全 文 ：邓玉营 ,周士景.花叶熊掌木快速繁殖体系研究 [ J] .江苏农业科学, 2011, 39(2):105-107.
花叶熊掌木快速繁殖体系研究
邓玉营 1 , 周士景 2
(1.常州工程职业技术学院 ,江苏常州 213164;2.苏州三润景观工程有限公司 ,江苏苏州 215123)
　　摘要:取花叶熊掌木顶芽或腋芽为外植体材料 , 经过 75%乙醇 30 s, 0.1% HgCl2 8 min,无菌水冲洗 8次消毒;初
代培养基:MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.1 mg/L;优化的增殖培养基:MS+6-BA1.0 mg/L+KT0.5 mg/L+IAA
0.3mg/L, 20 d;生根培养基:1/2MS+NAA1.0 mg/L, pH值 6.0 ～ 6.5条件下培养 , 增值系数最高 ,达到 4.1, 生根率达
到 100%。将花叶熊掌木试管苗移栽于泥炭与珍珠岩体积比为 3 ∶1的基质中 , 炼苗 20 d, 成活率达 80%以上。
　　关键词:花叶熊掌木;无菌体系;方差分析;快速繁殖
　　中图分类号:S725.704　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0105-03
(上接第 104页)
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　　花叶熊掌木为五加科熊掌木属常绿性藤蔓植物 ,由八角
金盘(Fatsiajapomica)与常春藤(Hederahelix)杂交而成 ,有一
定的耐寒力 、极强的耐阴能力 ,用传统繁殖方式如扦插法只能
在春秋季进行繁殖 ,受季节影响较大 。组织培养方法作为一
种先进的快繁技术 ,近几十年在名贵植物中得到了广泛应用 ,
有利于解决花叶熊掌木的繁殖问题 [ 1 ] ,同时花叶熊掌木性喜
温暖 ,通过组织培养的方式会大大降低繁育成本 。本研究通
过建立花叶熊掌木组织培养体系 ,进行花叶熊掌木苗的规模
化化生产。
1　材料与方法
1.1　材料
挑选健壮 、无病害的花叶熊掌木优良单株 ,取顶芽或腋芽
为外植体。
收稿日期:2010-06-09
基金项目:2008年江苏省大学生实践创新训练计划项目(编号:
CX2008-09)。
作者简介:邓玉营(1978—),男 ,河南洛阳人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事生
物工程方面的研究。 E-mail:yydeng@email.czie.net。
1.2　试验方法
1.2.1　无菌苗的建立　将剥离的芽经流水冲洗 ,稀释 10倍
的次氯酸钠溶液浸泡 ,在超净工作台上用 75%乙醇表面消毒
30s, 0.1%HgCl2浸泡消毒 8min,无菌水冲洗 8次备用 。
1.2.2　初代培养　将芽放在滤纸上切去创伤面 ,接种于附加
0.5mg/L6-BA的 MS启动培养基上 ,每瓶接 1个芽 ,建立无
菌培养材料 。 13 d后待新芽长至 1.0 cm左右 ,切取并分别接
种于 MS、WPM和 B5基本培养基中(表 1),建立无菌培养材
料 。培养基为:基本培养基 +6 -BA 1.5 mg/L+NAA
0.1mg/L+蔗糖 30mg/L,琼脂 8g/L,调节 pH值为 6.0 ～ 6.5。
每处理接种 20个芽 ,重复 2次 。培养室温度(25±1)℃,光
照强度 2 000 ～ 2 500lx,光照时间 14 h/d, 25 d时观察不同培
养基上的萌芽率 、芽数和芽伸长情况 。
1.2.3　增殖培养　根据资料和初步试验 , 25 d后 ,切去无菌
苗基部褐化面 ,接种于增殖培养基中 ,增殖培养基以 MS为基
本培养基 ,附加 6-BA、KT和 IAA,采用 3因素 3水平正交设
计 [ 2] ,共设置 9个处理 ,每个处理重复 2次 ,每重复 10瓶 ,每
瓶接种 1个芽 ,进行增殖培养基激素的优化筛选 (表 2)。
20d左右统计增殖系数 。
1.2.4　试管苗的生根试验　当芽长 2 ～ 3 cm时 ,切取并进行
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.02.144
表 1　筛选初代诱导培养基单因子试验的因素
处理 培养基 激素种类与浓度(mg/L)
A1 WPM 6-BA1.5+NAA0.1
A2 MS 6-BA1.5+NAA0.1
A3 B5 6-BA1.5+NAA0.1
表 2　增殖培养基激素水平正交试验
水平
激素种类与用量(mg/L)
A:6-BA B:KT C:IAA
1 1 0 0.1
2 2 0.5 0.2
3 3 1.0 0.3
生根培养 ,保留 3 ～ 4片叶 。以 1 /2MS为基本培养基 ,采用
NAA和 6-BA的 5水平进行单因子随机设计(表 3),寻求较
佳的生根培养基 。接种 10 d后 ,所有组合均可诱导无菌苗生
根 , 30 d时观测结果 。最后移栽于泥炭与珍珠岩体积比为 3
∶1的基质中炼苗 ,统计成活率 。
表 3　筛选花叶熊掌木生根最佳激素及浓度
处理 NAA(mg/L) 6-BA(mg/L)
C1 0 0.1
C2 0.1 0
C3 0.2 0.1
C4 0.3 0.2
C5 0.2 0.3
C6 0.5 0.5
2　结果与分析
2.1　基本培养基的筛选
外植体接种于启动培养基中 , 13 d后外植体开始萌动 ,
侧芽开始生长 ,切取并分别接种到以 MS、WPM和 B5为基本
培养基的 3种诱导培养基上 , 10d左右腋芽开始伸长 ,茎段基
部膨大 ,逐渐形成愈伤组织 , 25 d后观察不同培养基上的生
长情况(图 1)。不同培养基间在芽数和芽伸长方面存在显著
差异 , MS培养基上的萌发率 、芽数和芽长明显大于 WPM和
B5培养基上的(表 4)。由此可见 ,花叶熊掌木初代培养的适
宜基本培养基为 MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1 mg/L。
表 4　不同基本培养基对花叶熊掌木分化的影响
处理 接种数(个)
萌芽率
(%)
芽数
(个)
芽长
(cm)
A1 40 36 1.3 0.5
A2 40 80 2.0 2.0
A3 40 50 1.34 1.7
2.2　不同植物激素及浓度对芽分化的影响
25d后 ,切去基部褐化面 ,接种于增殖培养基中 ,继续培
养 10 ～ 15 d,基部长成致密的愈伤组织 ,有愈伤组织分化出不
定芽(图 2),统计的增殖系数如表 5所示 。
表 5　有重复观测值正交试验结果计算
试验号
因素
A B C 空
增殖系数
重组Ⅰ 重复Ⅱ 平均
1 1 1 1 1 3.5 3.2 3.35
2 1 2 2 2 4.1 4.0 4.05
3 1 3 3 3 4.0 4.2 4.10
4 2 1 2 3 2.5 2.4 2.45
5 2 2 3 1 3.4 3.5 3.45
6 2 3 1 2 2.0 2.1 2.05
7 3 1 3 2 3.2 3.1 3.15
8 3 2 1 3 3.0 2.9 2.95
9 3 3 2 1 1.8 1.6 1.70
k1 3.83 2.98 2.78
k2 2.65 3.48 2.73
k3 2.60 2.61 3.56
R 1.23 0.87 0.83
　　由表 5可以看出 , 6 -BA促进萌芽率效果最佳 ,其次为
KT,最优水平组合为 A1B2C3。
F检验结果表明:MSe1 /MSe2 >1 , F检验显著 ,说明激素之
间存在交互作用 , 二者不能合并 。以 MSe2进行 F检验 ,
6-BA、KT、IAA三个因素对增殖系数的影响都极显著
(表 6)。通过正交分析表明:最优的增殖培养基为 MS+
6-BA1.0mg/L+KT0.5 mg/L+IAA0.3mg/L。
试验结果也表明 ,细胞分裂素浓度过大 ,有的丛生芽几乎
成畸形 ,出现轻微玻璃化现象 ,不利于进一步继代培养和诱导
生根培养。
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表 6　 2个重复观测正交试验结果方差分析
变异来源 SS df MS F F0.05 F0.01
A 5.847 7 2 2.923 9 232.055 6＊＊ 4.46 8.65
B 2.271 2 1.135 5 90.119 1＊＊ 4.46 8.65
C 2.621 2 1.310 5 104.007 9＊＊ 4.46 8.65
单位组 0.013 9 1 0.013 9 1.1032 5.32 11.26
误差e1 0.361 4 2 0.1807
试验误差e2 0.101 1 8 0.012 6
2.3　试管苗的生根
当芽长 2 ～ 3 cm时 ,切取并进行生根培养 。接种 10 d
后 ,所有组合均可诱导花叶熊掌木无菌苗生根 , 30 d时观测
结果表明 , 1/2MS+NAA1.0 mg/L诱导较快 ,且生长迅速 ,根
长而粗壮(图 3)。花叶熊掌木无菌苗不经过愈伤组织直接从
皮层生根 ,这种根与维管束相连 ,容易吸收营养 ,移栽成活率
高 。而加入过多 NAA会导致根短而细弱 ,侧根少 , 添加
6-BA过多则生根较晚 。
2.4　试管苗移栽
将花叶熊掌木试管苗移栽于泥炭与珍珠岩体积比为
3∶1的基质中 ,炼苗 20 d,成活率达 80%以上 。
3　结论与讨论
组织培养启动阶段 ,无菌体系的建立是最重要的 ,常用的
方法有减压灭菌 、多次消毒(灭菌)、使用混合消毒液等 。周
俊辉等对玛丽安万年青利用减压抽走植物组织中的气体使消
毒剂更易进入植物内部 ,使污染率从对照的 93.3%降低到
40.0%[ 3 ] 。郭海滨等将卷丹百合鳞片先以 70%乙醇浸泡10s
再用 0.1% HgCl2消毒 12min,污染率达到 65%,如果先用乙
醇浸泡 30s,再用 HgCl2浸泡 15 min,污染率可降到 15%[ 4 ] 。
王丽娟等对卷丹百合珠芽外植体先用 75%乙醇浸泡 30 s,再
用 0.1% HgCl2分别消毒 3、 5、 8、10 min,发现 HgCl2 消毒
5min效果最佳 [ 5 ] 。许婉芳等将杀菌剂加入金线莲培养基
中 ,发现 50%多菌灵的效果优于 70%甲基托布津和 25%甲
霜灵 ,其抑菌率达 100%且能促进金线莲的生长 [ 6] 。总之 ,使
用混合消毒液消毒一定的时间 ,是建立无菌体系的常用方法 。
本研究用次氯酸钠溶液浸泡 , 75%乙醇表面消毒 30 s,再用
0.1% HgCl2浸泡消毒 8 min,使污染率控制在 5%以下 ,有效
提高了组培效益 。
本研究采用 MS、WPM和 B5等 3种基本培养基 ,其中 MS
为应用最广泛 ,微量元素齐全 , WPM中大量元素含量较 MS
少 , B5为硝酸盐含量较高的中盐培养基 。结果表明:花叶熊
掌木起始和增殖培养基选用 MS好于 WPM和 B5。生根培养
1 /2MS为最优 ,这和五加科植物相近研究结果 [ 7 -8 ]一致 。
花叶熊掌木增殖培养时 ,基部有褐化面 ,褐化的形成是因
为细胞受胁迫条件或其他不利条件影响而死亡;大量组培研
究发现 ,激素浓度会改变材料的褐变程度 , 6-BA的使用浓度
低 ,褐化轻 ,随 6-BA浓度的提高 ,其褐化率升高 [ 9-11 ] 。本研
究也发现 , 6-BA不超过 1.5 mg/L, KT0.5mg/L左右可以减
轻或抑制褐变 。
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