全 文 :书第 42卷 第 1期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol.42 No.1
2014年 1月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Jan. 2014
1)国家林业局“948”引进项目(2013-4-46)。
第一作者简介:杨占辉,1987 年 8 月生,北京林业大学园林学
院,硕士研究生。
通信作者:高亦珂,北京林业大学园林学院,教授。E -mail:
gaoyk@ bjfu.edu.cn。
收稿日期:2013年 4月 16日。
责任编辑:任 俐。
喜盐鸢尾和黄菖蒲种间杂交障碍1)
杨占辉 史言妍 高亦珂 张启翔
(北京林业大学,北京,100083)
摘 要 以喜盐鸢尾(Iris halophila Pall)和黄菖蒲(I. pseudocorus L.)2种观赏鸢尾植物为材料进行种间杂交,
并对二者花粉活力、花粉管行为、胚胎发育及杂交障碍等进行研究。结果表明:受精后障碍是导致喜盐鸢尾和黄菖
蒲杂种败育的主要原因,表现为杂种胚在合子早期败育。正反交组合常规授粉后均未得到果实,且均存在一定程
度的受精前障碍,喜盐鸢尾×黄菖蒲授粉后 48 h花粉管内有大量栓塞,黄菖蒲×喜盐鸢尾授粉后 2 h柱头上出现少
量胼胝质,但最终均有少量花粉管成功伸入胚珠;对胚胎发育的观察发现,喜盐鸢尾×黄菖蒲和黄菖蒲×喜盐鸢尾
杂种胚和胚乳的降解分别发生在授粉后 9~15 d和 15~21 d;授粉后 6 d是黄菖蒲×喜盐鸢尾幼胚拯救较适宜的时
期,此时,通过子房培养法于 MS+2.0 mg·L-16-BA培养基上获得了膨大的胚珠并发育为种子。
关键词 鸢尾属;种间杂交;杂交障碍;胚拯救
分类号 S682.21+9;S722.3+4
Crossbreeding Barriers of Interspecific Hybridization between Iris halophila Pall and I. pseudocorus L. /Yang Zhan-
hui,Shi Yanyan,Gao Yike,Zhan Qixiang(Beijing Forestry University,Beijing 100083,P. R. China)/ / Journal of North-
east Forestry University.-2014,42(1).-94~97
The experiment was conducted to study the crossbreeding barriers between two Iris species,I. halophila Pall and I.
pseudocorus L.,and determine the pollen viability,pollen tube behaviors after common pollination,embryology observation
and embryo rescue. Post-zygotic barrier is the main reason for the cross incompatibility between I. halophila and I. pseuda-
corus,and it expresses embryo abortion in early zygophase. No capsules are obtained from reciprocal crosses,and there are
pro-zygotic barriers in the two combinations. The stylar canal after 48 hours pollination in I. halophila×I. pseudacorus is
blocked by a large number of embolism,while after two hours pollination in I. pseudacorus×I. halophila some corpus callo-
sum appeares on stigma. However,there is still a small amount of pollen tube at ovules of both combinations ultimately.
The failures of embryo and endosperm in I. halophila×I. pseudacorus and I. pseudacorus×I. halophila,respectively,occur
at 9-15 days and 15-21 days after pollination. Six days after pollination is the appropriate time for embryo rescue of I.
pseudocorus×I. halophila,and there are inflated ovules in medium of MS+2.0 mg·L-1 6-BA.
Keywords Iris L.;Interspecific hybridization;Crossbreeding barriers;Embryo rescue
鸢尾属(Iris L.)植物普遍具有较高的观赏价
值,特别是在北美和欧洲已被广泛应用于园林配植
中,远缘杂交是培育鸢尾新品种的有效手段[1-2]。
目前国外已经获得了一些无髯鸢尾种间杂种[3-6]。
Yabuya et al.[7]在对溪荪(I. sanguinea)和燕子花(I.
laevigata)正反交胚胎学研究后,发现胚乳退化导致
了杂种胚的败育,并通过幼胚拯救成功获得了燕子
花×玉蝉花(I. ensata)的杂种后代[4],之后又用燕子
花与玉蝉花做亲本获得了具有高花粉活性和种子活
力的双二倍体[8]。2006 年,Inoue et al.[6]通过幼胚
拯救获得暗黄鸢尾(4x) (I. fulva)×燕子花杂交种。
我国鸢尾属植物种质资源丰富,但育种起步较
晚[9]。周永红等[10]将鸡冠状亚属的扁竹兰(I. con-
fuse)和蝴蝶花(I. japonica)杂交,获得杂种后代。黄
苏珍等[11]进行了鸢尾亚属内 6 个组合的种间杂交
试验,结实率仅为 2.1%,最终杂种苗全部死亡。毕
晓颖等[12]分别用 0.1% 6-BA 处理柱头后授粉以及
提前授粉的方式仅获得了马蔺(I. lactea)和溪荪正
反交的有胚种子。目前,除野鸢尾(I. dichotoma)和
射干(I. domestica)[13]外,国内仍未有获得其他无髯
鸢尾种间杂种的报道。
喜盐鸢尾(I. halophila Pall.)和黄菖蒲(I.
pseudacorus L.)分属鸢尾属琴瓣鸢尾亚属和无附属
物亚属,前者耐旱、抗寒、耐盐碱,但花朵较小;后者
耐水湿,花大色艳但花色单一。进行二者杂交育种,
有望培育耐旱同时耐水湿的园林植物。本研究通过
对花粉活力的测定以及花粉管行为的观察,并进一
步深入,对杂种进行胚胎学观察及幼胚拯救,为改良
喜盐鸢尾的观赏性状、获得观赏性与抗性俱佳的杂
种后代奠定理论基础。
1 材料与方法
杂交试验:2012 年 5 月份,分别以喜盐鸢尾和
黄菖蒲为父母本,开花前 1 d 去垂瓣和花药,并对父
本花朵进行套袋,次日上午进行常规杂交。分别配
置喜盐鸢尾和黄菖蒲的自交和正反交组合,试验在
露地苗圃进行。
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2014.01.021
亲本花粉活力测定:采用 TTC 法及萌发法测
定花粉活力。萌发法采用 25 ℃条件下光照培养
12 h,每处理 3 次重复,每重复观察 3 个视野,以花
粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准。采用的
培养基:蔗糖 15%+硼酸 150 mg·L-1 +氯化钙 10
mg·L-1。
发芽率=(已萌发的花粉粒数目 /花粉粒总数)×
100%。
花粉管行为荧光观察:授粉后 2、6、12、24、48 h
采集 3朵花的花柱和子房,卡诺固定液(V(乙醇)∶
V(冰醋酸)= 3 ∶ 1)固定 3 h,后转移至 70%酒精中,
4 ℃冰箱储存备用。水溶性苯胺蓝(苯胺蓝以 0.1%
的比例溶于 0.1N K3PO4)染色后,于 Nikon 荧光显
微镜下观察。
杂种胚胎发育过程观察:采集授粉后 3、6、9、
15、21、27、33 d 的 3 个子房,FAA 固定液(V
(50%酒精)∶ V(冰醋酸)∶ V(福尔马林)= 89 ∶
6 ∶ 5)固定。采用常规石蜡切片方法观察杂种胚
胎发育过程。
杂种幼胚拯救:采集授粉后 6、9、12 d 的子房,
常规方法进行消毒处理,无菌条件下取胚珠,接种到
MS培养基以及 MS+2.0 mg·L-16-BA 培养基上进
行胚珠培养,每处理 12瓶,每瓶 20个胚珠。授粉后
6 d的子房同时采用胚珠培养和子房培养的方法来
进行幼胚拯救,子房培养时切除子房外壁后再接种
到培养基上。
2 结果与分析
2.1 亲本花粉活力测定
喜盐鸢尾新鲜花粉的 TTC染色率为 84.63%,萌
发率为 59.90%,测定结果一致性较好,表明两种方
法均适宜测定喜盐鸢尾的花粉活力。黄菖蒲花粉的
萌发率为 8.56%,远低于 TTC 染色率 96.55%;黄菖
蒲自交结实率为 90%(表 1),表明其新鲜花粉活力
良好,因此,TTC染色结果相对较准确地反映了其花
粉生活力状况。
2.2 喜盐鸢尾和黄菖蒲种间杂交及自交结实性的
比较
由表 1 可知,喜盐鸢尾和黄菖蒲自交结实率分
别为 50%和 90%,而正反交组合均未结实。观察发
现,无论正交还是反交组合,均有 20%左右的子房
在授粉后 3 d内即干枯脱落,表现为迅速败育;虽有
少数子房授粉后发育膨大,平均果长有所增加,但果
实宽度却明显小于同时期亲本自交正常发育的果
实,这些子房甚至在授粉后 40 d 内均可保持绿色,
此时将其切开,发现内部胚珠干瘪无光泽。授粉后
60 d左右,外壁维持绿色的子房也相继脱落败育。
表 1 喜盐鸢尾和黄菖蒲正反交及自交结实性比较
组 合 授粉数 /朵 坐果数 /个 结实率 /% 种子数 /粒
喜盐鸢尾 20 10 50 496
黄菖蒲 20 18 90 1 062
喜盐鸢尾×黄菖蒲 38 0 0 0
黄菖蒲×喜盐鸢尾 34 0 0 0
2.3 喜盐鸢尾和黄菖蒲正反交及自交花粉管行为
观察
对照组喜盐鸢尾自交 2 h 后花粉大量萌发,花
粉管伸至花柱的 1 /4 ~ 1 /3 处,6 h 花粉管伸至 4 /5
处,12 h花粉管伸至花柱底部,24 h 花粉管伸入子
房,48 h花粉管进入胚珠(图 1A)。黄菖蒲自交 2 h
后花粉在柱头上开始萌发,24 h 花粉管伸到花柱底
部,进入子房,48 h花粉管伸入胚珠(图 1E);在正反
交组合中均观察到一定程度的受精前障碍。喜盐鸢
尾×黄菖蒲授粉后 6 h才有少量花粉开始萌发,并发
现柱头上有胼胝质沉积,12 h花粉管伸长,但未伸入
花柱,48 h 花粉管伸入子房,花粉管内有大量栓塞
(图 1B),有少量花粉管伸入胚珠(图 1C)。总体上,
花粉萌发速度和花粉管伸长行为都滞后于对照组。
黄菖蒲×喜盐鸢尾授粉后 2 h 花粉开始萌发,柱
头上出现少量胼胝质,6 h花粉管伸到花柱的 1 /2处,
12 h已有少量花粉管伸至花柱底部,24 h花粉管进入
子房,48 h少量花粉管伸入胚珠(图 1D),但花粉管内
有大量栓塞。花粉管行为与喜盐鸢尾自交较相似。
A.喜盐鸢尾,48 h,花粉管伸入胚珠;B.喜盐鸢尾×黄菖蒲,48 h,花粉管内有大量栓塞;C.喜盐鸢尾×黄菖蒲,48 h,花粉管伸入胚珠;D.黄菖蒲×喜
盐鸢尾,48 h,花粉管伸入胚珠;E.黄菖蒲,48 h,花粉管伸入胚珠;箭头指示关键点。
图 1 喜盐鸢尾和黄菖蒲正反交及自交授粉后花粉管生长情况
59第 1期 杨占辉等:喜盐鸢尾和黄菖蒲种间杂交障碍
2.4 杂种胚胎发育过程观察
喜盐鸢尾×黄菖蒲在授粉 3 ~ 9 d 发育正常,授
粉后 15 d胚乳和胚退化完全,珠心细胞退化成带状
痕迹,授粉 27 d 珠心细胞完全退化,内珠被退化成
带状痕迹,外珠被大部分也已退化。授粉 33 d 后内
外珠被都退化成带状痕迹(图 2,A-E)。
黄菖蒲×喜盐鸢尾在授粉 3 ~ 15 d 发育正常,
原胚周围游离一些胚乳核,21 d 胚和胚乳已退化,
珠心大部分解体,27 d 珠心全部解体,内珠被退化
成带状痕迹,授粉 33 d 后外珠被也退化成带状痕
迹(图 2,F-I)。
因此,上述结果与杂交情况和授粉后蒴果实际
发育表现一致,表明不亲和障碍主要发生在受精后。
A-E.喜盐鸢尾×黄菖蒲,A.3 d,B.9 d,C.15 d,D.21 d,E,33 d;F-I.黄菖蒲×喜盐鸢尾,F.9 d,G.15 d,H,21 d,I.33 d;MP.珠孔端;EM.原胚;EN.游离
胚乳核;NU.珠心;II.内珠被;OI.外珠被。
图 2 喜盐鸢尾和黄菖蒲正反交胚胎发育过程
2.5 杂种幼胚拯救
黄菖蒲×喜盐鸢尾授粉后 9 d 的杂种胚胎石蜡
切片观察结果表明发育正常,但此时观察到杂种果
实的平均宽度已明显小于黄菖蒲自交组合,预示部
分杂种胚胎败育已经开始,综合考虑后,对黄菖蒲×
喜盐鸢尾幼胚拯救设定了 3 个时间点:授粉后 6、9、
12 d(图 3A)。
授粉后 6 d幼胚拯救采用了胚珠培养和子房培
养 2种方式(表 2)。去除子房外壁的子房切片内部
分胚珠膨大发育(图 3B),最后得到 3粒种皮黑色且
有光泽的种子(图 3C),但培养 3 个月之后逐渐干
瘪,并未萌发。
授粉后 9 d和 12 d的胚珠分别接种在 2种培养
基上(图 3D) ,1 个月之后,2 种培养基上的胚珠均
未膨大,但接种在 MS+2.0 mg·L-16-BA 培养基上
外观保持绿色的胚珠要明显多于同时期接种在 MS
培养基上的数目,表明 MS+2.0 mg·L-16-BA 培养
基要优于 MS培养基。
表 2 黄菖蒲×喜盐鸢尾杂种胚拯救
杂交组合 授粉至接种时间 /d 培养基 接种对象 萌发率 /%
黄菖蒲×喜盐鸢尾 6 MS 胚珠、子房 0
9 MS 胚珠 0
9 MS+6-BA 胚珠 0
12 MS 胚珠 0
12 MS+6-BA 胚珠 0
所有时期接种的胚珠均未萌发,接种后 3 个月
内逐渐褐化并最终全部死亡。
3 结论与讨论
花粉是否具有生命力是确保杂交成功的一个重
要条件,因此,杂交之前有必要对亲本的花粉生命力
69 东 北 林 业 大 学 学 报 第 42卷
进行测定。萌发法是测定花粉活力的常规方法,
TTC法则可以迅速且较精确地反映花粉活性[14]。
本试验采取 2种方法测定亲本活力,喜盐鸢尾的测
定结果较一致;黄菖蒲新鲜花粉的萌发率很低,但
其自交又具有良好结实率,表明花粉是具有良好
活力的,之所以仅少数花粉萌发,可能是由于培养
液成分不能很好满足其萌发所需条件。花粉活力
与遗传和环境有关[14],因此,适宜的培养液成分需
进一步筛选。
A.黄菖蒲×喜盐鸢尾授粉后 9 d的子房;B.子房切片培养授粉后 6 d的子房得到膨大胚珠;C.膨大胚珠发育为黑亮的种子;D.胚珠接种。
图 3 黄菖蒲×喜盐鸢尾杂种胚拯救
鸢尾远缘杂交不亲性主要表现为受精前障碍和
受精后杂种胚败育[3,12-13]。毕晓颖等[12]发现马蔺
和溪荪正反交不亲和原因主要发生在受精前。野鸢
尾和射干正反交杂交障碍存在差异,野鸢尾×射干
不亲和障碍主要发生在受精前,而反交组合不亲和
主要由受精后胚败育导致[13]。而在本研究中,花粉
管行为及杂种胚胎发育观察结果表明,喜盐鸢尾×
黄菖蒲和黄菖蒲×喜盐鸢尾虽然存在一定的受精前
障碍,降低了杂交亲和性,但最终成功受精,而杂种
胚和胚乳的退化则直接导致杂种的彻底败育。因
此,喜盐鸢尾和黄菖蒲正反交杂种败育的主要障碍
存在于受精后。
幼胚拯救的方法是克服远缘杂交受精后障碍的
有效途径[15],根据培养对象的不同,又分为子房培
养、胚珠培养、幼胚培养[16]。通过幼胚拯救获得远
缘杂种已经在某些植物中得以实现[17],而在鸢尾属
植物种间杂交育种中也有成功案例,如:Yabuya et
al.[3]通过幼胚拯救获得了属内种间杂交组合燕子
花×玉蝉花的杂种后代。本试验采用胚珠培养接种
的所有时期的胚珠均未萌发,接种后 3 个月内全部
褐化并死亡,其原因可能与娄琦[18]推测一致,即胚
珠从子房中摘除后不能丛胎座上吸取营养,因而不
能正常生长分化,进而死亡。因此,建议采取去除子
房外壁的子房切片的培养方式。虽然未能通过胚珠
培养获得黄菖蒲×喜盐鸢尾的杂种,对其授粉后 6 d
的杂种子房进行幼胚拯救后,得到发育膨大的胚珠,
并发育为具有正常外观的种子。将种子离体培养 3
个月后逐渐萎缩干瘪,可能是种子内部自身发育不
完善造成其不能正常萌发而最终死亡,这也从侧面
反映了导致黄菖蒲×喜盐鸢尾败育的主要障碍发生
在受精后。因此,认为授粉后 6 d 是黄菖蒲×喜盐鸢
尾幼胚拯救较适宜的时期,进一步深化研究有可能
克服喜盐鸢尾和黄菖蒲种间杂交障碍,获得杂种苗。
参 考 文 献
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