全 文 ：止痢草精油对感染嗜水气单胞菌的
罗非鱼非特异性免疫功能的影响
■文/江苏省扬州市水产生产技术指导站 叶金明
西南大学鱼类繁殖与健康养殖中心 王 婷 郑宗林
摘要：嗜水气单胞菌是淡水鱼流
行性败血症的主要致病菌。在采用添
加不同剂量的止痢草精油的饲料投喂
3周后，对罗非鱼腹腔注射嗜水气单
胞菌，在其攻毒后不同时间取血，
通过白细胞数量、NBT阳性细胞数量
以及血清溶菌酶活力的变化趋势来
研究止痢草精油及病原菌感染对鱼类
非特异性免疫功能的相互影响。结果
表明，在罗非鱼感染嗜水气单胞菌后
72h内，白细胞数量、NBT阳性细胞数
量以及血清溶菌酶活力依感染浓度不
同，呈现先增加后降低的趋势，而添
加了止痢草精油的试验组的这3项指
标也是先出现增加的趋势，但降低幅
度和速度减小，同时到后期恢复到正
常水平的速度更快。说明嗜水气单胞
菌与罗非鱼非特异性免疫功能之间呈
现一定的时间效应，而止痢草精油对
罗非鱼的非特异性免疫机能可能有协
同增强功效。
关键词：嗜水气单胞菌；罗非鱼；白
细胞；NBT阳性细胞；血清溶菌酶
在过去半个世纪，抗生素在促进
动物生长和保持健康都起到重要作
用，但由于使用抗生素的效果越来越
差，以及病原菌对抗生素耐药范围扩
大和耐药性增强，开发新型、安全、
高效、促生长饲料添加剂显得更为迫
切。植物提取物类饲料添加剂是研
究较多也比较深入的一种，主要是芳
香、挥发性化合物的混合物，根据植
物材料的芳香特性而命名并由这些植
物提取获得。植物提取物类饲料添加
剂被认定为“安全、高效、稳定、可
控”的饲料添加剂，逐渐成为绿色环
保安全动物食品生产和饲料工业充满
活力的新的经济增长点。水产养殖迫
切需要一种非抗生素的促长剂来提高
水产动物的生长率、饲料转化率，同
时能增强其抗应激能力和降低死亡率
等。止痢草（精油）是迄今为止发现
的抗菌活性最强的一类植物提取物，
其主要包括香芹酚和百里香酚等30多
种活性成分。
鱼类的免疫体系包括特异性免疫
和非特异性免疫，在感染各种病原体
初期，抗体尚未形成，主要靠非特异
性免疫发挥功能。非特异性免疫受很
多环境因子影响，温度、摄食状况、
拥挤等因子国内外已有很多报道[1]，
但未见有考察补充饲料添加剂对感染
病原菌的水产动物非特异性免疫功能
方面的报道。本文采用对试验组罗非
鱼投喂含有不同剂量的止痢草精油的
饲料3周后，嗜水气单胞菌攻毒，在
罗非鱼染菌后不同时间取血，分别测
定白细胞数量、NBT 阳性细胞数量
以及血清溶菌酶活力，通过上述指标
的变化趋势来探讨感染病原菌对鱼类
非特异性免疫功能的影响，以及止痢
草精油能否提高动物的非特异性免
疫。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验鱼及试验设计 试验用
吉富品系尼罗罗非鱼（Oreochroµis
n i l o t i cus）为当年人工繁殖的同
一批苗种，购自重庆市铜梁县温泉
渔场，试验在西南大学水产系室内
循环养殖系统中进行。试验前暂
养1周，每天早、中、晚饲喂对照
组饲料3次至饱食。试验采用的养
殖设施为椭圆形玻璃缸（总体积
0.4m3，水体体积0.25m3）。循环流
水系统，曝气自来水，每池进水速
率大约为0.8 L/min。养殖试验期
间均连续充氧（除投饵期间外）。
试验开始前停饲24 h。选择
体重相近（22.0±1.0）g、体格健
壮的幼鱼480尾，随机分配于16个
养殖缸，4个处理组，每个处理组
4个重复，每重复30尾，具体分组
见表1。本试验所使用的止痢草精
油由英国美瑞康（广州）生物科
技有限公司提供，含5%止痢草精
油。每天早、中、晚各投喂1次，
投喂结束后 30 min，吸出池内残
饵及粪便。投喂试验饲料时间为3
周。试验期间水温25.0±1.0℃，
pH值7.5±0.5，溶氧≥5mg/L，
Aquaculture
70·《当代水产》2011年5月
氨 氮 < 0 . 2 m g / L ， 余 氯 < 0 . 1 m g / L 。
1.1.2
试验饲料 配制饲料前，饲料原料均
经粉碎机粉碎并全部过60目筛，制
成直径为1.5mm左右的颗粒饲料，在
35℃鼓风干燥箱内干燥24 h，置冰箱
0℃保存。具体配方组成和营养成分
分析见表2。
1.1.3 嗜水气单胞菌（Aeromonas
hydrophila） 试验菌株取自上海
海洋大学农业部渔业动植物病原库，
菌株号：ST 78-3-3。
1.1.4 溶壁微球菌（Microcrococcu-s
lysodeikticus）及培养基 溶壁微
球菌为本试验室菌种。营养琼脂培
养 基 的 配 制 （ 1 . 5 ％ ） ： 牛 肉 浸 膏
1.5g，蛋白胨2.5g，NaCI 4.0g，琼
脂7.5g，蒸馏水500mL pH=7.4。
1.1.5 氯化硝基四氮唑兰（NBT） 和
PBS（pH 6.4）配制 NBT：无菌生理
盐水配成2mg／L的水溶液。PBS（pH
6.4）：0.067mol／L，KH2PO4 73mL，
0.067mol／L，K2HPO4 27mL，NaCl
0.5g。
1.2 方法
1.2.1 嗜水气单胞菌悬液的制备
将嗜水气单胞菌涂布于营养琼脂上，
28℃ 下培养过夜，以制备菌悬液。
梯度稀释制备菌悬液：用0.9％的无
菌生理盐水将嗜水气单胞菌从营养琼
脂平板上洗下菌落，采用活菌直接镜
检计数法计数菌数[2]，推算出菌悬液
的活菌数，并将上述悬液稀释得到
107cfu/ml。
1 . 2 . 2 溶 壁 微 球 菌 粉 末 的 制 备
将溶壁微球菌涂布于营养琼脂上，
28℃ 下培养过夜，用无菌重蒸水将
溶壁微球菌菌落从营养琼脂平板上洗
下来，2 500r／min离心15min，去
上清，用4mL丙酮洗涤后，2 500 r／
min离心3 min，去上清，重复2次，
再用4mL乙醚洗涤，2 500 r／min离
心3 min，重复1次，把溶壁微球菌从
离心管中取出，放到研钵中，于28℃
下干燥3h，把结块的细菌磨成粉末分
装到小离心管中，4℃下保存备用。
1.2.3 注射感染 投喂相应的饲料3
周后，以腹腔注射的方式使罗非鱼
感染嗜水气单胞菌。阴性对照每尾
鱼注射0.1mL无菌生理盐水，阳性对
照，Orego-1和Orego-2组每尾鱼注射
0.1mL的菌悬液（107 cfu/mL）。注
射后分别在0h，2h，4h，8h，12h，
24h，48h，72h后取血做各项指标的
检测，每组每次取3尾。
1.2.4 血清、血细胞及白细胞的收集
及测定 将罗非鱼侧置于解剖盘中，
尾静脉采血后，一部分直接加至离
心管中4℃ 静置过夜，吸出血清后
3 000 r／min离心，用于溶菌酶的测
定。另一部分用无菌肝素钠抗凝，用
于白细胞数量以及NBT阳性细胞的测
定。
1.2.4.1 白细胞数量的测定 在98mL
蒸馏水中加入1％亚甲基蓝3滴，冰醋
71·《当代水产》2011年5月
图1 嗜水气单胞菌对罗非鱼血清中白细胞数量的变化
图2 嗜水气单胞菌对罗非鱼血清中NBT阳性细胞数量的变化
图3 嗜水气单胞菌对罗非鱼血清中溶菌酶活力的变化
酸2mL配制成100mL白细胞稀释液。取
20µL抗凝血加入盛有38µL白细胞稀释
液的离心管中，待红细胞全部溶解
后，吸取白细胞悬液，在光学显微镜
下用血球计数板计数白细胞总数，
每尾鱼观察计数3个视野，再取平均
值。
1 . 2 . 4 . 2 N B T阳性细胞的检测
取50 µL抗凝血滴于盖玻片上，室
温下置湿盒中30min后，用PBS（pH
6 . 4 ） 轻 洗 盖 玻 片 以 完 全 去 除 红 细
胞，然后在载玻片上滴加50 µL 0.2g
／L NBT溶液，将盖玻片反扣在NBT溶
液上，室温下湿盒中温育30min，直
接在4×100倍的显微镜下观察结果，
细胞染成浅黑色的为NBT阳性细胞。
每尾鱼观察计数5个视野，再计算3尾
鱼平均1个视野中NBT阳性细胞的数
目。
1.2.4.3溶菌酶活力的测定 主要根
据简纪常[3]的方法进行。用PBS（pH
6.4）将溶壁微球菌配成0.2 mg／mL
的菌悬液，每个样品取3mL菌悬液，
吸取40 µL血清加入到3mL菌悬液中，
混匀后立刻在540 nm下测定值。然后
在28℃ 水浴中温浴30min。取出后置
于4℃ 冰浴中以终止反应，再测定A
值，按公式计算溶菌酶的活力：U=
（A0-A）／A。
2 结果
2.1罗非鱼的外观症状
罗 非 鱼 腹 腔 注 射 嗜 水 气 单 胞 菌
后，主要症状为摄食量下降，活力能
力减弱。48h后腹部出现增大，腹腔
注射部位红肿，口部、各鳍基部、
鳃盖及鳃裂后部均有出血症状，眼
Aquaculture
72·《当代水产》2011年5月
球外突。部分罗非鱼鳃盖凹陷，鳃丝
发白，肛门红肿呈濒死状态。解剖后
观察可见肝脏呈土黄色、心脾颜色暗
红，肠道少或无食物。取血后发现，
血液中红细胞含量明显降低。各种症
状表明，嗜水气单胞菌对罗非鱼肝、
肾、脾、心、肠、鳃都造成不同程度
的破坏，特别是对肝、鳃和肾破坏程
度较大。72h后阳性对照组罗非鱼死
亡达50%，Orego组罗非鱼也有少量死
亡，而阴性对照组无死亡。
2.2 白细胞数量
注 射 嗜 水 气 单 胞 菌 后 ， 白 细 胞
数 量 随 时 间 变 化 趋 势 见 表 3 。 在 感
染嗜水气单胞菌的2h内，白细胞数
量 有 所 增 加 。 各 组 间 差 异 不 显 著
（P >0.05）。2～4h间试验组白细
胞数量继续增加并达到峰值，阳性
对照最高，Orego-1和Orego-2比阴
性 对 照 组 也 显 著 提 高 ， 但 还 是 显
著低于阳性对照组（P <0.05），而
Orego-1和Orego-2之间差异不显著
（ P > 0 . 0 5 ） 。 8 ～ 2 4 h 阳 性 对 照 、
Orego-1和Orego-2白细胞数量持续下
降，但至第24h阳性对照仍显著高于
阴性对照组（P <0.05），而Orego-1
和Orego-2和阴性对照组已无差异显
著（P >0.05），染菌48h后阳性对照
组白细胞数量已经显著下降到低于阴
性对照组（P <0.05），而Orego-1和
Orego-2与阴性对照组处于同一水平
（P>0.05）。
2.3 NBT阳性细胞
阳性对照、Orego-1和Orego-2组
的NBT阳性细胞数量随时间变化大
体 上 先 升 高 后 降 低 ， 如 表 4 所 示 。
在感染嗜水气单胞菌的2h-8h内，
阳性对照、Orego-1和Orego-2组的
NBT阳性细胞数量差异高于阴性对照
组（P <0.05），且在此期间阳性对
照组的NBT阳性细胞数量显著高于
Orego-1和Orego-2组。第8h之后，到
第12h，阳性对照组的NBT阳性细胞
数量急速下降，显著低于阴性对照
组（P <0.05）；而此时，Orego-1和
Orego-2组的NBT阳性细胞数量仍然显
著高于阴性对照组（P <0.05）。第
24h-72h，Orego-1和Orego-2组的NBT
阳性细胞数量与阴性对照组无显著差
异（P>0.05），而阳性对照组已显著
低于Orego-1、Orego-2组和阳性对照
组。
2.4 溶菌酶活力
罗非鱼感染嗜水气单胞菌后血
清 中 溶 菌 酶 活 力 变 化 趋 势 见 表 5 。
在感染嗜水气单胞菌的2h内，阳性
对照组溶菌酶活力快速提升，并与
Orego-1和Orego-2组，及阴性对照
组差异显著（P <0.05），2h-4h间，
Orego-1和Orego-2组的溶菌酶活力也
快速上升至与阳性对照同一水平，且
显著高于阴性对照组（P <0.05）；
8h-72h，阳性对照组的溶菌酶活力快
速下降，并显著低于阴性对照组和
Orego-1和Orego-2组，而此期间，
Orego-1和Orego-2组和阴性对照组差
异不显著（P>0.05）。
3 讨论
鱼类免疫系统包括非特异性免疫
系统和特异性免疫系统，非特异性免
疫系统可以在微生物入侵时立即发生
作用，有效地清除、降解病原微生物
和其他有害物质，而此时抗体尚未产
生，因而是鱼类抵抗感染的第一道防
线。以往研究多集中在饲料添加剂对
鱼类非特异免疫功能的影响，而本试
验是在研究病原菌感染的情况下探讨
止痢草精油对鱼类非特异性免疫功能
的影响，这增加了试验的实践应用价
值。
本试验以白细胞数、NBT阳性细胞
数和溶菌酶活力3个指标的变化反映
止痢草精油和嗜水气单胞菌对罗非鱼
非特异免疫功能的影响。在感染嗜水
气单胞菌初期，嗜水气单胞菌的入侵
刺激了鱼代偿性应激，血中白细胞数
目增多，而随着时间的延长，对外周
血白细胞产生损害及抑制，从而白细
胞数目减少。Orego组（下接74页）
73·《当代水产》2011年5月
74·《当代水产》2011年5月
（上接73页）的罗非鱼经过感染嗜水
气单胞菌后，细胞数目也有增多趋
势，但没有阳性对照组高，可能的原
因是在止痢草精油的帮助下，机体对
嗜水气单胞菌的抗感染能力增强。而
24h后，阳性对照的白细胞数急速下
降，而此时Orego组白细胞数仍然维
持与阴性对照同一水平，可见止痢草
精油的补充可以缓解或抑制嗜水气单
胞菌感染导致的机体损伤。
在鱼类血细胞中，吞噬细胞、
中性粒细胞、巨噬细胞都具有吞噬异
物的能力，是鱼类非特异性免疫的
主要指标之一，它们的数量和吞噬能
力高低可直接反映出鱼类非特异性
功能的大小。本试验中的NBT阳性细
胞是这3种细胞的总称[4]。NBT是研究
这3种细胞数量和吞噬能力的最佳指
标，这些细胞吞噬了NBT后胞质中的
葡萄糖-6-磷酸氧化所脱下的氢被NBT
所接受，使淡黄色的NBT还原变为棕
黑色。与白细胞数量变化趋势类似，
在细菌感染初期刺激了鱼体的免疫系
统，因而吞噬细胞、中性粒细胞、巨
噬细胞的数量及活性都有一定程度的
提高。经过一段时间后细菌感染引起
免疫系统受到一定程度的损伤，致
使这3种细胞的数量和活性又有所下
降。Orego组的罗非鱼经过感染嗜水
气单胞菌后，也出现了NBT阳性细胞
显著上升的情况，但此后并未下降到
低于阴性对照的水平，同样可推测止
痢草精油的补充降低了嗜水气单胞菌
对罗非鱼的危害。
溶菌酶主要在肝内合成并分布于体液
及体表粘液中，在鱼体抵抗感染性致
病菌的防御机制中起着重要作用[5] 。
溶菌酶是鱼类血清中极为重要的非特
异性免疫指标之一，溶菌酶主要针对
革兰氏阳性菌发挥作用，对一些革兰
氏阴性菌如伤寒杆菌、嗜水气单胞菌
等也有作用，在防御病原入侵上起着
重要作用[5-6]。溶菌酶活力的变化与
前两个指标类似，一是可以判断出嗜
水气单胞菌对罗非鱼有较强的致病作
用，二是可推测止痢草精油可以有效
缓解该病原菌的危害，并促进机体免
疫力的恢复。
本试验从非特异性免疫的角度探
讨了罗非鱼的急性期反应，用以上3
个指标反映了在较短的时间内非特异
性免疫体系对病原菌入侵鱼体的反
应，同时探讨止痢草精油对嗜水气单
胞菌侵袭的缓解作用。为了深入研究
鱼类和病原菌的相互作用以及止痢草
精油对嗜水气单胞菌的直接或间接抑
制或杀灭作用，结合组织切片和电镜
照片，会更深入解释嗜水气单胞菌与
止痢草精油对罗非鱼健康的影响和相
互关系。D
参考文献略
不善言辞的老养殖户
最近在搜索养殖户成功养殖经验
的时候，收到来自湖北监利县柘木乡
人民政府的谢岳成先生的投稿，讲的
是监利县云程水产合作社的一些事
宜，这个水产合作社是一位叫王云程
的养殖户组建的，在当地引起了不小
的反响，那究竟这个合作社有哪些优
势，身为社长的王云程先生又是怎样
一个人，具体带领养殖户做了哪些工
作？为了做到真实、具体、客观，记
集小力成大力，
带动养殖户共同致富
Fishermen