全 文 ：胡豆莲组织培养外植体选择和消毒研究
韩如刚，林茂祥* ，刘 杰，肖 波，李 娟，张 军，申 杰 (重庆市药物种植研究所，重庆南川 408435)
摘要 ［目的］为研究胡豆莲组织培养技术奠定基础。［方法］采用不同消毒方法处理胡豆莲不同外植体。［结果］胡豆莲组织培养最佳
外植体为无病害的新抽嫩叶;最佳消毒方式为用 70%的乙醇浸泡 30 s、0． 1%HgCl2 溶液消毒 3 min，其污染率和存活率分别为 16． 67%和
83． 33%。［结论］该方法污染率相对低，而存活率较高。
关键词 胡豆莲;外植体;污染率;存活率
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)23 －14021 －01
Selection and Sterilization of Explants of Euchresta japonica in Tissue Culture
HAN Ru-gang et al (Chongqing Institute of Material Medical Planting，Nanchuan，Chongqing 408435)
Abstract ［Objective］The aim of the study was to lay the foundation for technology of tissue culture for Euchresta japonica． ［Method］The experi-
ments were conducted in order to select the appropriate explants for tissue culture and the method of optimal sterilization of explants． ［Result］The
results showed that the best explants was disease-free，and new-grow green leaves，and the best way of sterilization was:firstly，the explants were im-
mersed in alcohol (70%)for 30 seconds，and then were sterilized in mercuric chloride (0． 1%)for 3 minutes，The pollution rate was 16． 67%，and
the survive rate was 83． 33%． ［Conclusion］The method had the lowest pollution rate and the highest survive rate．
Key words Euchresta japonica;Explants;Pollution rate;Survive rate
基金项目 重庆市医学科技计划项目(2007-2-17)。
作者简介 韩如刚(1978 －)，男，重庆綦江人，助理研究员，硕士，主要从
事组织培养方面的研究。* 通讯作者。
收稿日期 2011-05-16
胡豆莲(Euchresta japonica Hook． f． ex Rege)又名山豆
根、日本山豆根、三小叶山豆根，系豆科山豆根属植物，在我
国零星分布于华南和西南的部分地区，为国家二级重点保护
野生植物。其性味苦寒，有清热、解毒、消肿、镇痛等功
效［1 －2］。1972版的《中药大辞典(上)》记载:“日本山豆根对
恶性肿瘤有显著效果，副作用小，安全，且不使白细胞减少。
试验动物一般状态良好，认为可在临床上试用”。
由于胡豆莲野生资源日趋减少，种子繁殖能力低下，笔
者对其组织培养中外植体选择和消毒方式进行了研究，为胡
豆莲的组培快繁提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 在“胡豆莲野生变家种”项目研究中，在重庆市
药物种植研究所标本园栽植、保存了一些胡豆莲植株。选取
长势好、无病虫害的健康母株，采集当年生茎段及叶片作为
试验材料。
1． 2 方法 将胡豆莲茎段剪成带有 2 ～3个节、4 cm左右小
段，叶片则保留叶柄，用自来水浸泡 5 min，再用含有洗衣粉
的自来水浸泡 15 min，然后在自来水下冲洗 1 h，滤干后消毒
处理。在超净工作台上，对已预处理的外植体进行消毒，用
70%的乙醇浸泡外植体 30 s，再用无菌水洗 3次，从中分别选
取嫩叶(新抽出至展开的叶片)、老叶、茎段 3种外植体，按表
1设计的 11个处理用 0． 1% HgCl2 溶液消毒。
把消毒后的外植体用无菌水冲洗 3次，放至铺有无菌滤
纸的盘中，吸干材料表面的水分，如外植体是茎段，则切掉两
端与药液接触的部分，再切成0． 5 ～1． 0 cm的小段;如外植体
是嫩叶，切掉四周与药液接触的部分，再切成 1． 0 cm2 的小
块，接种至培养基中进行培养，每个处理接 10 瓶，每瓶接 1
个外植体，重复 3 次。接种后放入培养室培养，培养室温度
为(25 ±1)℃，光照强度为 3 000 lx，光照周期 14 h /d。在培
养的第 20天统计污染率、死亡率和存活率，比较消毒效果，
并筛选出最佳外植体和最佳消毒方案。
表 1 胡豆莲不同外植体及消毒的试验设计
Table 1 Experimental design with different explants and disinfection
处理
Treatment
外植体
Explants
处理时间
Treatment time∥min
① 嫩叶 3
② 嫩叶 4
③ 嫩叶 5
④ 老叶 4
⑤ 老叶 5
⑥ 老叶 6
⑦ 茎段 5
⑧ 茎段 7
⑨ 茎段 9
瑏瑠 茎段 11
瑏瑡 茎段 13
1． 3 培养基的制备 制备 MS 基本培养基，并根据试验设
计添加不同浓度的吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸
(NAA)等生长素类物质和激动素(KT)、6-苄基腺嘌呤(6-
BA)等细胞分裂素类物质。采用 MS + 6-BA 2． 0 mg /L +
NAA 0． 2 mg /L的诱导培养基，在进行组织培养的前 1 d，按
试验设计制备相应的瓶数。培养基以 7 g /L琼脂为固化剂，
附加 30 g蔗糖，培养基的 pH控制在 5． 6 ～ 6． 0;培养基灭菌
为恒温 121 ℃，恒压 108 kPa，时间 20 min。同时，对所需器
材，如镊子、刀片、培养皿、滤纸及无菌水等进行消毒处理。
2 结果与分析
在对外植体进行消毒时，消毒剂的选择和消毒时间的设
置是消毒试验的关键，选用在组培试验中较常用的 0． 1%
HgCl2 溶液进行消毒。由于在消毒的同时，消毒剂会破坏外
植体的细胞，细胞出于自我保护，不断地产生大量次生物质，
若消毒时间过长，会引起细胞毒害，导致外植体褐变甚至死
亡;若消毒时间过短，外植体则会因消毒不彻底，而导致高污
染。因此，对不同外植体设置不同的时间梯度进行试验，以
探求最佳外植体及最佳消毒时间。结果见图 1。
由图1可知，不同消毒时间对胡豆莲外植体污染率、死
(下转第 14051页)
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(23):14021，14051 责任编辑 李占东 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.23.184
肥处理。
3 结论
粪肥与化肥配施对紫色土土壤中活性有机质、铵态氮和
硝态氮的含量以及土壤酶活性的影响均呈动态变化，粪肥与
化肥处理一般表现为倒“S”型，出现 2个或多个峰值，且峰值
出现较化肥处理略为滞后，峰尖较平缓，而化肥处理多为单
峰，峰值最高。活性有机质各处理均在培养 10 d左右出现峰
值，活性有机质含量高低顺序为牛5 肥5 ＞猪5 肥5 ＞牛粪 ＞猪
粪 ＞化肥Ⅰ＞化肥Ⅱ;铵态氮含量高低顺序为化肥Ⅰ＞化肥Ⅱ
＞猪5 肥5 ＞牛5 肥5 ＞牛粪 ＞猪粪;脲酶活性高低顺序为猪粪
＞牛5 肥5 ＞牛粪 ＞化肥Ⅰ＞化肥Ⅱ＞猪5 肥5;蔗糖酶活性高
低顺序为猪5 肥5 ＞猪粪 ＞牛5 肥5 ＞牛粪 ＞ CK ＞化肥Ⅱ＞化
肥Ⅰ。
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(3):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
153 －154．
(上接第 14021页)
图 1 0． 1% HgCl2 溶液对胡豆莲外植体消毒的影响
Fig． 1 Effect of 0． 1% HgCl2 solution on the explants disinfec-
tion of Euchresta japonica
亡率及成活率具有不同的影响。就单一指标而言，污染率以
茎段、老叶、嫩叶的次序逐渐减小，处理③污染率最低为
3． 33%，污染率最高的处理⑦则达 73． 33%;从死亡率来看，
处理①和⑦的死亡率最低，均为 0，而死亡率最高的处理③则
达 53． 33%。就消毒剂而言，用 0． 1% HgCl2 对 3种外植体消
毒，浸泡时间越长，污染率均逐步降低，死亡率却显著上升，
说明采用 HgCl2 消毒，消毒时间越长，其污染率越低但死亡
率越高。从 3种外植体的最高成活率来看，以老叶、茎段、嫩
叶的次序逐渐上升，最高的为嫩叶处理①(83． 33%) ，
其次为茎段处理⑩(53 ． 33% ) ，最低的为老叶处理⑤
(50． 00%)。因此，综合考虑污染率、死亡率和成活率，嫩叶
外植体最适合用于组培试验。
对于嫩叶外植体的 3个处理(处理① ～③) ，处理①污染
率和死亡率均较低，而成活率最高，是其消毒的最好方法。
对于茎段外植体，在其 5 个消毒处理中(处理⑦ ～瑏瑡) ，以处
理⑩的污染率和死亡率较低，而成活率最高，是茎段外植体
适宜采用的方法。而对于老叶外植体的 3个处理(处理④ ～
⑥) ，处理⑤污染率和死亡率相对较低，成活率最高，因此老
叶宜采用处理⑤进行消毒。
3 结论与讨论
污染是组织培养过程中首先遇到的问题，且很难控制。
如果不能将污染降低到可以接受的范围，组培工艺将无法进
行下去，因此保证无菌培养是植物组织培养成败的关键。
从选用的 3种外植体(嫩叶、老叶、茎段)的不同消毒方案
的试验结果来看，在胡豆莲组织培养中，应选取无病害的新抽
嫩叶为外植体，其最佳消毒方式:自来水浸泡 5 min→ 用含有
洗衣粉的自来水浸泡 15 min→在自来水下冲洗 1 h→把外植体
置于 70%乙醇中浸泡30 s→再用无菌水洗3次→浸泡在0． 1%
HgCl2 溶液消毒 3 min→用无菌水洗 3次脱毒。
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1504139卷 23期 施 娴等 粪肥与化肥配施对紫色土养分及酶活性释放动态的影响