全 文 ：收稿日期:2007-11-13
作者简介:王忠敏(1986-),男 ,江西广丰人 ,主要从事植物组织培养方面的研究。
迎春花无菌体系的建立以及
茎段和叶片愈伤组织的诱导
王忠敏2 ,付淑琴2 ,张莉华2 ,黄永福2 ,洪森荣1
(1.上饶师范学院 ,江西 上饶 334001;2.上饶师范学院生命科学系 05(1)班 , 江西 上饶 334001)
　　摘　要:本文对迎春花无菌体系的建立和茎段 、叶片愈伤组织的诱导进行了研究。结果表明:(1)在建立迎春
花的无菌体系时 , 应该选择晴天去采集外植体为好;(2)带芽茎段和叶片的污染率最大 , 而不带芽茎段的污染率最
小;(3)在超净工作台外消毒应先用饱和洗衣粉溶液浸泡10 min ,然后用自来水冲洗2-3 次 ,最后再用蒸馏水冲洗2
-3 次;在进行超净工作台内消毒时 ,叶片应该先用 84 消毒液(1%)浸泡 5min , 无菌水冲洗 3 次 , 75%酒精浸泡 20s ,
无菌水冲洗 3次 , 0.1%升汞浸泡 8 min , 无菌水冲洗 3次 , 而茎段应该先用84 消毒液(1%)浸泡 10 min , 无菌水冲洗3
次 , 75%酒精浸泡 30s ,无菌水冲洗 3次 , 0.1%升汞浸泡 10min , 无菌水冲洗 3 次;(4)在 NAA为 0.2 mg/ L时 , 高浓度
的 6-BA 有利于不定根的再生 ,而低浓度的 6-BA则更利于愈伤组织的诱导;在NAA 为 0.2 mg/ L时 ,高浓度的 KT
有利于愈伤组织的诱导 ,而低浓度的 KT则有利于不定根的再生;(5)NAA 更利于不定根诱导 , 也可诱导愈伤组织。
而 2 , 4-D只利于愈伤组织的诱导 ,不利于诱导不定根。
关键词:迎春花;无菌体系;茎段;叶片;愈伤组织
中图分类号:Q943.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-2237(2008)03-0061-06
迎春花(Jasminum nudif lorum Lindl)又名金腰带 ,是木犀科茉莉花属植物[ 1] 。迎春花的花 、叶为民间常
用草药 ,含丁香甙 、迎春花苷和迎春花苦味质 ,有清热解毒之功效 ,主治发热头痛 、小便热痛等病症[ 2] 。目前
对迎春花的研究主要集中于迎春花黄色素的提取和迎春花提取物的药理学作用[ 3] [ 4]等方面的研究 ,而关于
迎春花的组织培养方面的研究尚未见报道。本研究试图通过组织培养手段 ,建立迎春花的无菌再生体系 ,进
一步对叶片和茎段愈伤组织的诱导进行研究 ,以期为迎春花的定向培育及遗传转化和基因克隆等方面的研
究提供基础手段和理论依据。
1　材料与方法
1.1　培养基配制与灭菌
本试验所用培养基全部采用MS培养基 。
1.2　培养基的配制
第 28卷第 3期
2008年 6月 　　　　　　　　　　　　　 上 饶师 范学 院 学报JOURNAL OF SHANGRAO NORMAL COLLEGE　 　　　　　　　　　　　　　Vol.28, No.3Jun.2008
每组实验的培养基均在MS基本培养基的基础上再按表 1 、表 2 、表 3加入其他物质。
表 1　实验一培养基的配制———迎春花无菌体系的建立
培养基成分 6-BA(mg/ L) NAA(mg/ L) 冷凝脂(g/瓶) 蔗糖(g/ L)
用量 3.0 0.2 0.2±0.003 30.0091
注:培养基分装到 25 瓶三角瓶中 ,冷凝脂加到各三角瓶中。
表 2　实验二培养基的配制———迎春花带芽茎段的继代
培养基序号 6-BA(mg/ L) KT(mg/ L) NAA(mg/ L) 冷凝脂(g/瓶) 蔗糖(g/L)
CK - - - 0.3±0.004 30.3283
1 3.0 - 0.2 0.3±0.004 30.3283
2 1.0 - 0.2 0.3±0.004 30.3283
3 - 3.0 0.2 0.3±0.004 30.3283
4 - 1.0 0.2 0.3±0.004 30.3283
表 3　实验三培养基的配制———迎春花茎段和叶片愈伤组织诱导
培养基序号 6-BA(mg/L) KT(mg/ L) NAA(mg/ L) 2 , 4-D(mg/L) 冷凝脂(g/ L) 蔗糖(g/L)
1 - - - - 5.000±0.002 30.0088
2 0.5 - 0.5 - 5.000±0.002 30.0088
3 1.0 - 0.5 - 5.000±0.002 30.0088
4 2.0 - 0.5 - 5.000±0.002 30.0088
5 1.0 - - 0.5 5.000±0.002 30.0088
6 2.0 - - 0.5 5.000±0.002 30.0088
7 1.0 0.5 - 5.000±0.002 30.0088
8 2.0 0.5 - 5.000±0.002 30.0088
9 1.0 - 0.5 5.000±0.002 30.0088
10 2.0 - 0.5 5.000±0.002 30.0088
11 2.0 0.05 - 5.000±0.004 30.0002
12 2.0 - 0.05 - 5.000±0.004 30.0002
1.3　调培养基 pH值和培养基分装
利用 1mol/L 的HCl和 1mol/L 的NaOH ,将培养基 pH 调至 5.8-6.0 。
1.4　培养基和接种工具高压蒸汽灭菌
1.5　外植体采集与消毒
1.5.1　外植体采集
本次实验的外植体采集设置为 4次 ,采集情况见表 4。
表 4　外植体的采集情况
采集序号 采集日期 采集时间 天气 地点
1 2007-5-26 09:00(a.m) 小雨 上饶师范学院化学楼湖边
2 2007-8-27 08:10-08:31(a.m) 大雨 上饶师范学院化学楼湖边
3 2007-9-8 09:00-09:30(a.m) 阴天 上饶师范学院化学楼湖边
4 2007-9-10 09:30(a.m) 天晴 上饶师范学院图书馆湖边
62 上 饶 师 范 学 院 学 报　 　 　　　　　　　　2008(第 28卷)
1.5.2　外植体消毒
1.5.2.1　超净工作台外的消毒
本次实验采集的外植体采用 2种超净工作台外的消毒方式 ,消毒程序情况见表 5。
表 5　超净工作台外的外植体消毒方式
外植体 消毒方式 消毒程序
茎段
① 饱和洗衣粉溶液浸泡 7min , 自来水冲洗 2-3次 , 蒸馏水冲洗 2-3 次
② 饱和洗衣粉溶液浸泡 10min , 自来水冲洗 2-3 次 ,蒸馏水冲洗 2-3 次
叶片 ① 饱和洗衣粉溶液浸泡 7 min , 自来水冲洗 2-3次 , 蒸馏水冲洗 2-3 次② 饱和洗衣粉溶液浸泡 10 min , 自来水冲洗 2-3 次 ,蒸馏水冲洗 2-3 次
1.5.2.2超净工作台内的消毒
本次实验采集的外植体采用 5种超净工作台内的消毒方式 ,消毒程序见表 6。
表 6　超净工作台内的外植体消毒方式
外植体 消毒方式 消毒程序
茎段
①
②
③
75%酒精浸泡 15s , 无菌水冲洗 3次 , 0.1%升汞浸泡 5min , 无菌水冲洗 3次
75%酒精浸泡 15s , 无菌水冲洗 3次 , 0.1%升汞浸泡 10min , 无菌水冲洗 3次
84消毒液(1%)浸泡 10 min , 无菌水冲洗 3 次 , 75%酒精浸泡 30s ,无菌水冲洗 3 次 , 0.1%升
汞浸泡 10min , 无菌水冲洗 3次
叶片
④
⑤
84消毒液(1%)浸泡 2 min , 无菌水冲洗 3 次 , 75%酒精浸泡 15s , 无菌水冲洗 3次 , 0.1%升
汞浸泡 5 min ,无菌水冲洗 3次
84 消毒液(1%)浸泡 5min , 无菌水冲洗 3次 , 75%酒精浸泡 20s , 无菌水冲洗 3次 , 0.1%升汞
浸泡 8 min ,无菌水冲洗3 次
1.6　接种与培养
1.6.1接种
严格按照接种要求进行接种 ,带芽茎段和不带芽茎段切成 1.0-1.5cm ,叶片切成 0.1cm×0.1cm ,整个接
种过程均在酒精灯外焰上这一无菌环境中进行操作。
1.6.2培养条件
本试验迎春花无菌体系建立以及带芽茎段增殖的培养条件均为:温度 25±2℃,湿度 75%-80%,光照
强度 1000-2000 lx ,光照时间 14h/d。而迎春花叶片和茎段愈伤组织诱导则在黑暗处培养 ,其它条件同上。
1.7　实验观察与记录
本研究均为单因子试验。实验重复三次 。试验每 3 d观察一次结果 ,记录实验现象并进行数码拍照 。
2　结果与分析
2.1　迎春花无菌体系的建立
2.1.1　最佳外植体的选择
本试验从野外采集外植体 ,接种到实验一和实验二培养基上 ,其外植体的污染率见表 7。
表 7　不同外植体的污染情况
污染情况 　　　　　　外植体叶片 不带芽茎段 带芽茎段
接种数(个) 145 151 205
污染数(个) 100 71 146
污染率(%) 68.97 47.02 71.22
63　第 3期　　　 王忠敏 ,等 5人:迎春花无菌体系的建立以及茎段和叶片愈伤组织的诱导
　　从表 7中可以看出 ,带芽茎段和叶片的污染率最大 ,而不带芽茎段的污染率最小 ,所以在建立迎春花的
无菌体系时 ,应该选择不带芽茎段作为试材。
2.1.2　外植体采集最佳时间的选择
本试验在不同天气从野外采集外植体 ,接种到培养基上 ,其外植体的污染率见表 8。
表 8　不同天气采集外植体的污染情况
污染情况 　　　　　　　　外植体小雨 大雨 阴天 晴天
接种数(个) 97 83 79 124
污染数(个) 64 71 51 68
污染率(%) 65.98 85.54 64.56 54.84
　　从表 8中可以看出大雨采集外植体的污染率最大 ,而晴天采集外植体的污染率最小 ,所以在建立迎春花
的无菌体系时 ,应该选择在晴天去采集外植体为好 。
2.1.3　最佳消毒方式的选择
2.1.3.1　超净工作台外最佳消毒方式的选择
本试验从野外采集外植体后 ,在超净工作台外用洗衣粉进行预消毒 ,其外植体的污染率见表 9。
表 9 超净工作台外不同消毒方式的污染情况
污染情况
　　　　　　　　消毒方式
①
　　叶片 　　　　茎段
②
　　叶片 　　茎段
接种数(个) 74 72 68 76
污染数(个) 58 47 39 34
污染率(%) 78.38 65.28 57.35 44.74
　　从表 9中可以看出 ,无论是叶片还是茎段 ,其消毒方式②的污染率最小 ,而消毒方式①的污染率最大 ,所
以在建立迎春花的无菌体系时 ,应首先在超净工作台外采用消毒方式②即先用饱和洗衣粉溶液浸泡 10 min ,
然后用自来水冲洗 2-3次 ,最后再用蒸馏水冲洗 2-3次 ,这样可降低外植体的污染率 。
2.1.3.2　超净工作台内最佳消毒方式的选择
外植体经超净工作台外消毒后 ,再转移到超净工作台内用不同组合的消毒剂进行消毒 ,其外植体的污染
率见表10。
表 10　超净工作台内不同消毒方式的污染情况
污染情况
消毒方式
茎　　段
① ② ③
叶　　片
④ ⑤
接种数(个) 34 32 36 34 28
污染数(个) 24 16 9 26 19
污染率(%) 70.59 50.00 25.00 76.47P 67.86
　　从表 10中可以看出 ,对于茎段来说 ,消毒方式③的污染率最小 ,而对于叶片来说 ,消毒方式⑤的污染率
最小 ,所以在建立迎春花的无菌体系时 ,在超净工作台外进行消毒后 ,在进行超净工作台内消毒时 ,叶片应该
先用 84消毒液(1%)浸泡 5min ,无菌水冲洗 3次 ,75%酒精浸泡 20s ,无菌水冲洗 3次 ,0.1%升汞浸泡 8 min ,
无菌水冲洗3次 ,而茎段应该先用 84消毒液(1%)浸泡 10min ,无菌水冲洗3次 ,75%酒精浸泡 30s ,无菌水冲
64 上 饶 师 范 学 院 学 报　 　 　　　　　　　　2008(第 28卷)
洗3次 ,0.1%升汞浸泡 10min ,无菌水冲洗 3次 ,这样均可降低外植体的污染率。
2.2　迎春花叶片和茎段愈伤组织的诱导
在实验三中发现培养基 4(MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)和培养基6(MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/
L 2 ,4-D)极利于诱导愈伤组织。在NAA存在的条件下 ,发现 ,在实验二中3.0mg/L 6-BA既利于不定根诱导 ,
又利于愈伤组织的诱导 。而在实验三中 2.0mg/L 6-BA均只出现愈伤组织的诱导 ,而没有不定根 。推测 3.
0mg/L 6-BA可能为诱导愈伤组织和不定根的中间过渡浓度。大于 3.0mg/L 6-BA更有利于不定根的诱导;而
小于3.0mg/L 6-BA更有利于愈伤组织的诱导(见图 1)。实验二中 3.0mg/L KT 只诱导愈伤组织;而 1.0 mg/L
KT 诱导出了小量的粗的不定根。实验四中2.0mg/L KT 诱导多根细短的不定根 。推测大于 3.0mg/L KT更利于
愈伤组织的诱导;而小于 3.0mg/L KT 更有利于不定根的诱导(见图 2)。实验四中培养基 3和培养基 4观察可
得:NAA更利于不定根诱导 ,也可诱导愈伤组织。2 ,4-D利于愈伤组织的诱导 ,不利于诱导不定根(见图 3)。
对于迎春花的组织培养来说 ,高浓度 6-BA或低浓度KT与NAA的组合最利于诱导不定根 ,且6-BA比KT更
利于愈伤组织的诱导。同浓度的NAA比 2 ,4-D更利于愈伤组织的诱导(见图4)。
3　讨论
本试验表明 ,愈伤组织和不定根的诱导与与植物生长物质种类关系密切 ,且愈伤组织在切口片与液面接
触处形成较多 ,而不定根在叶片和根的上面和切口处均有。这与在蓝猪耳叶上的研究结果相同[ 5] 。本试验
还发现 ,高浓度 6-BA有利于不定根诱导 ,推测 3.0mg/L 6-BA 为不定根和愈伤组织的过渡浓度:高于 3.
0mg/L 6-BA有利于不定根的诱导 ,低于 3.0mg/L 6-BA有利于愈伤组织的诱导。而低于 3.0mg/L KT 有利
于不定根的诱导 ,高于3.0mg/L KT 有利于愈伤组织的诱导 。荣俊冬等[ 6]在对三尖杉带芽诱导的研究中也发
现2.0 mg/L-3.0mg/L 6-BA对带芽茎段生根效果较好 ,而其中以3.0 mg/L的 6-BA为最佳浓度 。在鱼腥
草茎尖愈伤组织诱导中也发现低浓度的 6-BA效果较好[ 7] 。但在彩色辣椒子愈伤组织诱导中却发现 5.0
mg/L 6-BA诱导愈伤组织频率最高[ 8] 。说明不同的外植体对不同浓度的激素要求不同 。在本试验中我们
还发现2 ,4-D比 NAA更利于愈伤组织的诱导 ,而NAA 更利于不定根诱导 ,这与李娟等[ 9] 在马铃薯上的研
究结果一致。
65　第 3期　　　 王忠敏 ,等 5人:迎春花无菌体系的建立以及茎段和叶片愈伤组织的诱导
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The Establishment of Jasminum nudiflorum Lindl
Aseptic System and Induction of Stem and Leaf Callus
WANG Zhong-min2 , FU Shu-qin2 , ZHANG Li-hua2 , HUANG Yong-fu2 , HONG Sen-rong1
(1.Shangrao Normal College , Shangrao Jiangxi 334001 , China;
2.Class 1 , Grade 05 , Science Department Shangrao Normal College , Shangrao Jiangxi 334001 , China)
Abstract:This article studied the establishment of Jasminum nudiflorum Lindl aseptic system and the induction of Stem and leaf
Callus.The result indicated that:(1)when establishing Jasminum nudiflorum Lindl aseptic system , explants gathering should be
chose in the cloudless day;(2)The pollution rate of the stems with a bud and the leaves was largest , but the pollution rate of the
stems without a bud was smallest;(3)the disinfection should first use the saturated laundry powder solution to soak 10 minutes out-
side the ultra-clean table , then flushes 2-3 timewith the running water , finally uses the distilled water to flush again 2-3 time;
When carrying on to disinfect in the ultra-clean table , the leaves should first use 84 disinfection liquid(1%)to soak 5 minutes ,
the aseptic water flushes 3 times , 75% ethyl alcohol soak 20 seconds , the aseptic water flushes 3 times , 0.1%mercuric chloride
soak 8 minutes , the aseptic water flushes 3 times , but for the stems , they should first use 84 disinfection liquid (1%)to soak 10
minutes , the aseptic water flushes 3 times , 75% ethyl alcohol soak 30 seconds , the aseptic water flushes 3 times , 0.1%mercuric
chloride soak 10 minutes , the aseptic water flushes 3 times;(4)when NAA is 0.2mg/ L , high density 6-BA was advantageous to
adventitious root regeneration , but low density 6-BA then favored callus induction;(4)when NAA is 0.2 mg/ L, high density KT
is advantageous to callus induction , but low density KT then was advantageous to adventitious root regeneration;(5)NAA favored
adventitious root induction , also may induced callus.But 2 , 4-D only favored callus induction , which is disadvantageous to the ad-
ventitious root induction.
Key Words:Jasminum nudiflorum Lindl;;aseptic system;stem;leaf;callus
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