全 文 ：云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University，2012，27 (5) :746 － 750 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 － 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2011 － 09 － 11 修回日期:2012 － 05 － 19 网络出版时间:2012 － 09 － 07 11∶ 00
* 基金项目:云南省应用基础研究项目 (2010ZC089) ;国家林业局“948”项目 (2008 － 4 － 11) ;云南省省部级重
点学科、省高校重点实验室及校实验室共享平台资助项目;西南林业大学科技创新基金。
作者简介:孙正海 (1978 －) ，男，山东昌邑人，博士，副教授，主要从事园林植物种质资源评价、采后保鲜及
生物技术辅助育种研究。E-mail:sunzhenghai1978@ 163. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20120907. 1100. 201205. 746_022. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 － 390X (n). 2012. 05. 022
滑叶藤 ISSR-PCR反应体系建立及优化*
孙正海1，王 锦1，李世峰2，林开文1，胡祎晨1，王仕锦1
(1． 西南林业大学 园林学院，云南 昆明 650224;2． 云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205)
摘要:为建立和优化滑叶藤 ISSR-PCR 反应体系，运用正交试验和单因子试验分析模板 DNA，TagDNA 聚合
酶，Primer，Mg2 +和 dNTPs 5 个因子对滑叶藤 ISSR-PCR反应影响。结果表明了滑叶藤 ISSR-PCR 25 μL反应体
系中 5 个因子最佳水平:DNA模板为 8. 4 ng，TagDNA聚合酶为 2. 0 u，Primer浓度为 0. 8 mmol /L，dNTPs浓度
为 0. 68 mmol /L，Mg2 +浓度为 2. 4 mmol /L。该反应体系为利用 ISSR分子标记技术研究铁线莲属植物提供了可
靠方法。
关键词:滑叶藤;ISSR-PCR反应;体系优化
中图分类号:S 687. 2 文献标识码:A 文章编号:1004 － 390X (2012)05 － 0746 － 05
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction
System for Clematis fasciculifloora Franch.
SUN Zheng-hai1，WANG Jin1，LI Shi-feng2，LIN Kai-wen1，HU Yi-chen1，WANG Shi-jin1
(1． School of Horticulture and Gardening，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China;
2． Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China)
Abstract:Effect for ISSR-PCR reaction of Clematis fasciculifloora Franch. on five factors (DNA tem-
plate，TagDNA，primer，Mg2 + and dNTPs)were analyzed by orthogonal design and respective factor
design for establishing and optimizing ISSR-PCR reaction system of C. fasciculifloora Franch. . As a
result，the optimal ISSR-PCR reaction system (25 μL)mixture contained 8. 4 ng DNA template，2. 0 u
TagDNA，0. 8 mmol /L primer，2. 4 mmol /L Mg2 + and 0. 68 mmol /L dNTPs. Theory sustaining for
studying Clematis L. plant by ISSR molecular marker were afforded from this experiment.
Key words:Clematis fasciculifloora Franch. ;ISSR-PCR reaction;optimization of system
铁线莲属于毛茛科 (Ranunculaceae)铁线
莲属 (Clematis) ，全世界约有 355 种［1］，中国
有该属植物约 147 种［2 － 3］。铁线莲属植物被称为
“攀援植物皇后”［4］，具有极高的观赏价值。同
时，铁线莲属植物还具有较高的药用价值，其
含有的三萜皂甙以及原白头翁素等生理活性成
分，是我国中医临床和民间常用的利尿通淋或
祛风止痛类药物［5］。铁线莲虽因兼具观赏和药
用价值而具广泛的市场开发前景，但其分类却
一直存在争议。如日本 TAMURA 等［6 － 7］据幼苗
叶的生长状态及花形状和雄蕊被毛情况等，将
铁线莲属划分为 4 个亚属，并认为花萼片钟状
(或管状)及雄蕊被毛的类群是原始类群，花萼
水平开展及雄蕊无毛的类群是进化类群;而英
国学者 GREY-WILSON［8］将铁线莲属划分为 9 个
亚属，并主张将花萼水平开展及雄蕊无毛的类
群作为原始类群;中国王文采［1］则认为应依据
萼片由水平开展到向上直展和雄蕊从无毛到有
毛评价铁线莲演化趋势。笔者认为产生分歧原
因主要在于前人多以形态性状如花萼、被毛、
叶片等为评价指标进行分类，而这些指标易受
环境和观察者主观判断影响，因此应从分子水
平对铁线莲属植物分类进行修订。但到目前为
止，还未见从分子水平对铁线莲属植物进行分
类相关报道。
ISSR (inter-simple sequence repeat)由 ZIET-
KIEWICZ 等于 1994 年创建，因其具有分布广、
多态性高、DNA 用量少且质量要求低、无辐射、
技术难度低、操作简单、重复性高、耗时少、成
本低等优点，广泛用于遗传和物理图谱建立、基
因定位与克隆、数量性状位点遗传分析、遗传多
样性评估、物种起源和分子标记辅助育种等［9］。
因不同植物对 ISSR-PCR 反应体系要求不同，因
此在利用 ISSR标记之前，必须建立该种植物最适
ISSR-PCR反应体系。本研究是云南省应用基础项
目“铁线莲属植物遗传多样性研究及分子身份证
构建”的前期研究成果，旨在以滑叶藤为例，通
过正交试验和单因子试验，建立铁线莲属植物 IS-
SR-PCR反应体系，为利用 ISSR 标记对其进行后
续研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
滑叶藤来自于云南省农业科院花卉所种质资
源圃。作如下预处理:用 70% 酒精擦洗叶片表
面， － 70℃冰箱保存备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 滑叶藤基因组 DNA提取
采用 改 良 CTAB 法 提 取 滑 叶 藤 基 因
组 DNA［10］。
1. 2. 2 滑叶藤 ISSR-PCR反应引物筛选
从加拿大哥伦比亚大学公布的 60 个 ISSR引物
中随机选择 8个引物:801 (AT)8T，804 (AT)8A，
812 (GA)8A，818 (CA)8G，831 (AC)8YA，836
(AT)8YA，838 (TA)8RC，848 (CA)8RG 进行目
标引物筛选。初反应体系中 Taq 酶浓度 1 u /25μL，
Mg2 +浓度 2 mmol /L，DNA 浓度 6 ng / (25 μL) ，
dNTP浓度 0. 4 mmol /L，引物浓度 2 mmol /L，共计
25 μL。扩增程序为:94℃预变性3 min，94℃变性
45 s，52. 5℃退火 45 s，72℃延伸90 s，共 40 个循
环，72℃延伸 5 min。采用 1%琼脂糖凝胶电泳进行
扩增产物检测。
1. 2. 3 滑叶藤 ISSR-PCR反应体系建立
对滑叶藤 ISSR 反应 5 因素 (Taq 酶浓度、
Mg2 +浓度、DNA浓度、dNTPs 浓度、目标引物浓
度)进行 4 浓度梯度试验，共 16 个处理 L16
(45) ，每处理重复 3 次，建立滑叶藤 ISSR-PCR
反应体系。
1. 2. 4 滑叶藤 ISSR-PCR反应单因子设计
按正交试验建立的 ISSR-PCR 反应体系进行
单因子 (Taq 酶浓度、Mg2 + 浓度、DNA 浓度、
dNTP浓度、引物浓度)试验，分析不同因素对
滑叶藤 ISSR-PCR反应影响。
2 结果与分析
2. 1 目标引物确定
采用试验方法 1. 2. 2 所示反应体系和反应程
序，8 个引物中的 4 个有扩增结果，分别为 812，
818，836 和 848 (图 1)。进一步比较扩增带清晰
度和多态性，引物 812 效果最好，故确定引物
812 为目标引物进行滑叶藤 ISSR-PCR 反应体系
建立。
2. 2 滑叶藤 ISSR-PCR正交试验结果
基于引物 812 的滑叶藤 ISSR-PCR 反应体系 5
因素 4 梯度正交试验设计为表 1，正交试验结果
为图 2。如图 2 所示，16 个处理中有 7 个处理
(处理 3，4，7，8，12，15，16)能够扩增出清
晰条带，且每个处理 3 个重复效果一致。进一步
从带的清晰度和多态性比较 7 个处理的扩增效果，
处理 16 带多态性最好 (每个重复有 9 条带)、条
带最清晰。由表 1，该体系 DNA浓度为 7. 2 ng /25
μL，Taq酶浓度为 2. 8 u /25μL，Mg2 +浓度为 2. 4
mmol /L，引物浓度为 0. 8 mmol /L，dNTPs 浓度为
0. 44 mmol /L。以此为基础，对上述 5 个因子分别
设 5 个浓度梯度 (表 2) ，进行单因子试验设计，
探讨 5 个因子对滑叶藤 PCR-ISSR反应体系影响。
747第 5 期 孙正海，等:滑叶藤 ISSR-PCR反应体系建立及优化
表 1 滑叶藤 ISSR-PCR 反应体系正交试验设计
Tab. 1 Orthogonal design for ISSR-PCR reaction of C． fasciculifloora
试验号
No．
w (模板 DNA ) /
［ng· (25 μL)－ 1］
model DNA
w (Taq 酶) /
［u· (25 μL)－ 1］
Taq polymerase
w (引物) /
(mmol·L －1)
primer
w (dNTPs) /
(mmol·L －1)
w (Mg2 +) /
(mmol·L －1)
1 3. 6 0. 4 0. 4 2. 0 1. 2
2 3. 6 1. 2 0. 8 0. 8 1. 6
3 3. 6 2. 0 1. 2 4. 4 2. 0
4 3. 6 2. 8 1. 6 3. 2 2. 4
5 4. 8 0. 4 1. 6 3. 2 1. 6
6 4. 8 1. 2 1. 2 4. 4 1. 2
7 4. 8 2. 0 0. 8 0. 8 2. 4
8 4. 8 2. 8 0. 4 2. 0 2. 0
9 6. 0 0. 4 0. 8 4. 4 2. 4
10 6. 0 1. 2 0. 4 3. 2 2. 0
11 6. 0 2. 0 1. 6 2. 0 1. 6
12 6. 0 2. 8 1. 2 0. 8 1. 2
13 7. 2 0. 4 1. 2 0. 8 1. 2
14 7. 2 1. 2 1. 6 0. 2 2. 0
15 7. 2 2. 0 0. 4 0. 32 1. 6
16 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
847 云南农业大学学报 第 27 卷
表 2 滑叶藤 PCR-ISSR反应体系单因子试验设计
Tab. 2 Single factor design for ISSR-PCR reaction system of C. fasciculifloora
试验号
No．
w (模板 DNA ) /
［ng· (25 μL)－ 1］
model DNA
w (Taq 酶) /
［u· (25 μL)－ 1］
Taq polymerase
w (引物) /
(mmol·L －1)
primer
w (dNTPs) /
(mmol·L －1)
w (Mg2 +) /
(mmol·L －1)
1 6. 0 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
2 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
3 8. 4 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
4 9. 6 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
5 7. 2 2. 0 0. 8 0. 44 2. 4
6 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
7 7. 2 3. 6 0. 8 0. 44 2. 4
8 7. 2 4. 4 0. 8 0. 44 2. 4
9 7. 2 2. 8 0. 6 0. 44 2. 4
10 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
11 7. 2 2. 8 1. 0 0. 44 2. 4
12 7. 2 2. 8 1. 2 0. 44 2. 4
13 7. 2 2. 8 0. 8 0. 32 2. 4
14 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
15 7. 2 2. 8 0. 8 0. 56 2. 4
16 7. 2 2. 8 0. 8 0. 68 2. 4
17 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 0
18 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 4
19 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 2. 8
20 7. 2 2. 8 0. 8 0. 44 3. 2
2. 3 滑叶藤 ISSR-PCR单因子试验结果
图 3 为不同 DNA浓度、Taq 酶浓度、Mg2 +浓
度、引物浓度和 dNTPs 浓度对滑叶藤 PCR-ISSR
反应结果影响。模板 DNA 浓度在 6. 0 ～ 8. 4 ng /
25 μL范围变化时，ISSR-PCR 扩增条带数量和亮
度基本一致，即模板 DNA 浓度不影响 ISSR-PCR
扩增效果;而当浓度增至 9. 6 ng /25 μL 时，扩增
条带数量减少、亮度减弱。由此，滑叶藤模板
DNA浓度在一定范围内不影响 ISSR-PCR 反应效
果，但随着浓度进一步提高会降低 ISSR-PCR 反
应效果。考虑到 DNA 消耗，认为滑叶藤 ISSR-
PCR 反应体系模板 DNA浓度以 6. 0 ng /25μL。
947第 5 期 孙正海，等:滑叶藤 ISSR-PCR反应体系建立及优化
Taq 酶浓度在 2. 0 ～ 4. 4 u /25μL 变化时，IS-
SR-PCR扩增条带数量一致，都为 2 条主带和 5 条
次带，但带的亮度有逐渐变暗的趋势，因此
2. 0 u /25 μLTaq 酶浓度为滑叶藤 ISSR-PCR 反应
体系适宜浓度。
引物浓度对滑叶藤 ISSR-PCR 反应影响相对
复杂，在 0. 6 ～ 0. 8 mmol /L 范围时，引物浓度越
高，扩增条带越亮;而当引物浓度在 0. 8 ～
1. 2 mmol /L范围时，浓度升高，扩增条带逐渐变
暗。故 0. 8 mmol /L 为滑叶藤 ISSR-PCR 反应体系
适宜引物浓度。
dNTPs浓度在 0. 32 ～ 0. 68 mmol /L 范围变化
时，dNTPs浓度越高，扩增条带越亮，但带的数
量没有变化，说明 dNTPs 浓度会影响滑叶藤 IS-
SR-PCR反应条带亮度但不影响条带数量。
Mg2 +浓度在 2. 0 ～ 3. 2 mmol /L 范围变化时时，
铁线莲 ISSR-PCR扩增结果出现了先增加后减弱的
趋势，在浓度为 2. 4 mmol /L 时，条带数量最多、
亮度最强，低于 2. 4 mmol /L时条带较暗，高于 2. 4
mmol /L时不能扩增出条带。因此，2. 4 mmol /L 为
滑叶藤 ISSR-PCR反应体系适宜 Mg2 +浓度。
3 讨论
正交试验和单因子试验显示滑叶藤 ISSR-PCR
25 μL反应体系中 5 个因子的最佳水平:DNA 模
板为 8. 4 ng / (25 μL)、TagDNA 聚合酶为 2. 0 u /
(25 μL)、Primer浓度为 0. 8 mmol /L，dNTPs浓度
为 0. 68 mmol /L，Mg2 +浓度为 2. 4 mmol /L。
ISSR-PCR因其引物的非特异性，在研究基础
相对薄弱的植物上应用较多，如在灯盏花［11］、半
夏［12］和山荆子［13］等中药材以及勃氏甜龙竹［14］、
龙牙百合［15］、女贞［16］、枇杷［17］等园林植物。IS-
SR-PCR 反应体系是一个多因子协同控制的综合
反应，单独各因子对反应有影响，各因子之间也
影响反应结果。因此单纯的单因子试验和正交试
验不能准确判断各因子对反应结果的影响。因此
试验综合采用了单因素和正交试验建立滑叶藤 IS-
SR-PCR反应体系。采用单因素试验进行优化，可
以设置较多的水平梯度，以得到比较精确的单因
素最优水平 同时，进行正交试验设计，可以排除
各因素之间互作对最终体系的影响。本试验结果
为进一步利用 ISSR分子标记技术对铁线莲属植物
进行种质资源鉴定、遗传多样性分析及遗传图谱
构建等研究奠定了基础。
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