全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (10): 1301−1306 · 1301 ·



UPLC/Q-TOFMS 分析十八反乌头半夏配伍化学成分的变化
王 超 1, 王宇光 2, 梁乾德 2, 让蔚清 1, 高 月 2*
(1．南华大学生命科学研究中心环境医学与放射卫生研究所, 湖南 衡阳 421001;
2．军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850)
摘要: 利用 UPLC/Q-TOFMS 对中药十八反药对乌头半夏配伍煎煮前后水煎液进行检测, 分析合煎液与合并
液化学成分差异, 探讨乌头半夏配伍产生毒性的可能机制, 从化学成分变化的角度阐述其相反的科学内涵。制备
乌头半夏水煎液、乌头半夏合煎液及 1∶1 合并液, 对合并液和合煎液进行 UPLC/Q-TOFMS 检测, 通过 MassLynx
4.1 统计软件分析两组间差异, 分析两组间差异显著的潜在化学标记物。乌头半夏合煎液与合并液色谱图存在明
显差异, 二者合煎后剧毒成分乌头碱、中乌头碱及次乌头碱含量显著增加。乌头半夏合并煎煮与分别煎煮成分
具有明显差异, 这种差异与乌头-半夏配伍增毒具有一定联系。
关键词: 十八反; UPLC; Q-TOFMS; 乌头; 半夏
中图分类号: R917; R916 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2010) 10-1301-06
Analysis of chemical composition in the combination of monkshood and
pinellia by UPLC/Q-TOFMS with multivariate statistical analysis
WANG Chao1, WANG Yu-guang2, LIANG Qian-de2, RANG Wei-qing1, GAO Yue2*
(1. Institute of Environmental Medicine and Radiation Hygiene, Research Center of Life Science, University of South China,
Hengyang 421001, China;
2. Institute of Radiation and Irradiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Abstract: In the present study, an ultra performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass
spectrometry (UPLC/Q-TOFMS) based on chemical profiling approach to evaluate chemical constitution between
mixed decoction and co-decoction of monkshood-pinellia combination of the eighteen incompatible medications
(Shi Ba Fan) was proposed. Two different kinds of decoctions, namely monkshood-pinellia co-decoction: water
extract of the two herbs together, and monkshood-pinellia mixed decoction: water extract of each individual
herbs mixed together, were prepared. Batches of these two kinds of decoction samples were subjected to
UPLC/Q-TOFMS analysis, the datasets were processed with MassLynx 4.1 to holistically compare the difference
between these two kinds of decoction samples. The most changed components during decocting were analyzed.
Using the proposed approach, global chemical difference was found between co-decoction and mixed decoction,
mesaconitine, aconitine and hypaconitine were identified as the most changed components (changed most
significantly) during decocting. Result shows significant difference between two kinds of decoction samples,
and the significant differences are probably related to the incompatibility of monkshood and pinellia.
Key words: eighteen incompatible medication; UPLC; Q-TOFMS; monkshood; pinellia

中药“十八反”是中药配伍禁忌的重要内容之
一, 最早源于《神农本草经》, 其中将中药的配伍关
系归纳为“有单行者, 有相须者, 有相使者, 有相畏

收稿日期: 2010-04-13.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (3070936).
*通讯作者 Tel: 86-10-66931312, E-mail: gaoyue@yahoo.com
者, 有相恶者, 有相反者, 有相杀者, 凡此七情, 合
和视之, 当用。”但其中并未指出具体相反的药物。
自《蜀本草》首先提出“相反者十八种”后, 一直为
历代医家所遵从, 十八反的内容也被历版《中国药
典》所收录, 规定注明畏、恶、反的药物在一般情况
下不宜使用或两药不宜同用, 以避免可能导致的毒
DOI:10.16438/j.0513-4870.2010.10.008
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性反应或拮抗药效。“乌头反半夏”是中药十八反的
药对之一, 但近年来中药十八反却成为现代药性理
论争议最多的问题之一, 焦点集中在其作为配伍禁
忌的合理性。因此, 开展具有中医药理论特色的十八
反、十九畏相关研究, 是迫切需要科学阐释其合理内
涵的关键基础问题[1]。
在反药配伍方剂中以乌头半夏为最多[2], 主要用
于痹症的镇痛。乌头又名川乌, 有祛风除湿、温经止
痛的功效。其主要活性成分为二萜类生物碱, 包括双
酯型、单酯型和脂型二萜生物碱, 其中双酯型毒性最
大, 乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的小鼠 LD50 分别
为 1.8、1.9 和 5.8 mg·kg−1 [3]。半夏性辛温, 有小毒, 归
脾胃肺经, 有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。
目前, 对于乌头半夏配伍的研究主要在于检测
配伍后乌头中双酯型生物碱含量变化[4, 5], 以及临床
应用和药理方面的研究[6, 7], 对其全面的化学成分变
化及配伍规律的研究较少。超高效液相色谱 (UPLC)
技术是近年发展起来的分离技术, 不仅使柱效得到
提高, 而且在较宽的流速范围内柱效保持恒定, 从而
有利于通过提高流动相的流速而缩短分析时间, 提
高分析通量。UPLC 在中药等复杂体系的分离分析上
具有明显优势, 具有超高压、超高灵敏度、超高分离
度等特点。飞行时间串联质谱仪 (Q-TOFMS) 是高分
辨串联质谱, 其显著特点是高灵敏度、高选择性, 能
得到高质量质谱图和化合物精确分子量。超高效液
相色谱与飞行时间质谱联用技术 (UPLC/Q-TOFMS)
是目前科研中应用较好的定性测定方法, 也是目前
分析中药复杂系统的最有力工具之一[8]。
本实验采用超高效液相色谱-飞行时间电喷雾质
谱技术, 结合主成分分析 (PCA) 和正交偏最小二乘
判别分析进行数据分析, 探讨乌头与半夏配伍煎煮
对其化学成分的影响, 试图从化学成分变化的角度
阐述二者相反的科学内涵。

材料与方法
药材 乌头 (川)、半夏购自河北安国中药材市
场, 均经军事医学科学院放射与辐射医学研究所马
百平教授鉴定分别为毛茛科乌头属植物川乌 (Aco-
nitum carmichaeli Debx.) 的干燥母根、天南星科半夏
属植物半夏 (Pinellia ternata (Thunb.) Breit.) 的干燥
块茎, 标本收藏于军事医学科学院放射与辐射医学
研究所二室。乌头碱等对照品购自中国药品生物制品
检定所。
试剂 甲酸为分析纯, 购自国药集团化学试剂
有限公司; 乙腈为色谱纯, 购自Fisher Scientific公司;
超纯水由 Millipore 制备。
仪器 Acquity UPLC-Synapt MS 色谱-质谱联用
仪 (Waters 公司), MassLynx V4.1 质谱工作站 (Waters
公司), Heraeus Labofuge 400R 冷冻离心机, Millipore
Simplicity 纯水仪。
供试样品的制备 乌头和半夏按 1∶1 比例称重
混合, 加入 10 倍量的水, 浸泡 30 min 后煎煮, 煮沸
60 min 提取煎液, 3 层纱布过滤; 第二煎加入 5 倍量
水, 煎煮 30 min 后纱布过滤提取煎液, 合并两次滤
液, 即为乌头半夏合煎液; 乌头半夏合并液先制备乌
头单煎液和半夏单煎液, 制备方法同上, 将两煎液按
1∶1 混合, 即为乌头半夏合并液。将制备的煎液静
置, 经 10 000 r·min−1 离心 10 min, 取上清液, 0.22 μm
微孔滤膜过滤即为样品, 4 ℃保存, 待测。
超高效液相色谱条件 采用 Waters ACQUITY
BEH C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) 色谱柱; 柱温为
45 ℃, 流速为 0.4 mL·min−1, 进样量为 5 μL; 流动相
A: 0.1%甲酸水溶液; 流动相 B: 乙腈, 梯度洗脱 (0～
1.5 min: 乙腈1%～3%; 1.5～13.5 min: 乙腈3%～32%;
13.5～18.5 min: 乙腈 32%～60%; 18.5～20.5 min: 乙
腈 60%～99%; 20.5～22.0 min: 乙腈 99%～1%)。
质谱条件 采用电喷雾电离离子源 (ESI), 正离
子 V 模式检测; m/z 100～900; 毛细管电压为 3 kV;
锥孔电压为 35 V; 离子源温度为 120 ℃; 雾化温度为
300 ℃; 壳气流速为 900 L·h−1; 以亮氨酸-脑啡肽进
行精确质量校正 ([M+H]+ = 556.277 1)。
数据分析 质谱数据采用 MarkerLynx 4.1 软件
进行峰提取、峰对齐及归一化等处理, 利用正交偏最
小二乘判别分析法 (OPLS-DA) 找出合并液与合煎
液之间化合物谱的差异 , 并通过变量重要性投影
(variable importance in projection, VIP) 得到 20 个潜
在的化学标记物, 结合质谱同位素分析和数据库检
索对潜在的化学标记物进行鉴定。

结果
1 UPLC/Q-TOFMS 分析结果
首先比较了乌头半夏合并液、乌头半夏合煎液总
离子流图差异。图 1 显示, 合煎液与合并液相比, 合
煎液在 tR 14.20 min 离子峰 16 峰面积增加最为显著;
在 tR 15.17、15.93 及 13.21 min 合煎液离子峰 19、20、
王 超等: UPLC/Q-TOFMS 分析十八反乌头半夏配伍化学成分的变化 · 1303 ·

14 峰面积增加显著; 而 tR 12.65 min、13.83 min 合煎
液离子峰 13、15 峰面积显著减小。
乌头半夏合并液、乌头半夏合煎液质谱图见图
2。图中 m/z 632、616、646 离子的质谱图与对照品
的质谱图比较, 可以确定为中乌头碱 (mesaconitine,
[M+H]+ = 632)、次乌头碱 (hypaconitine, [M+H]+ =
616)、乌头碱 (aconitine, [M+H]+ = 646)。根据质谱数
据与相关文献[9, 10]报道, 相关离子推断见表 1。
2 MarkerLynx 统计结果
MarkerLynx 4.1 统计分析结果如图 3～5 所示。
由图 3 可见, 两组样品能够得到明显的区分。进
一步由图 4 可见, 两组样品在化学成分上的差异性,
在 S 型曲线两端的数据点分别代表了两组样品中可信
度最高的特征化合物。图 5 为 MarkerLynx 4.1 分析得


Figure 1 Representative chromatograms of (A) mixed decoction and (B) co-decoction of monkshood-pinellia


Figure 2 Representative mass spectra of most changed toxic components (A, B) mesaconitine, (C, D) hypaconitine and (E, F) aconitine
during co-decocting of monkshood-pinellia
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Table 1 The most changed components identified during co-decocting of monkshood-pinellia. VIP: Variable importance in projection
Peak No. tR /min Assigned identity Molecular formula m/z VIP
1 5.56 Carmichaeline C22H35NO4 378.262 3 2.583 4
2 5.60 Cammaconine C23H37NO5 408.271 9 3.932 7
3 6.51 Pengshenine A C24H37NO6 436.231 3 2.128 1
4 6.68 Fuziline C24H39NO7 454.278 9 2.322 1
5 7.04 Neoline C24H39NO6 438.284 3 2.766 7
6 7.33 Torokonine C27H31NO5 450.285 3 2.181 3
7 7.87 Talatizamine C24H39NO5 422.288 3 2.081 2
8 9.50 Acetyltalatizamine C26H41NO6 464.300 5 2.361 2
9 9.57 Unknown − 566.428 3 1.532 4
10 9.65 10-OH-benzoylmesaconine C31H43NO11 606.290 7 2.010 3
11 10.43 Unknown − 679.512 8 2.196 9
12 11.21 Benzoylmesaconine C31H43NO10 590.296 5 2.752 1
13 12.65 Benzoylhypaconine C31H43NO9 574.300 9 3.445 4
14 13.21 10-OH-mesaconitine C33H45NO12 648.303 2 2.629 7
15 13.83 Dehydrated benzoylhypaconine C31H41NO8 556.292 4 1.876 9
16 14.20 Mesaconitine C33H45NO11 632.303 9 5.409 6
17 14.43 10-OH-aconitine C34H47NO12 662.318 2 1.760 7
18 15.16 Aconitine C34H47NO11 646.323 9 3.572 0
19 15.17 Hypaconitine C33H45NO10 616.311 5 2.135 6
20 15.93 Deoxyaconitine C34H47NO10 630.328 5 1.499 7


Figure 3 OPLS-DA/Scores plot of mixed decoction and co-
decoction of monkshood-pinellia obtained using Pareto scaling
with mean centering. ▲ mixed decoction; ■ co-decoction

到的两组样品中差异较显著的特征化合物的变化趋
势图。

讨论
中药成分十分复杂, 但其产生药效或毒性的物
质基础仍然为化合物范畴。本课题组前期基于药物代
谢酶层面, 分别在酶活性、mRNA 及蛋白表达 3 个水
平对乌头半夏配伍所致毒性增强的“中药-中药间相
互作用”做了系统研究, 结果显示乌头半夏配伍在
酶活性、mRNA 及蛋白表达 3 个水平上均表现出对
CYP3A 的抑制作用。本实验将从化学物质基础层面
探讨乌头半夏配伍致毒的可能机制。

Figure 4 OPLS-DA/S-Plot of mixed decoction and co-decoction
of monkshood-pinellia obtained using Pareto scaling with mean
centering. a: tR 14.20 min, m/z 632.303 9; b: tR 15.16 min, m/z
646.323 9; c: tR 13.21 min, m/z 648.303 2; d: tR 14.43 min, m/z
662.318 2; e: tR 15.93 min, m/z 630.328 5; f: tR 15.17 min, m/z
616.311 5; g: tR 5.60 min, m/z 408.271 9; h: tR 12.65 min, m/z
574.300 9; i: tR 7.04 min, m/z 438.284 3; j: tR 11.21 min, m/z
590.296 5; k: tR 9.65 min, m/z 606.290 7; l: tR 7.33 min, m/z
450.285 3; m: tR 9.50 min, m/z 464.300 5; n: tR 13.83 min, m/z
556.292 4; o: tR 6.68 min, m/z 454.278 9; p: tR 7.87 min, m/z
422.288 3

研究表明乌头类药物的主要药效成分, 亦是其
主要毒性成分为双酯型二萜生物碱, 主要包括乌头
碱、中乌头碱、次乌头碱等; 经过炮制或煎煮后水解
成单酯型二萜生物碱, 毒性大为降低; 继续水解则进
王 超等: UPLC/Q-TOFMS 分析十八反乌头半夏配伍化学成分的变化 · 1305 ·


Figure 5 Selected ion intensity trend plots analyzed using Markerlynx 4.1 software. a−p see Figure 4. ▲ Mixed decoction; ■
Co-decoction

一步生成胺醇类生物碱, 几乎没有毒性。而在乌头与
半夏配伍合煎后, 如图 5所示主要的双酯型二萜生物
碱却显著增加 (中乌头碱: tR 14.20 min, m/z 632.303 9;
乌头碱: tR 15.16 min, m/z 646.323 9; 10-羟基中乌头
碱: tR 13.21 min, m/z 648.303 2; 10-羟基乌头碱: tR
14.43 min, m/z 662.318 2; 去氧乌头碱: tR 15.93 min,
m/z 630.328 5; 次乌头碱: tR 15.17 min, m/z 616.311 5),
单酯型二萜生物碱含量均显著降低 (苯甲酰次乌头
原碱: tR 12.65 min, m/z 574.300 9; 苯甲酰中乌头原碱:
tR 11.21 min, m/z 590.296 5; 10-羟基苯甲酰中乌头原
碱: tR 9.65 min, m/z 606.290 7; 14-苯甲酰次乌头原碱:
tR 13.83 min, m/z 556.292 4), 提示可能是半夏中的某
些成分如有机酸类, 与乌头碱类二萜生物碱结合形
成盐, 有助于合煎液中毒性成分的溶出, 且由于生物
碱盐的抗热破坏作用增强, 稳定了毒性成分以盐的
形式建立的平衡状态。
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通过 MarkerLynx 软件对乌头半夏合煎液与合并
液成分的比较发现, 合煎后卡马考尼 (tR 5.60 min,
m/z 408.271 9)、尼奥林 (tR 7.04 min, m/z 438.284 3)、
乙酰塔拉萨敏 (tR 9.50 min, m/z 464.300 5) 等非酯化
二萜生物碱含量显著降低, 提示在合煎过程中可能
发生了由其非酯化二萜生物碱向酯型二萜生物碱的
转化, 从而使双酯型二萜生物碱显著增加。

结论
本文初步分析了十八反中乌头、半夏这一对反药
在配伍煎煮过程中的化学成分变化情况, 研究证实
乌头半夏在配伍煎煮前后化学成分存在明显差异 ,
这种差异与乌头-半夏配伍增毒具有一定联系, 为进
一步探讨乌头半夏相反机制提供了实验数据。
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