全 文 ：北方园艺２０１４（１５）：１０１～１０５ ·生物技术·
第一作者简介：张国武（１９６６－），男，博士，高级工程师，研究方向为
森林培育。
基金项目：中国林业科学院基金资助项目（ＣＡＦＹＢＢ２０１２００５）。
收稿日期：２０１４－０１－２１
观叶福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立及优化
张 国 武１，黄 涛２，吴 南 生２，张 沛 健１，刘 学 锋１
（１．国家林业局 桉树研究开发中心，广东 湛江５２４０２２；２．江西农业大学 园林艺术学院，江西 南昌３３００４５）
摘 要：以福禄桐叶片为试材，采用正交实验和单因子试验，分析模板ＤＮＡ、Ｍｇ２＋、Ｔａｑ酶、
引物和ｄＮＴＰ五个因子对福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响。结果表明：福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应
体系为在２５μＬ反应体系中，模板ＤＮＡ为１５ｎｇ，Ｍｇ
２＋３．０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶０．５Ｕ，引物０．６μｍｏｌ／Ｌ，
ｄＮＴＰ ０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ，通过梯度ＰＣＲ试验得到相应引物最佳退火温度为４７℃；该试验可为福禄桐
遗传多样性分析和亲缘关系等提供理论基础。
关键词：福禄桐；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应；梯度ＰＣＲ；退火温度
中图分类号：Ｓ ６８２．３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１４）１５－０１０１－０５
福禄桐（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ）属五加科福禄桐属常绿灌木或小
乔木，又名南洋参，原产于太平洋诸岛，株形柔和，古朴
优雅，叶片与茎干奇特优美［１］。株高１～３ｍ，株型高大、
饱满，侧枝细长，分支皮孔显著，枝繁叶茂，叶色多彩，性
喜高温多湿，耐旱耐阴。由于其独特的魅力成为近些年
来非常流行的一类观叶植物类群，又因其名字含有“福
禄”一词，有富贵吉祥的美好寓意，广受人们的喜爱，主
要用于庭院美化和盆栽。调查研究表明，国外的研究主
要集中在观叶福禄桐的起源、化学成分以及药理作
用［２－４］；国内则主要集中研究观叶福禄桐的栽培、繁殖和
观赏价值［５－６］，而国内外对其遗传学背景研究尚鲜见报
道，导致观叶福禄桐品种混杂、分类标准不统一、优良种
质资源稀缺、制约其快速良好的发展，目前急需对其遗
传结构及遗传多样性做全面的研究。
ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ）由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ
等［７］于１９９４年创建，因其具有分布广、多态性高、技术难
度低、操作简单、重复性高、成本低等优点，是近年来应
用较为广泛的分子遗传标记技术，它来源于植物基因组
中丰富的简单序列重复（ＳＳＲ），由２～４个随机的核苷酸
锚定在微卫星序列的３′端或５′端，由此组成的单引物进
行重复序列间ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增［８］。该试验选用羽叶
福禄桐（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ ｆｒｕｔｉｃｏｓａ ｖａｒ．ｐｌｕｍａｔａ Ｂａｉｌｅｙ）为材料，
对ＰＣＲ反应的主要影响因子模板ＤＮＡ、Ｔａｑ聚合酶、引
物、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ以及退火温度进行分析，旨在建立福禄
桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系，为今后福禄桐种质资源遗
传多样性和亲缘关系的研究提供了分子水平的借鉴与
参考。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试福禄桐植株采自于广东省湛江市南方国家级
种苗基地，取生长健壮、无病虫害危害幼嫩叶片－７０℃
冰箱保存备用。
引物参照加拿大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）［９］所设计的
引物序列，由铂尚生物技术（上海）公司合成；Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、１０×ｂｕｆｅｒ和ＤＳＴＭ５０００Ｍａｒｋｅｒ购
于广州东盛生物公司；ＰＣＲ仪美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ（伯乐公司）
Ｃ－１０００，试验于国家林业局桉树研究开发中心实验室内
完成。
１．２ 试验方法
１．２．１ 福禄桐基因组ＤＮＡ提取与检测 采用改良的
ＣＴＡＢ法［１０－１１］提取５个福禄桐属植物叶片基因组ＤＮＡ，
它们分别为Ｃ１圆叶福禄桐（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ（Ｎ．Ｌ．
Ｂｕｒｍａｎ）Ｆｏｓｂｅｒｇ），Ｃ２线叶南洋森（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ ｃｕｍｉｎｇｉ－
ａｎａ（Ｃ．Ｐｒｅｓｌ）Ｆｅｒｎáｎｄｅｚ－Ｖｉｌａｒ），Ｃ３银边福禄桐（Ｐｏｌｙｓ－
ｃｉａｓ ｇｕｉｌｆｏｙｌｅｉ），Ｃ４南洋森（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ ｆｒｕｔｉｃｏｓａ（Ｌｉｎｎａｅ－
ｕｓ）Ｈａｒｍｓ），Ｃ５银边圆叶福禄桐（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ ｂａｌｆｏｕｒｉａｎａ
ｃｖ．Ｍａｒｇｉｎａｔａ）；用１×ＴＡＥ电泳缓冲液，在１．５％琼脂糖
（含ＥＢ终浓度为０．５μｇ／ｍＬ）凝胶中电泳，条件为８５Ｖ，
５０ｍｉｎ；凝胶成像系统下（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）观察并记录，以初步
检测基因组ＤＮＡ的完整度和质量；通过核酸检测仪
（Ｂｉｏ－Ｒａｄ生产的Ｔｈｅｒｍｏ Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ２０００）检测其浓度及
纯度。
１．２．２ 福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系和条件 试验采用
Ｌ１６（４５）正交设计，对ＰＣＲ反应中５个因素（Ｍｇ２＋浓度、
模板ＤＮＡ浓度、ｄＮＴＰ浓度、引物浓度、Ｔａｑ酶浓度）进
１０１
·生物技术· 北方园艺２０１４（１５）：１０１～１０５
行优化，选用通用引物 ＵＢＣ８０７，每个处理３次重复。
ＰＣＲ反应的因素水平见表１，Ｌ１６（４５）设计方案见表２。
反应体系为２５μＬ，内含１×ｂｕｆｅｒ。反应条件：９４℃预变
性４ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，５２℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，
循环３５次；７２℃延伸７ｍｉｎ；４℃保存。取ＰＣＲ产物于
１．５％琼脂糖（含ＥＢ终浓度为０．５μｇ／ｍＬ）凝胶中电泳
（８５Ｖ，１ｈ），然后在凝胶成像系统下观察并成像记录，参
照何文正等［１２］、唐辉等［１３］方法，依据条带数、清晰度和
特异性对ＰＣＲ扩增结果进行依次打分。３次重复分别
独立统计。
表１ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的因素水平
Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ
因素
Ｆａｃｔｏｒ
水平（体系终浓度）Ｌｅｖｅｌ（Ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
１ ２ ３ ４
Ｔａｑ酶
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／Ｕ·（２５μＬ）－１
０．５ １．０ １．５ ２．０
ｄＮＴＰ／ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ０．１５ ０．２０ ０．２５ ０．３０
引物
Ｐｒｉｍｅｒ／μｍｏｌ·Ｌ－１ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８
Ｍｇ２＋／ｍｍｏｌ·Ｌ－１ １．５ ２．０ ２．５ ３．０
模板ＤＮＡ
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ／ｎｇ·（２５μＬ）－１
１０ １５ ２０ ２５
表２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交实验设计（Ｌ１６（４５））
Ｔａｂｌｅ ２ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
ｓｙｓｔｅｍ（Ｌ１６（４５））
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
模板ＤＮＡ
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ
／ｎｇ·（２５μＬ）－１
Ｍｇ２＋
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
／μｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔａｑ酶
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
／Ｕ·（２５μＬ）－１
ｄＮＴＰ
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
１ １０ １．５ ０．２ ０．５ ０．１５
２ １０ ２．０ ０．４ １．０ ０．２０
３ １０ ２．５ ０．６ １．５ ０．２５
４ １０ ３．０ ０．８ ２．０ ０．３０
５ １５ １．５ ０．４ １．５ ０．３０
６ １５ ２．０ ０．２ ２．０ ０．２５
７ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２０
８ １５ ３．０ ０．６ １．０ ０．１５
９ ２０ １．５ ０．６ ２．０ ０．２０
１０ ２０ ２．０ ０．８ １．５ ０．１５
１１ ２０ ２．５ ０．２ １．０ ０．３０
１２ ２０ ３．０ ０．４ ０．５ ０．２５
１３ ２５ １．５ ０．８ １．０ ０．２５
１４ ２５ ２．０ ０．６ ０．５ ０．３０
１５ ２５ ２．５ ０．４ ２．０ ０．１５
１６ ２５ ３．０ ０．２ １．５ ０．２０
１．２．３ 福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应单因子试验设计 据正
交实验初步建立的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，按照一定的浓
度梯度适当变化，进行单因子（Ｍｇ２＋、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰ、
引物、Ｔａｑ酶）试验，每个处理重复２次，试验设计见表
３，找出适合福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系。
１．２．４ 引物退火温度优化试验 在正交实验和单因子
试验建立的最佳反应体系基础上，进行退火温度试验，
退火温度在４６～５７℃，扩增仪自动生成８个梯度４６．０、
表３ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ单因子试验设计
Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
编号
Ｎｏ．
模板ＤＮＡ
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ
／ｎｇ·（２５μＬ）－１
Ｍｇ２＋
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
／μｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔａｑ酶
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
／Ｕ·（２５μＬ）－１
ｄＮＴＰ
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
１ １２．５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
２ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
３ １７．５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
４ ２０ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
５ １５ ２．０ ０．８ ０．５ ０．２
６ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
７ １５ ３．０ ０．８ ０．５ ０．２
８ １５ ３．５ ０．８ ０．５ ０．２
９ １５ ２．５ ０．４ ０．５ ０．２
１０ １５ ２．５ ０．６ ０．５ ０．２
１１ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
１２ １５ ２．５ １．０ ０．５ ０．２
１３ １５ ２．５ ０．８ ０．２ ０．２
１４ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
１５ １５ ２．５ ０．８ ０．８ ０．２
１６ １５ ２．５ ０．８ １．０ ０．２
１７ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．１６
１８ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２
１９ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２４
２０ １５ ２．５ ０．８ ０．５ ０．２８
４６．７、４８．２、５０．３、５３、５５．２、５６．４、５７．０℃，筛选出该引物的
最佳退火温度。
１．３ 数据分析
试验数据采用ＳＰＳＳ １７．０进行方差分析。
图１ 福禄桐５个品种ＤＮＡ质量检测
注：Ｃ１～Ｃ５分别代表圆叶福禄桐、线叶南洋森、银边福禄桐、南洋森、
银边圆叶福禄桐。Ｍ为ｍａｒｋｅｒ。
Ｆｉｇ．１ Ｑｕａｌｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ
Ｎｏｔｅ：Ｃ１～Ｃ５ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｒｏｕｎｄ ｌｅａｆ Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ，ｌｉｎｅ ｌｅａｆ Ｐｏｌｙｓｉａｓｆｒｕｔｉｃｏ－
ｓａ，ｓｉｌｖｅｒｓｉｄｅ Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ，Ｐｏｌｙｓｉａｓ ｆｒｕｔｉｃｏｓａ，ｓｉｌｖｅｒｓｉｄｅ ｒｏｕｎｄ ｌｅａｆ Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ，ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍ ｉｓ ｍａｒｋｅｒ．
２ 结果与分析
２．１ 基因组ＤＮＡ提取与检测
该试验通过改良的ＣＴＡＢ法提取５种福禄桐属植
物叶片基因组ＤＮＡ进行电泳检测，结果表明条带清
晰，无降解（图１）；核酸检测仪测定ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值在
１．７５～１．９５之间，表明所提取基因组ＤＮＡ中蛋白质和
ＲＮＡ含量较少，纯度较高，符合后续的试验要求。为了
２０１
北方园艺２０１４（１５）：１０１～１０５ ·生物技术·
统一反应体系，最后根据样品测得的浓度相应地稀释成
２０ｎｇ／μＬ。
２．２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交设计直观分析
正交试验ＰＣＲ电泳结果见图２～５，１６个处理分数
见表４。
表４ １６个处理评分
Ｔａｂｌｅ ４ Ｔｈｅ ｐｏｉｎｔ ｔａｂｌｅ ｏｆ １６ｍａｎａｇｅｓ
重复
Ｒｅｐｅａｔ
组合Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６
１ ５ ７ １０ １２ ４ ７ １４ １３ ２ ５ １２ １３ １０ ５ ５ ７
２ ４ ８ １０ １２ ４ ８ １６ １２ １ ５ １３ １３ ９ ３ ４ ８
３ ４ ８ １１ １１ ４ ７ １５ １１ ２ ６ １３ １３ ９ ５ ５ ８
图２ ＰＣＲ产物电泳结果
注：数字代表表２中的处理组合。下同。
Ｆｉｇ．２ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
Ｎｏｔｅ：Ｎｕｍｂｅｒｓ ｍｅａｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｂｌｅ ２，ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图３ ＰＣＲ产物电泳结果
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
图４ ＰＣＲ产物电泳结果
Ｆｉｇ．４ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
图５ ＰＣＲ产物电泳结果
Ｆｉｇ．５ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
２．３ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交结果方差分析
由表５可知，由Ｆ值可知，各因素水平变化对ＰＣＲ
反应的影响大小依次为 Ｍｇ２＋、Ｔａｑ 聚合酶、Ｐｒｉｍｅｒ、
ｄＮＴＰ、模板ＤＮＡ，各因素水平间的差异均达到显著水
平，可以进行下游试验，进一步细调各因素内水平。
表５ ＰＣＲ反应各因素间的方差分析
Ｔａｂｌｅ ５ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＰＣＲ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ
自由度
ＤＦ
平方和
ＳＳ
均方
ＭＳ
Ｆ值
Ｆｖａｌｕｅ
模板ＤＮＡ
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ
３ ５８．７２９ １９．５７６ ４４．７４６＊＊
镁离子 Ｍｇ２＋ ３ ３５８．３９６ １１９．４６５ ２７３．０６３＊＊
引物Ｐｒｉｍｅｒ ３ ７９．０６３ ２６．３５４ ６０．２３８＊＊
Ｔａｑ酶
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
３ １３４．３９６ ４４．７９９ １０２．３９７＊＊
ｄＮＴＰ ３ ７０．７２９ ２３．５７６ ５３．８８９＊＊
误差Ｅｒｒｏｒ ３２ １４．０００ ０．４３７
总和Ｓｕｍ ４８ ３ ９３３．０００
图６ 模板浓度对ＰＣＲ反应的影响
注：１、２、３、４分别代表１２．５、１５．０、１７．５、２０．０ｎｇ／２５μＬ。
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ
Ｎｏｔｅ：１，２，３，４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ １２．５，１５．０，１７．５，２０．０ｎｇ／２５μＬ．
２．４ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ单因素试验结果分析
２．４．１ 模板浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响 ＤＮＡ模板浓度
对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应影响最小，从图６可知，ＤＮＡ模板浓
度分别为１２．５、１５．０、１７．５ｎｇ／２５μＬ时条带亮度和多态
性差异不大，而浓度为２０．０ｎｇ／２５μＬ条带亮度有所减
弱。因此，综合上述正交实验模板用量１５．０ｎｇ较为
合适。
３０１
·生物技术· 北方园艺２０１４（１５）：１０１～１０５
２．４．２ Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响 Ｍｇ２＋浓度不仅
影响酶的活性，还能与反应中的引物、模板、ｄＮＴＰ结合，
影响模板与引物的结合率，产生非特异性［１４］。结合图７
可知，随着Ｍｇ２＋浓度逐渐提高，条带亮度由暗变亮在变
暗，Ｍｇ２＋浓度在３．０ｍｍｏｌ／Ｌ条带亮度高，特异性好。因
此福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系Ｍｇ２＋最佳浓度３．０ｍｍｏｌ／Ｌ。
图７ Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ反应的影响
注：１：２．０ｍｍｏｌ／Ｌ；２：２．５ｍｍｏｌ／Ｌ；３：３．０ｍｍｏｌ／Ｌ；４：３．５ｍｍｏｌ／Ｌ。
Ｆｉｇ．７ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｇ２＋
Ｎｏｔｅ：１，２，３，４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ２．０，２．５，３．０，３．５ｍｍｏｌ／Ｌ．
２．４．３ 引物浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响 引物浓度会影
响ＰＣＲ结果的可靠性，浓度偏高会引起错配和非特异
性产物扩增，且会增加引物之间形成二聚体的概率，浓
度过低则无法检测出所有ＩＳＳＲ位点［１５］。由图８可
知，随着引物浓度的升高，条带亮度有所下降并出现弥
散现象，考虑到成本和综合上述正交实验引物最佳浓
度为０．６μｍｏｌ／Ｌ。
图８ 引物浓度对ＰＣＲ反应的影响
注：１：０．４μｍｏｌ／Ｌ；２：０．６μｍｏｌ／Ｌ；３：０．８μｍｏｌ／Ｌ；４：１．０μｍｏｌ／Ｌ。
Ｆｉｇ．８ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ
Ｎｏｔｅ：１，２，３，４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ０．４，０．６，０．８，１．０μｍｏｌ／Ｌ．
２．４．４ Ｔａｑ酶浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响 Ｔａｑ酶是影
响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应中的一个重要因素，图９中Ｔａｑ酶浓
度为０．２、０．５Ｕ／２５μＬ时，条带亮度较好，多态性高；随
着浓度升高至０．８、１．０Ｕ／２５μＬ，条带多态性没有明显变
化，但亮度反而有所降低并出现弥散现象。从经济和试
验效果考虑，Ｔａｑ酶最适宜浓度为０．５Ｕ／２５μＬ。
图９ Ｔａｑ酶浓度对ＰＣＲ反应的影响
注：１：０．２Ｕ／２５μＬ；２：０．５Ｕ／２５μＬ；３：０．８Ｕ／２５μＬ；４：１．０Ｕ／２５μＬ。
Ｆｉｇ．９ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｎｏｔｅ：１，２，３，４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ０．２，０．５，０．８，１．０Ｕ／２５μＬ．
２．４．５ ｄＮＴＰ浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响 ｄＮＴＰ是ＰＣＲ
反应中合成新核苷酸的原料和提供能量的来源，因此
ｄＮＴＰ在ＰＣＲ反应中发挥着重要作用。由图１０可知，
ｄＮＴＰ浓度为０．１６、０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ时，条带较暗且出现弥
散现象；而浓度为０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ条带清晰，多态性好。
结合正交实验ｄＮＴＰ浓度为０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ较为合适。
图１０ ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ反应的影响
注：１：０．１６ｍｍｏｌ／Ｌ；２：０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ；３：０．２４ｍｍｏｌ／Ｌ；４：０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ。
Ｆｉｇ．１０ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄＮＴＰ
Ｎｏｔｅ：１，２，３，４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ０．１６，０．２０，０．２４，０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ．
２．５ 退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
退火温度为引物和模板ＤＮＡ结合时候的温度参
数，是影响ＰＣＲ特异性较重要因素。由图１１可知，退火
温度逐渐升高，条带逐渐减少，亮度减弱，弥散现象严重，
当退火温度在４６．７℃，产生的条带质量最好，较为适合。
３ 结论与讨论
试验结果表明，福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ２５μＬ反应体系
中５个因子的最佳水平为ＤＮＡ模板浓度为１５ｎｇ，Ｍｇ２＋
浓度为３．０ｍｍｏｌ／Ｌ，引物浓度０．６μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶含量
０．５Ｕ，ｄＮＴＰ浓度为０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ，内含２．５μＬ １０×ＰＣＲ
ｂｕｆｅｒ。反应程序：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，４７℃
４０１
北方园艺２０１４（１５）：１０１～１０５ ·生物技术·
图１１ 退火温度对ＰＣＲ反应的影响
注：１～８对应退火温度为４６．０、４６．７、４８．２、５０．３、５３．０、５５．２、
５６．４、５７．０℃。
Ｆｉｇ．１１ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
Ｎｏｔｅ：Ｎｕｍｂｅｒ １～８ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ４６．０，４６．７，４８．２，５０．３，
５３．０，５５．２，５６．４，５７．０℃．
退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，循环３５次；７２℃延伸７ｍｉｎ；４℃
保存。
ＩＳＳＲ分子标记的扩增结果受反应条件、扩增程序
以及物种的不同影响［１６］。试验表明，模板ＤＮＡ用量、
Ｍｇ２＋浓度、Ｐｒｉｍｅｒ浓度、Ｔａｑ酶含量、ｄＮＴＰ浓度以及退
火温度对福禄桐ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应都有不同程度的影响；
其中以Ｍｇ２＋、Ｔａｑ酶、引物影响较大，其浓度过高主带
亮度有所变暗且出现弥散现象。每个引物有其相对应
的退火温度，引物的退火温度对ＰＣＲ扩增影响较大，温
度过低导致不完全配对的位点得到扩增，产生部分非特
异性片段，相反温度过高，则引物与模板难结合，扩增反
应受抑制，扩增片段减少。
该研究结合正交实验和单因子试验对福禄桐ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应体系进行优化，既排除了各因素之间互作对反
应体系的影响，又设置了较多的水平梯度，从而较快的
建立满意的试验结果，但正交设计直观分析法也存在一
定的局限性，如对试验结果本身的评价带有主观成分，
打分的先后次序直接影响分析结果，使影响因素最佳反
应水平的确定缺乏可靠性。此外，试验过程中易受一些
人为因素、试验药品、试验器材等因素的影响，试验偶然
性也比较大。因此，在试验过程中，应由固定人员操作，
选择同一批试剂和器材，多次重复进行试验，以减少误差。
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ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｒｏｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ｅｔｃ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ｇｒａｄｉｅｎｔ ＰＣＲ；ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
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