全 文 ：小叶黑柴胡总多糖对小鼠免疫功能的影响
王　铮1 ,程小芹1 ,徐　晗2 ,乐曦玲1 ,力　弘1 ,章蕴毅1 ,陈道峰2　(复旦大学药学院1 药理学教研室 , 2 生药学
教研室 ,上海 200032)
【摘要】　目的　研究小叶黑柴胡总多糖对小鼠免疫功能的影响。方法　将小鼠随机分为空白对照组 、阳性药对照组 、小叶黑
柴胡总多糖 2个剂量(40、20 mg·kg-1)组 , 灌胃给药。检测药物对绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应的影响;测定小鼠 T、
B 淋巴细胞转化功能;检测药物对小鼠血清溶血素水平的影响;中性红比色法测定小鼠腹腔巨噬细胞胞饮功能 , 硝酸还原酶法
测定巨噬细胞培养上清液中一氧化氮水平。结果　小叶黑柴胡总多糖 40 mg·kg-1显著抑制迟发型变态反应(P<0.05);小叶
黑柴胡总多糖 20 mg·kg-1显著增强腹腔巨噬细胞胞饮能力(P<0.05);显著升高血清溶血素水平(P <0.001)。 小叶黑柴胡总
多糖刺激淋巴细胞增殖 ,并协同伴刀豆球蛋白 A 促进小鼠 T淋巴细胞增殖(P<0.05)。结论　小叶黑柴胡总多糖对小鼠免疫
功能有调节作用。
【关键词】　小叶黑柴胡;　总多糖;　迟发型变态反应;　淋巴细胞;　溶血素;　巨噬细胞
【基金项目】　国家自然科学基金(30572315);复旦大学药学院大学生科技创新基金(KC200709);上海市重点学科建设(B119)
【作者简介】　王　铮(1983-),女 ,在读硕士研究生。研究方向:免疫药理学。Tel:021-54237343;E-mail:062103155@fudan.edu.cn
【通信作者】　力　弘 ,副教授 ,硕士生导师。Tel:021-54237343 , Fax:021-64693495;E-mai l:lxzhang@shmu.edu.cn
【文献标志码】A　　　　　　　　【文章编号】1007-4406(2009)04-0200-05
Effects of Bupleurum smithii var.parvifolium total polysaccharides on immune
functions in mice
WANG Zheng
1 , CHENG Xiaoqin1 , XU Han2 , YUE Xiling1 , LI Hong1 , ZHANG Yunyi1 , CHEN Daofeng2 　
(1Department of Pharmacology , 2Department of Pharmacognosy , School of Pharmacy , Fudan University , Shanghai
200032 , China)
【ABSTRACT】　AIM　To study the effects of Bupleurum smithii var.parvifolium total polysaccharides(BPs)on im-
munological functions in mice.METHODS 　Mice were randomly assigned into control , positive drug treated and BPs
treated(40 and 20 mg·kg-1)groups.The delayed type allergic reactions(DTAR)in mice were induced by sheep ery-
throcyte (SRBC).The effect of BPs on DTAR , lymphocytes proliferation and levels of serum hemolysin were studied.The
pinocytosis of peritoneal macrophages(MΥ)was detected with neutral red chromatometry , and nitric oxide (NO)re-
leased by peritoneal MΥwas measured with nitrate reductase method.RESULTS 　BPs 40 mg·kg-1 significantly inhibit-
ed DTAR(P<0.05);BPs 20 mg·kg-1 significantly enhanced the pinocytosis of peritoneal macrophage(P<0.05)and
elevated the level of serum hemolysin(P<0.001).Treatment of BPs promoted splenic lymphocyte proliferation and syn-
ergistically improved the concanavalin A-induced T cell proliferation (P<0.05).CONCLUSION　The results demon-
strate that exposure to BPs result in immunoregulation in mice.
【KEY WORDS】　Bupleurum smithii var.parvifolium ;　total polysaccharide;　delayed type allergic reaction;　lym-
phocyte;　hemolysin;　macrophage
　　柴胡是“非典”时期推荐用于防治非典型性肺炎 的常用中药之一。小叶黑柴胡(Bupleurum smithii
·200· 　中国临床药学杂志　CHINESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACY　2009 年第 18卷第 4 期　
Wolff.var.parvifolium Shan et Li)主要分布于我国西
北地区 ,在宁夏为商品柴胡的主要来源 ,具有解表退
热 、舒肝升阳之功效[ 1] 。以往文献报道了小叶黑柴
胡粗皂苷能显著降低四氯化碳肝损伤小鼠的血清转
氨酶 ,有显著的保肝作用[ 2] ;另外 ,小叶黑柴胡粗皂
苷还是柴胡抗炎[ 3] 、免疫调节作用[ 2]的活性成分 。
但关于小叶黑柴胡多糖对免疫功能影响的研究未见
报道 。本研究通过观察小叶黑柴胡总多糖对小鼠多
项免疫指标的影响 ,探讨其免疫调节作用。
1　材料
1.1 主要药品与试剂　盐酸左旋咪唑[(-)-te-
tramisole hydrochloride minimum , Sigma 公司 , 批 号
L9756-5G ,4℃冷藏] ;醋酸泼尼松(天津天药药业有
限公司 ,批号 PAAC030101);小牛血清(上海实生细
胞生物技术有限公司);细胞培养基 Rosewell Park
Memorial Institute (RPMI)-1640(Sigma 公司 , 批号
124K8306),用三蒸水配成 10.4 g·L-1 , 含青霉素
62.5 mg·L-1 ,硫酸链霉素100 mg·L-1 ,丙酮酸钠110
mg·L-1 , Hepes 3.57 g·L-1;伴刀豆球蛋白(con-
canavalin A , ConA , 批 号 L - 3129), 内 毒 素
(lipopolysaccharide , LPS ,批号 C-2010),均由 Sigma
公司出品 ,用 RPMI-1640配成 500 mg·L-1 , -20℃保
存;硝酸还原酶比色法测定试剂盒(南京建成生物工
程公司 , 批号 20071022);甲基噻唑基四唑(methyl
thiazolyl tetrazolium , MTT , Fluka ,华美公司提供 ,批号
0403),用 RPMI-1640配成 5 g·L-1 ,过滤除菌后 4℃
避光保存;流体硫乙醇酸盐培养基(thioglycollate
medium ,上海中科昆虫生物技术开发有限公司提供 ,
批号 071115),用生理盐水配成 3%, 4℃冷藏 ,用前
灭菌消毒 。
1.2 动物　昆明种或 BALB/c 小鼠 , ♂, 6周龄 ,上
海斯莱克实验动物有限责任公司提供 ,许可证号:
SCXK(沪)2007-0005。
1.3 仪器 　Well scan MK3 型酶标仪(芬兰雷勃公
司),MR22i型低温高速离心机(Jouan 公司), YLS -
7B型足趾容积测量仪(山东省医学科学院设备站)。
2　方法
2.1 小叶黑柴胡总多糖的制备　取小叶黑柴胡(批
号H2003121602)根茎粗粉 20 g ,以 95%乙醇冷浸提
取至无色 ,药渣于室温下置通风处晾干 ,然后用热水
提取 3次 ,每次加 4倍体积水 ,每次提取时间为 2 h。
合并水提液 ,浓缩 ,800 r·min-1离心 10 min ,上清液
以15 %三氯醋酸于 4℃去游离蛋白 , 800 r·min-1离
心 15 min ,上清液以 l mol·L-1 NaOH中和至中性 ,流
水透析 3 d。袋内溶液浓缩至小体积后加乙醇至含
醇量80%,800 r·min-1离心 10 min ,沉淀冷冻干燥即
得粗多糖(收率为 3.32 %)。
2.2 药物配制　称取小叶黑柴胡总多糖加生理盐
水超声 12min ,放置过夜 ,加入等体积 1 %CMC 磁力
搅拌均匀;再加入等体积 0.5 %CMC 稀释 ,药物质
量浓度分别为4和 2 g·L-1。
2.3 迟发型变态反应实验[ 4] 　♂性昆明种小鼠 ,随
机分为正常组 、模型对照组(0.5 %CMC)、醋酸泼尼
松(5 mg·kg-1)组 、小叶黑柴胡总多糖(40 和 20 mg·
kg-1)两组 ,每组 10 只 ,灌胃第 0 ～ 8 天。第 2天除
正常组外 , 每组小鼠尾根皮下注射磷酸缓冲液
(PBS)配置的 2%绵羊红细胞悬液(SRBC)0.1 mL;正
常组注射PBS 作为阴性对照 。第 7天称取每组小鼠
的左 、右后足质量作为基础值 ,然后足跖皮下注射
20%SRBC 20 μL;正常组注射 PBS 作为阴性对照。
攻击后 18和 24 h ,分别测定各小鼠左 、右后足质量 ,
减去基础值 ,以差值作为肿胀度。攻击后 24 h处死
小鼠 ,取胸腺及脾脏称重 ,以每 10 g 小鼠的脾质量
(mg)和胸腺质量(mg)作为脾指数和胸腺指数。
2.4 腹腔巨噬细胞(MΥ)吞噬中性红能力的测定[ 5]
　♂性 BALB/c小鼠 ,随机分为正常组(0.5%CMC)、
盐酸左旋咪唑(20 mg·kg-1)组 、小叶黑柴胡总多糖
(40和20 mg·kg-1)两组 ,每组 6只 ,灌胃第 0 ～ 6天。
小鼠处死前 4 d ,腹腔注射 5%流体硫乙醇酸盐培养
基 1 mL ,第 7天脱颈椎处死。无菌操作取腹腔MΥ。
将 MΥ悬浮于 RPMI-1640 中 ,加入 24孔板 ,每孔 1
mL(细胞数为 2×109 个·L-1),37℃, 5%CO2 培养箱
中贴壁 2 h。RPMI-1640清洗3次;每孔加入 1 mL含
10 %小牛血清(FCS)的 RPMI-1640培养基 ,培养基
内含 LPS(终浓度 10 mg·L-1),于 37℃,5%CO2 培养
箱中培养 24 h;生理盐水洗板 3次后 ,每孔加 0.1%
中性红溶液 1mL ,37℃,5%CO2孵育20 min ,生理盐
水冲尽余液 ,每孔加细胞溶解液 1 mL(乙酸∶无水乙
醇=1∶1 , V/ V ,临用前配制),放置过夜 ,于 540 nm
酶标仪测定吸光度(A)。
2.5 MΥ上清 NO含量的测定[ 6] 　同“2.4”项培养
腹腔 MΥ24 h ,取培养上清测定 MΥ上清 NO 含量。
采用硝酸还原酶比色法 ,按试剂盒说明书操作 ,于
540 nm酶标仪测定 A。
2.6 脾淋巴细胞转化实验[ 6] 　♂性 BALB/c小鼠按
“2.4”项给药方案给药 8 d ,每组 10只。各组第 2天
·201·　中国临床药学杂志　CHINESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACY　2009 年第 18 卷第 4期　
腹腔注射 2%SRBC ,每只 0.2 mL。第 8天摘除眼球
取血 ,脱颈处死小鼠 ,收集的血用于溶血素实验;无
菌操作取脾脏 ,制备单个细胞的悬液。尼龙网过滤
后计数细胞 ,将细胞悬浮于含 10%FCS的 RPMI-1640
中 ,按每孔 1×106个细胞加入 96孔U板 ,培养孔中
或不加致裂原 ,或加入 ConA(终浓度 5 mg·L-1),或
加入 LPS(终浓度 10 mg·L-1), 37℃培养 44 h , 加
MTT(终浓度 2 g·L-1),继续培养 4 h , 800×g 离心
10 min ,弃上清 ,每孔加入二甲亚砜(DMSO)150 μL ,
待结晶溶解后 , 492 nm酶标仪测定 A 。
2.7 血清溶血素含量测定[ 7] 　“2.6”项实验取得的
血收于塑料小管。取血1 h后 ,2 000 r·min-1离心10
min ,收集血清 ,按 1∶800用 NS 稀释血清 ,取待测稀
释血清0.2 mL ,10%SRBC 0.1 mL ,补体(豚鼠血清)
0.2 mL(1∶10稀释), 37℃水浴 30 min ,冰浴中止反
应 ,5 000 r·min-1离心 10 min ,取上清 0.2 mL ,置 96
孔板 ,于 405 nm 酶标仪比色 。50%溶血标准管:
10%SRBC 0.5 mL 溶于 1.5 mL 蒸馏水中 ,为 100%
溶血 ,用 NS 对倍稀释(2 mL)后为 50%溶血 ,混匀。
取上清 0.2 mL ,405 nm 波长比色 ,获得 A 值 。样品
中溶血素以半数溶血值(CH50)表示:CH50(U·
mL-1)=样品测定管 A值/50%溶血管 A值×稀释
血清倍数。
2.8 统计学处理　用 Statview 软件 ,数据组间差异
采用ANOVA分析或Fisher s PLSD test分析 。
3　结果
3.1 小叶黑柴胡总多糖对迟发型变态反应以及小
鼠脾脏和胸腺指数的影响　与模型组相比 ,小叶黑
柴胡总多糖 40 mg·kg-1和醋酸泼尼松都明显改善炎
症模型小鼠足局部水肿的作用(P<0.05)。醋酸泼
尼松 5 mg·kg-1对炎症模型小鼠脾指数和胸腺指数
有显著降低作用(P<0.01),并低于正常小鼠(P <
0.05), 小叶黑柴胡总多糖对脏器指数无影响。
见表1 。
表 1　小叶黑柴胡总多糖对小鼠迟发型变态反应和脏器指数的影响
Table 1.　Effects of BPs on delayed type allergic reaction and organ index in mice ( x±s , n=10)
Group
w(Dose)/
mg·kg -1
Paw swelling/mg
18 h 24 h
Spleen index/mg·10 g -1 Thymus index/mg·10 g -1
Normal - 21±25c 12±13c 29±5c 26±9
Control - 77±30 73±27 39±7 22±7
BPs 40 51±19b 55±18b 36±7 24±11
BPs 20 68±14 64±17 38±5 22±10
Prednisone 5 22±16c 35±18c 23±4c 11±4c
　Compared with control group , bP<0.05 , cP<0.01
3.2 小叶黑柴胡总多糖对小鼠腹腔 MΥ功能和血
清溶血素水平的影响 　用中性红比色法测定 MΥ
胞饮能力 ,与正常组相比 ,左旋咪唑(P <0.05)和小
叶黑柴胡总多糖均增强MΥ胞饮能力 ,小叶黑柴胡
总多糖20 mg·kg-1的促进作用有统计学意义 。与正
常组相比 ,左旋咪唑和小叶黑柴胡总多糖组 MΥ的
培养上清中 NO的含量有升高的趋势 ,但无统计学
意义 。见表2。
与正常组比较 ,盐酸左旋咪唑(P <0.05)和小
叶黑柴胡总多糖 20 mg·kg-1(P <0.01)能显著提高
正常小鼠血清溶血素水平 , 小叶黑柴胡总多糖 40
mg·kg-1也有提高正常小鼠血清溶血素水平的作用 ,
但没有统计学意义。见表 2。
3.3 小叶黑柴胡总多糖对小鼠脾淋巴细胞转化功
能的影响　对不加刺激剂的脾淋巴细胞 ,小叶黑柴
表 2　小叶黑柴胡总多糖对正常小鼠腹腔MΥ功能和血清
溶血素水平的影响
Table 2.　Effects of BPs on peritoneal functionsMΥand level
of serum hemolysin in mice ( x±s)
Group
w(Dose)/
mg·kg-1
A(Pinocytosis)/
(n=6)
c(NO)/
μmol·L-1
(n=6)
HC50/
U·mL-1
(n=10)
Normal - 0.28±0.05 646±86 245±20
BPs 40 0.35±0.03 701±133 255±24
BPs 20 0.36±0.05b 672±201 279±10c
Levamisole 25 0.36±0.06b 753±146 261±12b
　Compared with normal group , bP<0.05 , cP<0.01
胡总多糖40 mg·kg-1(P <0.05)和 20 mg·kg-1(P<
0.01)均有显著刺激增殖的作用 。小叶黑柴胡总多
糖 40 mg·kg-1(P <0.05)和 20 mg·kg-1(P <0.01)
协同ConA增强T 淋巴细胞转化能力 ,对 LPS刺激的
·202· 　中国临床药学杂志　CHINESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACY　2009 年第 18卷第 4 期　
B淋巴细胞转化无明显的协同作用。见表 3。
表 3　小叶黑柴胡总多糖对小鼠 T、B淋巴细胞增殖的影响
Table 3.　Effects of BPs on ConA and LPS-induced lymphocyte proliferation in mice ( x±s , n=10)
Group
w(Dose)/
mg·kg -1
T cells
1640-10%FCS ConA(5 mg·L-1)
B cells
1640-10%FCS LPS(10mg·L -1)
Normal - 0.62±0.07 1.00±0.17 0.72±0.14 0.95±0.11
BPs 40 0.71±0.13b 1.12±0.10b 0.94±0.19c 0.98±0.14
BPs 20 0.86±0.11c 1.20±0.07c 0.96±0.16c 0.99±0.16
Levamisole 25 1.01±0.11c 1.24±0.14c 1.30±0.20c 1.35±0.31c
　Compared with normal group , bP<0.05 , cP<0.01
4　讨论
近年来 ,从植物(包括蘑菇 、藻类 、苔藓和高等植
物)中提取出来的多糖在植物界中引起了相当高的
关注 ,它们的治疗范围广而且毒性相对低[ 8-10] 。植
物多糖有理想的免疫调节 、抗肿瘤 、创伤愈合作
用[ 11-13] 。从小叶黑柴胡的根部位中提取出来的均
一多糖D3-S1无论对补体系统的经典激活途径还是
旁路激活途径都有显著的抑制效果[ 14] 。
迟发型变态反应是由特异性致敏效应T 细胞介
导的细胞免疫反应 ,大量非特异性的炎症细胞浸润
为其特征 ,其中以MΥ最多[ 15] 。阳性对照药泼尼松
能抑制迟发型变态反应 ,并使小鼠胸腺 、脾脏质量都
明显减轻;小叶黑柴胡总多糖 40 mg·kg-1明显抑制
由SRBC诱导的迟发型变态反应 ,但对胸腺和脾脏
的质量没有明显的影响 。结果表明 ,高剂量的小叶
黑柴胡总多糖抑制迟发型变态反应 ,其作用机制可
能不同于泼尼松等甾体类抗炎药物 ,尚有待于进一
步研究探讨。
血清溶血素水平高低与 B 细胞分泌抗体密切
相关 ,是反映体液免疫功能的重要指标。小叶黑柴
胡总多糖 20 mg·kg-1对小鼠的血清溶血素水平有显
著的提高作用 ,显示低剂量的小叶黑柴胡总多糖对
体液免疫应答有上调作用 。
MΥ在炎症反应过程起着十分重要的作用。在
局部或全身炎症反应过程中 ,MΥ的活化会产生许
多炎症介质 ,其中包括NO 。许多全身炎症反应过程
中可以出现严重的微循环障碍 ,Tsai 等[ 16]阐述了诱
导型NO合酶在炎症反应中可以使大量的 NO 产生
和释放 ,NO在微循环障碍的发生和发展过程中起着
重要作用;同时作为一种新的免疫分子和炎症介质 ,
NO一定程度上介导了内毒素 、TNF 、IL-1 、IL-6 等细
胞因子的病理作用[ 17] 。循环中大量免疫复合物在
组织中的沉积 ,会参与多种疾病组织病理损伤的形
成 ,MΥ的清除能力对保护机体减少病理损伤的形
成有重要的意义。我们采用了中性红法来观察小叶
黑柴胡总多糖对腹腔 MΥ的胞饮能力的影响。从
结果上看 ,小叶黑柴胡总多糖 20 mg·kg-1能显著增
强正常小鼠腹腔M Υ的胞饮能力 ,这可能有利于机
体对可溶性免疫复合物或其他病原微生物的清除。
小叶黑柴胡总多糖对腹腔 MΥ受 LPS刺激后 ,培养
上清NO水平无明显的上调作用 ,因此低剂量的小
叶黑柴胡总多糖有可能在上调 MΥ胞饮能力的同
时 ,在一定程度上并不加重炎症反应 。小叶黑柴胡
总多糖对炎症以及其他炎症相关细胞因子的影响 ,
有待在后续研究进一步观察 。
小叶黑柴胡总多糖对不加多克隆刺激剂的脾淋
巴细胞 ,均有显著的促活化 、增殖作用。对 ConA诱
导的小鼠T 淋巴细胞增殖 ,小叶黑柴胡总多糖有显
著的协同作用。但对LPS刺激的B淋巴细胞转化却
无明显的协同作用 ,显示出小叶黑柴胡总多糖对体
液免疫应答和细胞免疫应答调节可能存在着一定的
差异。
本研究表明 ,小叶黑柴胡总多糖 20 mg·kg-1能
升高血清溶血素水平 ,增强腹腔 MΥ的胞饮功能 ,
刺激小鼠脾脏淋巴细胞活化增殖 ,显示了低剂量小
叶黑柴胡总多糖对正常小鼠的免疫功能有明显的上
调作用;小叶黑柴胡总多糖 40 mg·kg-1对正常小鼠
不具有免疫上调作用或作用与 20 mg·kg-1相近 。但
当机体处于致敏状态 ,免疫功能过强时 ,小叶黑柴胡
总多糖 40 mg·kg-1有明显下调的作用 ,显著抑制小
鼠 DTH 反应 ,而小叶黑柴胡总多糖 20 mg·kg-1的效
果不显著 。综上所述 ,我们认为小叶黑柴胡总多糖
可能是一种免疫调节剂 ,其对小鼠免疫功能的作用
与其剂量及机体的免疫功能的状态有关。
·203·　中国临床药学杂志　CHINESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACY　2009 年第 18 卷第 4期　
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(2008-09-19 收稿)
反相高效液相色谱法测定大鼠脏器组织中吉西他滨的含量
郭燕萍1 ,李金明2 ,王　轶1 ,傅德良2 ,李中东1　(复旦大学附属华山医院1 药剂科 , 2 普外科 ,上海 200040)
【摘要】　目的　建立反相高效液相色谱法用于测定大鼠胰腺 、肝脏 、脾脏 、肾脏 、肺脏 、心脏 、腹直肌组织中吉西他滨的含量。
方法　采用 phenomenex色谱柱 , 5-溴尿嘧啶为内标 ,流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸溶液(3∶97 , V/ V),流速 1.0 mL·min-1 , 检
测波长 268 nm , 柱温 45℃。组织样品经甲醇-乙腈(1∶9 , V/ V)蛋白沉淀处理后 , 55℃恒温水浴中氮气吹干 , 经流动相溶解后进
样 ,进样量 50 μL。结果　大鼠各脏器组织中吉西他滨在浓度 1～ 100 mg·L-1内线性关系良好 , 方法回收率为 93%～ 104%, 提
取回收率>70%,日内 、日间 RSD 均<6%。结论　本方法操作简单 , 重现性好 , 可用于大鼠多种组织中吉西他滨的含量测
定。
【关键词】　反相高效液相色谱;　吉西他滨;　脏器组织
【基金项目】　上海市经委重点产业技术产学研联合攻关项目(沪产学研 06-23);上海市科委重大科技攻关项目(05DZ19346;08431902500)
【作者简介】　郭燕萍(1976-),女 ,主管药师 ,在读硕士研究生。从事医院药学工作。 Tel:13621761278
【作者简介】　李金明(1980-),男 ,博士研究生 ,从事外科学工作。Tel:021-52889999-6060
【通信作者】　李中东(1969-),男 ,副主任药师 ,硕士生导师。从事新药药动学和临床药学研究。 Tel:021-32120059
【通信作者】　傅德良(1966-),男 ,教授 ,主任医师 ,硕士生导师。从事胰腺外科诊治及研究工作。 Tel:021-52889999-6060
【文献标志码】A　　　　　　　　【文章编号】1007-4406(2009)04-0204-05
·204· 　中国临床药学杂志　CHINESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACY　2009 年第 18卷第 4 期