全 文 ：蛋白质失去了天然结构，形成有序的三级结构和连续
性的黏性面团，并在螺杆的压力作用下，蛋白质之间
不断相互分离，又不断熔合，在这个过程中发生了蛋
白质之间的交叉耦合和耦合本质上的变化，蛋白质形
成了交叉网状结构，最后在模头处被定向，最终形成
了纤维状的组织化蛋白[5]。而本实验鱼粉不能组织化
的原因可能就是鱼粉和大豆蛋白的混合体系存在相
分离趋势。这说明在料筒内鱼粉和大豆分离蛋白在相
同的温度和压力条件下，鱼粉和大豆分离蛋白很可能
没有同时达到熔融状态，这直接导致了鱼粉和大豆分
离蛋白在螺杆的挤压下前进的速度不同，使鱼粉和大
豆分离蛋白两相分离，从而导致了鱼粉没有参与与蛋
白质之间的反应，造成了鱼粉不能组织化，随着添加
鱼粉含量的增加，产品硬度增大，弹性下降的结果。
参考文献
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版社，2003:61-80.
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[5] 魏益民,康立宁,张汆.食品挤压理论与技术:中卷[M] .北京:中国轻
工业出版社, 2009: 34-56, 140-159.
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）
植物提取物是芳香、挥发性化合物的混合物，根
据植物材料的芳香特性而命名并由这些植物提取获
得。止痢草（牛至）植物提取物（香芹酚和百里香酚）、
肉桂植物提取物（肉桂醛）、麝香草属植物提取物（麝
香草酚）和芸香料灌木提取物（甲基紫罗兰酮）等 4种
植物提取物的纯化成分已有较多研究和报道，很多研
究报道了肉桂属、麝香草属和止痢草植物提取物具有
叶金明，江苏省扬州市水产生产技术指导站，225000，江
苏省扬州市。
金立志，英国美瑞康（广州）生物科技有限公司。
郑宗林（通讯作者），西南大学鱼类繁殖与健康养殖中心。
收稿日期：2011-06-28
摘 要：嗜水气单胞菌是淡水鱼流行性败血症的主要致病菌。在采用添加 150 mg/kg剂量的止痢
草提取物饲料投喂 3周后，对罗非鱼腹腔注射嗜水气单胞菌，在其攻毒 168 h后，采用常规石蜡切片技
术和电镜超薄切片技术，设阳性对照和阴性对照，对经人工感染嗜水气单胞菌后发病并具典型症状的
罗非鱼进行病理学观察。结果表明：人工感染嗜水气单胞菌后发病与自然发病的病理变化相似。患病
罗非鱼的肝脏、鳃等组织器官发生了不同程度的病变，其病理特征主要表现为：细胞浊肿、变性、坏死，
某些细胞的细胞核固缩、碎裂或崩解；超薄切片电镜下可见细胞内线粒体内嵴受损严重。病变最严重
的区域，组织细胞坏死崩解成一片无结构的物质。推测肝脏、肾和鳃是病原体感染罗非鱼的主要靶器
官，具有重要生理功能的肝脏、鳃发生了严重病变。线粒体是罗非鱼的重要产能结构，其功能也遭到破
坏，这些可能是导致罗非鱼发病死亡的病理学基础。但从病理切片中可以看到，饲料中补充止痢草提
取物后，其病症有明显缓解或减轻的趋势。
关键词：罗非鱼；嗜水气单胞菌；组织病理学
中图分类号：S963.73+6 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2011）18-0020-05
止痢草提取物对患病罗非鱼组织器官的影响
叶金明 金立志 郑宗林
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水 产 饲 料 《饲料工业》·2011年第 32卷第 18期
20
广泛的体外抗微生物活性。揭示了植物提取物主要成
分的体外抗微生物活性是源于植物精油的活性作用。
金立志（2007）综述了一些植物提取物的研究及应用
情况。在抗菌方面，止痢草提取物抗菌能力较强，特别
是止痢草提取物性质稳定易于使用。但对于止痢草
提取物在水产动物中抗菌性能的研究还未见报道。
嗜水气单胞菌是淡水鱼流行性败血症的主要致病菌。
本试验对罗非鱼进行嗜水气单胞菌攻毒，同时饲料
中拌喂止痢草提取物，通过组织切片和电镜观察等
手段观察感染嗜水气单胞菌的罗非鱼组织器官的
病变情况，及止痢草提取物对组织器官的保护、抗菌
性能。
1 材料与方法
1.1 试验条件
1.1.1 试验设计
试验用吉富品系尼罗罗非鱼（Oreochromis niloti－
cus）购自重庆市铜梁县温泉渔场。试验开始前停饲
24 h，选择体重接近（22.0±1.0）g的幼鱼 90 尾，随机
分配于 9个养殖缸，具体分组见表 1。
表 1 试验设计
组别
重复组
尾/重复
止痢草提取物添加量（mg/kg饲料）
阴性对照
3
10
0
阳性对照
3
10
0
OS 组
3
10
150
注：试验所使用的止痢草提取物由英国美瑞康（广州）生物科技有
限公司提供，含5%止痢草精油。
1.1.2 试验饲料
采用罗非鱼常规商业配方，具体日粮配方及营养
水平见表 2。
1.1.3 注射感染
各组投喂相应的饲料 3周后，以腹腔注射的方式
使罗非鱼感染嗜水气单胞菌。试验菌株取自上海海洋
大学国家水生动植物病原库，菌株号：ST 78-3-3。将
嗜水气单胞菌涂布于营养琼脂上，28 ℃下培养过夜，
以制备菌悬液。梯度稀释制备菌悬液：用 0.9％的无菌
生理盐水将嗜水气单胞菌从营养琼脂平板上洗下菌
落，采用活菌直接镜检计数法计菌数，推算出菌悬液
的活菌数，并将上述悬液稀释得到 107 cfu/ml。阴性对
照组每尾鱼注射 0.1 ml无菌生理盐水，阳性对照组、
OS组每尾鱼注射 0.1 ml的菌悬液（107 cfu/ml）。注射
后 168 h取阳性对照组和 OS组病症明显、但未死亡
的罗非鱼，及从阴性对照组随机取鱼，分离各组织器
官固定，每组取3尾。
表 2 罗非鱼基础饲料配方及营养水平(%)
原料
鱼粉
大豆粕
菜籽粕
棉籽粕
米糠
小麦麸
次粉
面粉
大豆油
磷酸二氢钙
维生素预混料
微量元素预混料
氯化胆碱
VC 酯
膨润土
营养水平
粗蛋白
粗脂肪
无氮浸出物
粗纤维
粗灰分
钙
总磷
含量
8.00
22.00
17.00
17.50
10.00
14.00
3.00
3.70
1.00
1.50
0.10
0.50
0.15
0.05
1.50
33.00
4.37
34.16
6.87
7.80
0.80
1.36
注：1.预混料中维生素为每千克配合饲料提供 ：VA 6 000 IU、VD
2 000 IU、VE 50.0 μg、VK 5.0 μg、VB1 15.0 μg、VB2 15.0 μg、
VB3 25.0 μg、VB5 30.0 μg、VB6 10.0 μg、VB7 0.2 μg、VB11 3.0 μg、
VB12 0.03 μg；
2.预混料中矿物质为每千克配合饲料提供(μg)：NaCl 1.0、MgSO4·
7H2O 15、NaH2PO4·2H2O 25、KH2PO4 32、FeSO4 2.5、乳酸钙 3.5、
ZnSO4·7H2O 0.353、MnSO4·4H2O 0.162、CuSO4·5H2O 0.031、CoCl2·
6H2O 0.01、KIO3 0.003；
3.VC 磷酸酯中 VC 含量为 25%。
1.2 主要试剂与器材
1.2.1 Bouins固定液
饱和苦味酸水溶液 75 ml、福尔马林 25 ml和冰
醋酸 5 ml混合均匀保存于阴暗处。
1.2.2 Ehrlich氏苏木精染色液
混合 50 ml纯酒精与 5 ml冰醋酸，然后将 1 g苏
木精溶解其中，并加入 50 ml甘油。另将 5 g钾明矾
（硫酸铝钾）加入 50 ml蒸馏水内加热使其溶解，再慢
慢倾入上述已配制的混合液，随之搅拌。过滤后静置
2~4 周后尚能成熟，也可加入双氧水以缩短成熟的
时间。
1.2.3 伊红染色液
0.5 g固体伊红溶解在 100 ml 95%的酒精中，加
热后磁力搅拌器搅拌使其充分溶解。
1.2.4 0.1 M磷酸盐缓冲溶液(PBS) pH值 7.3（sorensen
配方）
A液为 0.2 M 磷酸二氢钠水溶液(27.6 g NaH2PO4·
H2O或 31.21 g NaH2PO4·2H2O溶于 1 000 ml双蒸水)；B
液为 0.2 M 磷酸氢二钠水溶液（35.61 g Na2HPO4·
2H2O 或 71.64 g Na2HPO4·12H2O 溶于 1 000 ml 双蒸
水)。A液与 B液按 23： 67体积比例混合。
1.2.5 二甲砷酸盐缓冲液
水 产 饲 料叶金明等：止痢草提取物对患病罗非鱼组织器官的影响
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A液（0.4 M二甲砷酸钠贮存液）：Na(CH3)2·AsO2·
3H2O 8.65 g溶于 1 000 ml双蒸水。
B液（0.2 M 盐酸溶液）：HCl(36%~38%)1 ml，加双
蒸水到 60 ml。
取 25 ml A液、3~4 ml B液混合，测 pH值，可用
B液调 pH值到 7.3左右，再加双蒸水到 50 ml，配成
的二甲砷酸钠浓度为 0.2 M。最后配成的固定液中加
入 1~3 mM的钙离子，可使结构保存更好。
1.2.6 Palade醋酸—巴比妥缓冲液（Palade配方）
A液（巴比妥钠 2.89 g、无水醋酸钠 1.15 g溶解于
100 ml 双蒸水中）；B液[HCl(36%~38%)8.6 ml，加双蒸
水到 1 000 ml]。临用时按下列比例混合：A液 5 ml、B
液 5 ml(调整 B液的量可得到所需的 pH值)、双蒸水
15 ml。
1.2.7 2%锇酸（四氧化锇）固定液贮存液的配制
先将 4只装有四氧化锇的安瓿（共 2 g）用肥皂水
洗净，再用洗洁液浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用玻
璃划割器在上面划痕，再用蒸馏水冲洗几次，放入洁
净棕色广口玻璃瓶内，加上 100 ml双蒸水，用洁净玻
璃棒捣破安瓿，或用力摇破。然后用蜡严密封口，贴上
标签备用。洗净后的安瓿严禁与手或纱布、滤纸等接
触。将配好的 2%四氧化锇置于干燥器中，于 4 ℃保
存。
1.2.8 磷酸缓冲的四氧化锇固定液的配制
等量的 0.1 M磷酸缓冲液（pH值 7.3）与 2%四氧
化锇贮存液混合，临用时现配。
1.2.9 二甲砷酸盐缓冲的四氧化锇固定液的配制
等量的 0.2 M二甲砷酸盐缓冲液(pH值 7.3）与 2%
四氧化锇贮存液混合，临用时现配。
1.2.10 Palade醋酸—巴比妥钠缓冲的四氧化锇固定
液的配制
取 Palade醋酸—巴比妥钠缓冲 5.0 ml与 12.5 ml
的 2%四氧化锇贮存液混合，再分别加入 0.1 M 的盐
酸 5.0 ml、双蒸水 2.5 ml即可。
1.3 石蜡切片制作
1.3.1 组织固定
分别取人工感染试验中发病罗非鱼和对照组存
活的健康罗非鱼的鳃、肝脏、心脏、腹神经节等组织器
官，按照龚志锦的方法 Bouins 固定液固定 24 h 以
上，保存。
1.3.2 水洗及脱水
倒掉固定液后用微流水洗涤过夜。依次经 30%、
50%、60%、70%、80%、90%、95%及 100%酒精两次脱
水处理，每级脱水时间 30 min。
然后经过透明、透蜡和包埋处理，最后进行切片
与烘片。常温下切片，切片厚度 10 μm。每个组织块切
20片，蛋白胶固定。展片台上展片后放入 37 ℃烘箱中
烘 72 h。
1.4 染色及封片
在 58 ℃烘箱中经二甲苯 20 min 两次脱蜡后放
入 1： 1 二甲苯与纯酒精 5 ~10 min 后依次放入
100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%的酒精中进行
处理，每级 5~10 min，然后放入纯水中处理 5~10 min。
经苏木精染色，切片脱水及伊红复染，最后进行
切片透明及中性树胶封片，并采用 OLYMPUS显微镜
观察和拍片。
1.5 超薄切片制作
取罗非鱼肝脏进行组织超薄切片的制作。超薄切
片按照常规方法进行制作，即组织块经戊二醛—锇酸
双固定，梯度酒精脱水，环氧树脂 Epon 812包埋，Le－
ica 超薄机超薄切片，醋酸双氧铀—柠檬酸铅双染色
法染色后，使用日立 H-6000型透射电镜观察并且拍
照。
2 结果
2.1 感染症状
罗非鱼腹腔注射嗜水气单胞菌后，主要症状为摄
食量下降，活动能力减弱。48 h后腹部出现增大，腹腔
注射部位红肿，口部、各鳍基部、鳃盖及鳃裂后部均有
出血症状，眼球外突。部分罗非鱼鳃盖凹陷，鳃丝发
白，肛门红肿呈濒死状态。解剖后观察可见肝胰脏呈
土黄色，心、脾颜色暗红，肠道少或无食物。各种症状
表明，嗜水气单胞菌对罗非鱼肝、肾、脾、心、肠、鳃都
造成不同程度的破坏，特别是对肝、肾和鳃的破坏程
度较大。
2.2 肝细胞超显微病理（见图 1）
电镜照片主要观察了肝细胞的重要器官线粒体
的形态变化。与阴性对照组相比，超薄切片 OS组的肝
细胞内可见部分线粒体的内嵴折叠、变形甚至断裂，
失去正常的船梁结构，同时可见髓样小体肿胀，部分
肿胀破裂（见图 1-A）。而阳性对照则病变更加严重，
某些组织坏死成一片无结构的区域（见图 1-C），而图
1-B为正常的线粒体，图 1-D为嗜水气单胞菌的电镜
照片。
2.3 肝脏及鳃显微病理（见图 2）
2.3.1 肝脏
正常罗非鱼肝脏由无数肝小管组成。大体分为两
水 产 饲 料 叶金明等：止痢草提取物对患病罗非鱼组织器官的影响
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注：A.正常罗非鱼肝脏（阴性对照组），HE，10×6.7；B.罗非鱼肝脏，示肝细胞部分细胞核坏死消失；肝小管
上皮细胞间界线消失，细胞部分坏死（OS 组），HE，10×6.7；C.患病罗非鱼肝脏，示肝小管上皮增生，核
大小不一，有的细胞水肿变性，细胞核固缩、碎裂或崩解（阳性对照组），HE，10×6.7；D.正常罗非鱼鳃
（阴性对照组），HE，4×6.7；E.罗非鱼鳃，示鳃叶腔扩张（OS 组），HE，10×6.7；F. 患病罗非鱼鳃，示鳃肌开
始变性，而鳃叶上皮细胞及柱细胞广泛变性（阳性对照组），HE，4×6.7。
图 2 肝脏及鳃显微病理
A B C
D E F
A B C D
图 1 肝细胞超显微病理
注：A.细胞中可见线粒体内嵴受损、扭曲或部分坏死溶解（OS 组），×8 400；B.正常线粒体（阴性对照组），×8 400；
C.病变严重，细胞组织坏死崩解成一片无结构的物质（阳性对照组），×8 400；D.嗜水气单胞菌，×8 400
瓣，呈三叶状，每一叶由许多小的分支的盲管组成，这
些盲管通到每一叶的收集管，这三叶的收集管通过肝
脏的主导管与中肠联系。每一肝小管都是由位于基膜
上的单层柱状上皮细胞构成，细胞间界线清晰（见图
2-A）。OS组的罗非鱼，其肝细胞部分水肿、变性，细胞
排列可见轻度紊乱，部分细胞核坏死消失；随后肝小
管上皮细胞间界线消失，细胞坏死，见坏死物脱落入
肝小管管腔(见图 2-B)；阳性对照组的罗非鱼肝细胞
病变更加严重，可见肝小管上皮增生，核大小不一，有
的细胞水肿变性，细胞核固缩、碎裂或崩解（见图 2-C）。
2.3.2 鳃
正常罗非鱼每条鳃由一扁平的鳃轴及其向两边
发出的许多鳃叶组成。鳃叶最外面是角质层，向内是
上皮细胞层，中间是鳃腔。上皮细胞向鳃腔突起形成隔，
将鳃腔分成许多小通道，其内常有大而胞质着色浅的
细胞，通道内有游离的血细胞（见图 2-D）。OS组的罗
非鱼的鳃也发生病变，并且在不同患病个体中，随病
情的严重程度不同其组织病理学变化也有所不同，鳃
水 产 饲 料叶金明等：止痢草提取物对患病罗非鱼组织器官的影响
23
组织中出现细胞浊肿，鳃肌开始变性（见图 2-E）。而
阳性对照组的罗非鱼鳃叶上皮细胞及柱细胞广泛变
性，大部分区域出现细胞坏死，鳃叶腔扩张（见图 2-F）。
3 小结
过去 10年，水产养殖在全球范围内以高于 30%
的速度迅猛发展，进而成为农业领域增长最快的部分
之一，但鱼虾疾病的频发态势严重制约了水产养殖的
快速发展。鉴此，疫苗开发、水质调控以及饲料添加剂
和药物（如抗生素）等都以极快的速度应用于水产养
殖领域，成为预防和控制水产动物疾病发生的有效手
段。抗生素类产品已经在人类和畜禽动物的疾病预防
与控制中得到广泛的使用，而抗生素类产品在水产养
殖过程中的应用却出现了一些问题，这主要是与水产
动物的给药方式有关。水产养殖往往采用高密度、集
约化养殖模式，考虑到养殖对象的特殊性，无论预防
还是治疗水产动物群体，实行个体给药都是不可行
的，群体药饲和药浴成为仅有的两种备选给药方案，
但这两种给药方法都可能造成抗生素给药浓度的不
稳定性。这种不稳定的给药浓度变化可使鱼类长时间
接触到低于治疗剂量的抗生素药物浓度，长时间持续
这种状态可能导致水体和水产动物体内的病原菌产
生针对某些抗生素耐药菌株。耐药菌株的存在可能对
养殖者和水产养殖动物造成严重的不良后果。
植物提取物饲料添加剂由一系列的植物生物活
性成分及其衍生物构成，长期以来就被当作香料、防
腐剂和药材使用。精油提取物是植物源提取物的核心
成分，是一类芳香、挥发性化合物的混合物，植物原料
常据其芳香特征来加以区分。精油是疏水性的化合
物，包括醇、醛、酯、醚、酮、酚、萜等化学成分。精油分
子结构中的六碳环会在植物的生长及动物摄食的过
程中生成不同的生化组分，从而产生不同的生化功
能。植物提取物类饲料添加剂被认定为“安全、高效、
稳定、可控”的饲料添加剂，逐渐成为绿色环保安全动
物食品生产和饲料工业充满活力的新的经济增长点。
对哺乳动物的研究发现，动物胃肠道对大量的刺
激都反应敏锐，这些应激可能导致肠黏膜细胞的破
坏，其屏障功能受损，从而进一步影响食物的消化吸
收机能。酚的抗菌效果主要是对目标细菌细胞壁结构
的影响，酚类物质作用于细胞壁，改变其对 H+和 K+的
离子通透性。研究发现，精油会抑制革兰氏阴性菌的
代谢产物的活性，因为其分子很小，能够通过外膜蛋
白孔，进入质膜。萜类化合物和苯基丙烯类化合物的
亲脂性使其能穿过细菌的细胞膜达到细胞内部。精油
还可促进消化酶的活性提高，促进脂质代谢和脂肪的
消化吸收。关于植物精油的作用机制目前有几种不同
的理论，比如直接减少肠道菌群、刺激乳酸菌的产生、
增强体液免疫和细胞免疫机能。不论对陆生动物还是
水生动物，保持其消化道健康至关重要。众多研究已
证明硬骨鱼类消化道相关淋巴组织（GALT）的存在。
GALT是由淋巴细胞、浆细胞、粒细胞、巨噬细胞等组
成的复杂系统。可以推测，植物源添加剂和鱼类免疫
功能的正常发挥有较好的协同作用，但这一作用的
确切机制还需要进一步的科学研究。
本试验研究发现，经嗜水气单胞菌感染后，罗非
鱼的鳃和肝脏等实质器官都发生了较严重的病变。但
经过 3周投喂含止痢草提取物，试验组罗非鱼的鳃和
肝脏病变情况有明显缓解。如果持续数周添加，则可
能恢复到正常。
（参考文献 17篇，刊略，需者可函索）
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）
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