(p≤0.01);＊＊为极显著 , NS表示差异不显著(p=0.01)。
2.4　NAA对赤松不定根发生的影响
将高 1.0 ～ 1.5 cm的丛生芽切割成单个 ,转入
添加不同浓度 NAA的 1 /2GD培养基中诱导不定
根。培养 4周后统计结果(表 2)表明:NAA对赤
松组培苗不定根发生有显著的促进作用 , 在无
NAA存在的情况下其不定根不会自发形成 ,随着
培养基中 NAA的加入 ,不定根发生率上升 ,在添加
0.2mg/LNAA的培养基中生根率最高(68.4%),
不定根 1 ～ 2条 ,根长 7 mm左右 ,且根茎连接处愈
伤组织较少 。随着培养基中 NAA浓度继续增高 ,
生根率依然保持比较高 ,根比较短 ,根茎连接处愈
伤组织发生严重 。
表 2　NAA对赤松嫩梢生根的影响
Table2　EffectofNAAontheadventitiousrootformation
ofP.densiflora
cNAA/
(mg·L-1)
生根率 /%
ratioofshootsrooting
平均根数 /条
averagenumberofroots
根长 /mm
rootlength
0　 0c 0b 0b
0.05 39.1±11.3b 1.5±1.1ab 4.6±0.3ab
0.1 60.1±8.1ab 1.5±0.9ab 7.4±0.7a
0.2 68.4±10.9a 2.0±1.1a 7.6±0.5a
0.4 65.4±17.8a 2.1±1.3a 3.4±0.4ab
　　注:同一列中相同字母表示差异不显著,不同字母表示差异显著(p≤0.05)。
转入无生长素但添加活性炭的培养基后不定
根迅速伸长 , 1个月后达 2 ～ 4 cm,洁白而幼嫩 ,但
较少有侧根发生(图 1E),此时可进行移栽 。在进
行再生植株移栽前逐渐打开瓶盖炼苗 5 ～ 7d,然后
将小苗取出后 ,用水洗去根部残留的琼脂培养基 ,
移栽于装有蛭石 、珍珠岩与河沙等混合基质的容器
内 ,喷水保湿。 12周后移栽成活率为 60 %左右
(图 1F)。
3　讨　论
松属树种离体培养难度较大 ,外植体类型 、激
素种类及浓度等对植株再生体系的成功建立尤为
重要 。成熟胚 [ 11 -15] 、幼嫩子叶 [ 16 -17]被广泛用于松
属树种的组织培养 ,外植体通常培养在 6-BA和
NAA或 IBA比率较高的培养基上。该试验以萌发
3 ～ 4周幼苗的子叶 -胚轴部分作为起始外植体 ,
在含 6-BA和 NAA的培养基取得了较好的诱导
效果 ,类似的结果在其他松属树种的组培中亦有报
道[ 18-21] 。虽然与胚 、子叶相比该类外植体所能产
生的初代芽数量相对要少 ,但这些芽更健壮 、生长
更迅速 ,对于继续进行二次增殖非常有利 。
为促进已分化芽的生长 、伸长 ,通常要将芽连
同原组织转移到无激素或低浓度激素的培养基
上[ 22] ,附加一些吸附剂如活性炭 ,对芽的伸长也有
促进作用 [ 13-14, 16] 。该试验中 ,已分化芽转移到无
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 34卷
激素培养基上一段时间后往往在切口处形成一薄
层致密 、褐化的愈伤组织 ,不利于丛生芽的生长;转
移到添加 NAA或活性炭的培养基上的芽生长比较
好 。笔者认为 ,低浓度的 NAA使丛生芽切口处形
成的微量愈伤保持疏松状态 ,而活性炭造成的暗条
件亦使丛生芽切口形成的愈伤不褐化 ,从而有利于
水分 、养分吸收 ,促进了丛生芽的生长 ,但连续在相
同培养基中继代培养会导致丛生芽长势不佳 ,宜交
替使用 。
对于大多数针叶树 ,生根问题是成功微繁的主
要障碍 ,尽管大多数松属树种的芽繁殖可以通过胚
性外植体来完成 ,但由此产生的小芽即使在有生长
素存在时也很难生根 [ 22] 。该试验中 , NAA处理后
生根率最高为 68.4 %,不定根发生所需的各种条
件有待进一步优化。此外 ,再生植株的野外生长情
况及其抗病性等均有待进一步研究。
参考文献:
[ 1 ] 杨宝君,潘宏阳 ,汤坚 ,等.松材线虫病 [ M] .北京:中国林业
出版社, 2003.
[ 2 ] KishiY.ThePineWoodNematodeandtheJapanesePineSaw-
yew[ M] .Tokyo:ThomasCompanyLimited, 1995.
[ 3 ] SommerHE, BrownCL, KormanikPP.Diferentiationofpla-
ntletsinlongleafpine(PinuspalustrisMil.)tissueculturedin
vitro[ J] .BotGaz, 1975, 136:196-200.
[ 4 ] 朱丽华.湿地松 、火炬松和黑松的组培繁殖技术研究 [ D] .
南京:南京林业大学 , 2004.
[ 5 ] IsikawaH.Generationofadventitiousplantorgansbytissuecul-
turemethodsinforesttrees[J] .BulletinoftheForestryandFor-
estProductsResearchInstitute, 1987, 343:119-153.
[ 6 ] ChoiMS, LeeSG, ParkYG, etal.MicropropagationofPinus
densifloraforerectauyeki[ J] .KoreanJournalofPlantTissue
Culture, 1993, 20(6):315-320.
[ 7 ] TaniguchiT.PlantregenerationfromsomaticembryosinPinus
thunbergiandPinusdensiflora[ G] //MorohoshiN, Komamine
A.MolecularBreedingofWoodyPlants.Amsterdam:Elsevier
ScienceBV, 2001.
[ 8 ] MaruyamaE, HosoiY, IshiK.PropagationofJapaneseredpine
(PinusdensifloraZieb.etZucc.)viasomaticembryogenesis[ J] .
PropOrnamPlants, 2005, 5:199-204.
[ 9 ] ShojiM, SatoH, NakagawaR, etal.Influenceofosmoticpres-
sureonsomaticembryomaturationinPinusdensiflora[ J] .JFor
Res, 2006, 11:449-453.
[ 10] 朱丽华 ,张艺 ,吴小芹.湿地松的组织培养及植株再生 [ J] .
南京林业大学学报:自然科学版 , 2004, 28(6):47-51.
[ 11] 成小飞 ,花小梅 ,李文钿.马尾松离体培养条件下的微繁殖和
菌根的形成 [ J] .林业科学研究 , 1995, 8(3):241-246.
[ 12] 唐巍 ,欧阳藩 ,郭仲琛.火炬松成熟合子胚培养直接器官发生
和植株再生 [ J] .云南植物研究 , 1997, 19(3):285-288.
[ 13] 阕国宁 ,房建军 ,葛万川 ,等.火炬松 、湿地松 、晚松组织繁殖
的研究 [ J].林业科学研究 , 1997, 10(3):227-232.
[ 14] 李科友,唐德瑞,朱海兰,等.美国黄松离体胚培养条件下不定芽
的形成与根产生的研究 [ J].林业科学, 2004, 40(4):63-67.
[ 15] 朱丽华 ,吴小芹.湿地松成熟合子胚直接器官发生及植株再
生 [ J].林业科学 , 2006, 42(8):25-29.
[ 16] GonzzalezMV, ReyM, TavazzaR.Invitroadventitiousshoot
formationoncotyledonsofPinuspinea[J].HortScience, 1998,
33(4):749-750.
[ 17] CalixtoF, PaisSM.Adventitiousshootformationandplantre-
generationfromPinuspinasterSol.ExAiton[J] .InvitroCellular
andDevelopmentBiologyPlant, 1997, 33(2):119-124.
[ 18] KaulK.Plantregenerationfromcotyledon-hypocotylexplantsof
PinusstrobusL.[ J] .PlantCelReports, 1987(6):5-7.
[ 19] BurnsJA, SchwarzOJ, SchlarbaumSE.Multipleshootproduc-
tionfromseedlingexplantsofslashpine(PinuseliotiE.)[ J] .
PlantCelReports, 1991, 10(9):439-443.
[ 20] KaliaRK, AryaS, KaliaS, etal.Plantletregenerationfromfas-
cicularbudsofseedlingshootapicesofPinusroxburghiSarg[ J] .
BiologiaPlantarum, 2007, 51(4):653-659.
[ 21] 朱丽华 ,郑丹 , 吴小芹.黑松丛生芽的诱导及植株再生 [ J] .
南京林业大学学报:自然科学版 , 2006, 30(3):27-31.
[ 22] 黄健秋 ,卫志明.松属树种的组织培养和原生质体培养 [ J] .
植物学通报 , 1994, 11(1):34-42.
(责任编辑　郑琰燚)
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