全 文 ：羽扇豆种间遗传差异 AFLP分析
海　林 , 肖世和 , 闫长生 , 张秀英
(中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,北京 100081)
摘要:利用 AFLP 对羽扇豆(Lupinus L.)3 个种(L.angustifolius L., L.albus L., L.pilosus Murr.)的18 个
品种指纹图谱进行了分析 , 4 个引物组合共产生 462 条带 、多态性带为 442 , 平均每个引物组合产生 110.5 多态性
带 ,多态性百分率为 95.7%。总体平均遗传多样性指数为 0.781。种间遗传差异大于品种间的遗传差异 , 4 个引物
组合种间和品种间的平均鉴定效率分别为 100%和 84.7%。按 UPGMA方法进行聚类分析 , 所有的供试材料明显
地分为 3 个组 ,每一个组由同一个种的品种构成。
关键词:羽扇豆;遗传差异;AFLP
Analysis of Genetic Difference Between Species in Lupins by AFLP
HAI Lin , XIAO Shi-he , YAN Chang-sheng , ZHANG Xiu-ying
(Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081)
Abstract:The genetic difference between species in lupins(Lupinus L.)including L .angusti fol ius L.,
L .albus L., L .pilosus Murr.was analyzed using AFLP.462 bands w ere developed from 4 primer combina-
tions based on 18 lupins varieties , and among them 442(95.7%)were polymo rphic wi th an average of 110.5
for per AFLP primer combination.The average genetic diversity index w as 0.781 in this study.The genetic dif-
ference between species w as higher than that of between varieties , the identification percentage of four AFLP
primer combinations w as 100% and 84.7%between species and betw een varieties , respectively.The results of
cluster analysis indicated that 3 species were distinct ly distinguished on the dendrogram using UPGMA method.
Key words:Lupins(Lupinus L.);Genetic difference;AFLP
收稿日期:2001-11-07
基金项目:948-971012和 973-G1998010205项目资助
作者简介:海　林(1964-),男 ,内蒙古通辽人 ,副研究员 ,主要从事作物分子标记 、分子作图研究。Tel:010-68918574;Fax:010-68975212;E-
mai l:hailin001@yahoo.com。肖世和为本文通讯作者。 Tel:010-68918574;E-mail:xiaosh@mail.caas.net.cn
　　羽扇豆 (Lupinus L.)是一个种类繁多 ,分布
极广的植物属。其野生种分布在南北美洲 ,地中海
地区和北非 ,后来被引入南非和澳大利亚。在 20世
纪有几个种已完全被驯化变成了重要的栽培作物 ,
还有一些种正在被驯化。新驯化的羽扇豆可作为新
的豆科作物 ,生长于不同的土壤和环境。从澳大利
亚引进羽扇豆 3 个种的品种 ,正在我国试种。随着
国际间资源交流和相互引种日益增多 ,品种的鉴定 、
种子质量标准化 、品种知识产权以及育种家权益的
保护 ,逐渐受到人们的重视。因此 ,开展对种质资源
遗传差异的分析研究 ,具有十分重要的现实意义 。
扩增片段长度多态性(amplified f ragment length
polymo rphism ,AFLP)具有多态性丰富 、不受环境影
响 、灵敏度高 、快速高效 、物种间通用等特点 ,已广泛
用于作物 遗传 多样性 、指纹 图谱 和品 种鉴
定[ 4 , 6 , 7 , 9 , 13] 、基因定位[ 8 ,11 , 12] 、遗传作图[ 5 ,10]等方
面的研究。本文利用 AFLP 对羽扇豆种间的遗传差
异分析 ,目的是为羽扇豆种质资源的鉴定和分类提
供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
由澳大利亚西澳大学 B.Buirchell博士提供 ,供
试材料除多毛羽扇豆(L .pi losus Murr.)为野生型
外 ,窄叶羽扇豆(L .angusti folius L.)和白羽扇豆
(L .albus L.)均为栽培型(表 1)。
中国农业科学　2002 , 35(8):911-915
Scientia Ag ricultura Sinica
表 1　供试的羽扇豆
Table 1　Lupins(Lupinus L.)used in the study
序号
No
种名
Species
品种
Varieties
叶形
Leaf form
种子形状
S eed form
种皮颜色
Seed color
1 L .angust i folius L. Tanji l 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
2 Kalya 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
3 Merrit 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
4 Quilinock 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
5 Belara 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
6 Danja 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
7 Yorrel 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
8 Tallerack 窄 , 长 Narrow , long 小 , 圆 Small , round 白 , 褐斑 White , brow n spot
9 L .albus L. FP21 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
10 Loli ta 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
11 WTD180 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
12 Minori 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
13 Ida 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
14 Vladimir 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
15 Start 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
16 Amiga 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
17 Kiev Mutant 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 白 White
18 L.pi losus Murr. 圆 Round 大 , 扁圆 Big , oblate 紫 Pu rple
1.2　方法
1.2.1　叶片 DNA 的提取　采用 Sharp (1988)提
出的 ,后经 Devos(1992)改进的酚 —氯仿方法。
1.2.2　AFLP 分析　采用 Vos(1995)的方法 ,略有
改动[ 2] 。
1.2.3　遗传多样性指数(genet ic diversity index)
用公式1-∑n
i=1Pi
2计算 ,其中 Pi为第 i个等位基
因的频率 , n为等位基因数目[ 14] 。
1.2.4　鉴别效率(identification percentage)　用引
物组合可以区别的材料占供试材料的百分数表示 。
1.2.5　聚类分析　根据 PCR扩增的结果 ,有带则
计为 1 ,无带则计为 0 ,利用简单匹配系数(simple
matching coef ficient)估计基因频率 ,依据GS =m /
(m+n)计算遗传相似系数 ,其中 m 为基因型间共
有带的数目 , n 为差异带的数目。采用 NTSYS-PC
1.8进行数据分析 ,按 UPGMA法进行聚类 。
2　结果与分析
2.1　AFLP多态性检测和遗传差异比较分析
本试验采用经筛选的 M se I 和 EcoR I 的 4组
引物 ,对 18 份供试材料(表 1)进行了 AFLP 分析 ,
其结果见表 2和图 1。4对引物组合共扩增出 462
条带 ,多态性带为 442条 ,多态性百分率为 95.7%,
平均每个引物扩增出 110.5多态性条带。其中在窄
叶羽扇豆的 8个品种和白羽扇豆的 9个品种中分别
扩增出 227 和 208 条带 ,多态性条带分别为 77 和
79 ,多态性百分率分别为 33.9%和 38.0%。在多
毛羽扇豆的 1个品种中 , 共扩增出 186条带。为了
更为充分地揭示所有供试材料的遗传差异 ,分别估
算了总的平均遗传多样性指数 ,对窄叶羽扇豆和白
羽扇豆的平均遗传多样性指数分别进行了估算(表
2),其值为 0.781 、0.654 和 0.725。结果表明 ,不同
基因型间存在着较为丰富的遗传多样性 ,其中种间
的遗传多样性明显大于种内品种间的遗传多样性。
窄叶羽扇豆和白羽扇豆之间也存在着一定的遗传差
异 。说明羽扇豆的种间进化比较明显 ,而种内品种
间遗传基础较为相似。
表 2　AFLP多态性检测和遗传差异分析
Table 2　AFLP polymorphism and analysis of g enetic difference
序号
No
引物组合
Prime r
combina tion
总带数 Total bands
L .angusti
f olius L.L .albus L.L .pilosusM urr.
合计
T otal
多态性带数 Polymorphic bands
L .angusti
folius L.L .albus L. 合计T otal
遗传多样性指数 Geneticdiversity index
L.angusti
foli us L.L.albus L. 合计To tal
1 M-AAT/E-GAG 40 47 45 97 4 19 92 0.785 0.781 0.786
2 M-A TC/ E-AAT 61 63 47 130 21 22 125 0.606 0.614 0.764
3 M-A TC/ E-AAT 69 59 51 124 32 18 119 0.570 0.720 0.749
4 M-AGA/E-GAA 57 39 43 111 20 20 106 0.655 0.783 0.824
合计 T otal 227 208 186 462 77 79 442 2.616 2.898 3.123
平均 Average 56.8 52 46.5 115.5 19.3 19.8 110.5 0.654 0.725 0.781
912　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中　国　农　业　科　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　35卷
1～ 18的品种名同表 1
No 1～ 18 vaarieties are the same as Table 1
图 1　引物组合 M-AGA/ E-GAA的 AFLP指纹图谱
F ig.1　AFLP fingerprint of lupins amplified with M-AGA/ E-
GAA
2.2　AFLP指纹图谱的特征和不同引物组合的检
测效率
根据 PCR结果分析发现 ,种间带型差异十分明
显 ,4组引物在窄叶羽扇豆 、白羽扇豆和多毛羽扇豆
分别扩增出数目不等的特异带型 , 平均为 17.5 、
17.3和 20.8 个(表 3)。这些特异带型具有种的特
异性 ,对于特定的引物组合位点是稳定的 ,因此 ,可
以根据这些带型将某个种和其它另外两个种区分
开 。4个引物组合对种的鉴别效率均为 100%,说明
4个引物组合的任何一个组合都完全可以将 3个供
试羽扇豆种区分开 。
4组引物在 18 个供试品种中检测到数目不等
的品种特异带型(表 4), 引物组合 M-AAT / E-
GAG 、M-ATC / E-AAT 、M-ATC / E-AAT 、M-AGA
/ E-GAA 分别在 3 、6 、3 、7个品种中检测到 24 、46 、
33 、36 个带型(包括缺少某一带型),可以根据这些
品种的特异带型来鉴别品种 , 4组引物品种间的鉴
别效率平均为 84.7%。除了 M-AAT / E-GAG 引
物组合的鉴别效率为 66.7%,可以将 18 个品种的
12个区分开 , 其余引物组合的鉴别效率均在 88%
以上 ,其中 M-ATC / E-AAT 引物组合的鉴别效率
最高为 94.4%, 可以将 18个品种中的 17 个区分
开 。利用这 4组引物可以将 18个品种完全区分开。
这 4组引物在窄叶羽扇豆和 白羽扇豆品种间的平
均鉴别效率分别为 87.5%和 80.6%。其中 M-ATC
/ E-AAT 、M-AGA / E-GAA 组引物在窄叶羽扇豆
内的鉴别效率均为 100%,同样的引物组合在白羽
扇豆内的鉴别效率为 88.9%和 77.8%。结果说
明 ,不同的引物组合的鉴别效率在不同的种间和品
种间存在着差异。本试验还通过用 4组引物的任一
两两引物组合鉴别 18 个品种来分析鉴别羽扇豆品
种所需最少引物组合 ,除 M-AAT / E-GAG 和 M-
ATC / E-AAT 引物组合只能区分 18个品种的 17
个外 ,其它任一两两引物组合都可将 18个品种完全
区分开 。因此可以将这些引物组合作为参考来选择
鉴别羽扇豆品种的引物组合 。
2.3　聚类分析
根据 AFLP 数据 ,按 UPMGA 方法对所有的供
试材料进行了聚类分析 ,18份材料按种的划分很明
确地聚为 3组(图 2)。第一组由窄叶羽扇豆的 8个
品种组成 ,第二组由白羽扇豆的 9 个品种组成 , 第
三组是 多毛羽扇豆的 1个品种 。第二组和第三组
的亲缘关系较近 , 而和第一组亲缘关系较远。第一
表 3　种的特异带型数目和引物组合的种间鉴别效率
Table 3　Specific bands and identification percentage of primer combination for species
序号
No
引物组合
Primer combination
种特异带数　Special bands
L.angusti folius L. L .albus L. L .p ilosus Murr.
鉴别效率
Identi fication percentage (%)
1 M-AAT/ E-GAG 17 19 18 100
2 M-ATC/ E-AAT 18 18 22 100
3 M-AAA/ E-GAG 12 21 21 100
4 M-AGA/ E-GAA 23 11 22 100
平均 Average 17.5 17.3 20.8 100
9138 期　　　　　　　　　　　　　　　海　林等:羽扇豆种间遗传差异 AFLP分析　　　　　　　　
表 4　品种的特异带型和引物组合的品种间鉴别效率
Table 4　Specific bands and identification percentage of primer combination for varieties
序号
No
引物组合
Primer
combination
品种数目
Varieties
具有某特异带数
Speci fic bands(present)
缺少某特异带数
Specif ic bands(absent)
鉴别效率
Identif icat ion percen tage(%)
L.angusti folius L. L .a lbus L. 总体 Total
1 M-AAT/ E-GAG 3 20 4 62.5 66.7 66.7
2 M-ATC/ E-AAT 6 32 14 87.5 88.9 88.9
3 M-AAA/ E-GAG 3 26 7 100 88.9 94.4
4 M-AGA / E-GAA 7 32 4 100 77.8 88.9
平均 Average 4.8 27.5 7.3 87.5 80.5 84.7
图 2　羽扇豆的 AFLP聚类图
Fig.2　Dendrogram of lupins based on AFLP
组窄叶羽扇豆的 8个品种形态上表现为叶片窄长 ,
种子粒小 、圆形 ,第二组白羽扇豆的 9个品种和第三
组多毛羽扇豆的 1个品种除种子颜色外 ,叶形和种
子形状十分相似 , 表现为叶片大而圆 ,种子粒大 、扁
圆形 。结果表明 ,利用 AFLP 对羽扇豆品种分类的
结果和形态学上的分类结果是一致的。
3　讨论
长期以来品种的鉴定是通过形态学标记诸如叶
形 、种皮颜色等形态性状以及生化标记进行的 。当
前 ,随着现代育成品种的日益增多 ,种质间的遗传基
础越来越狭窄 ,因此 ,进行种质的遗传差异分析十分
有益于品种的鉴定和分类 。单纯靠形态性状和有限
的生化位点来鉴定已远远不能满足这种现状 。由于
DNA分子标记直接反映 DNA 水平的差异 ,因此成
为一种鉴定品种的较为理想的方法而得到广泛的应
用[ 1 , 2 , 14 ,15] 。
由于AFLP 所检测的多态性是酶切位点的变化
或酶切片段间 DNA 序列的插入与缺失 ,因此具有
比其它 DNA标记更为丰富的多态性 ,甚至可以检
测到品种间 1个碱基对之间的差异 ,很容易将基因
型相近的品种区分开。Keim用 17个 RFLP 探针鉴
定 58个野生和栽培大豆种质 ,有 7个材料具有相同
的 RFLP 模式而无法分开[ 15] 。田清震在相似的研
究中 ,用 17对引物组合对 92份野生和栽培大豆种
质的 AFLP指纹图谱进行分析 ,有 4 组引物的鉴别
效率在 90%以上 ,其中 M-GGA/E-CGA的鉴别效率
为 100%[ 2] 。从以上两个研究结果比较分析证明 ,
应用 AFLP 进行种质检测的效率是非常高的 ,因此
非常适合品种的指纹分析[ 3 , 16] 。
914　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中　国　农　业　科　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　35卷
本研究用 4组引物对羽扇豆的 18 个品种进行
了AFLP 指纹图谱进行分析 , 4个引物组合的种间
平均鉴定效率为 100%,品种间的平均鉴定效率为
84.7%, 其中除 M-AAT / E-GAG 和 M-ATC/E-
AA T 的引物组合外 ,其它任何两组引物组合在一起
都可以将 18个品种分开 。在白羽扇豆 、窄叶羽扇豆
和多毛羽扇豆检测到数目不等的种间和品种间特异
带型 ,深入研究这些特异带型尤其是种间特异带型
对羽扇豆的起源进化研究会提供有益的信息 。
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