全 文 ：　第 45卷　第 3期
2006年　5月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vo l. 45　No. 3
M ay　2006 　
深圳梅林仙湖苏铁野生种群遗传多样性 ISSR分析*
王晓明 1 , 赖燕玲 1 , 徐向明 2 , 应站明 3 , 苏应娟3 , 李月波 3 , 廖文波 3
(1. 深圳市梅林公园 , 广东 深圳 518031;2. 深圳市莲花山花木园 , 广东 深圳 518026;
3. 中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘　要:仙湖苏铁 Cycas fa iry lakea D.Y.W ang是国家濒危保护植物 , 目前仅在我国广东省深圳市和曲江县发现
有自然分布 , 个体总数已不足 2 000株。本文应用 ISSR标记对深圳梅林郊野公园仙湖苏铁野生种群的遗传多样
性进行了研究。从 100个引物中筛选出 10个用于正式扩增 , 在 14个个体中共检测到 77个清晰的扩增位点 , 其
中多态性位点 67个 , 多态位点百分率为 87. 01%。根据所得数据求出的观察等位基因数为 1.870 1, 有效等位基
因数为 1. 356 8, Nei基因多样性指数为 0.219 6, Shannon多样性指数为 0. 344 5。与其他苏铁类植物和濒危植物
相比 , 仙湖苏铁仍然保持很高的遗传多样性水平。基于 Jaccard相似性系数的 UPGMA树系图表明 , 梅林郊野公
园的仙湖苏铁个体明显地分为 2个亚群 , ISSR表型特征的主成分分析 (PCA) 也支持了聚类分析结果。研究结
果对仙湖苏铁的保育和管理具有重要意义。
关键词:仙湖苏铁 Cycas fa iry lakea; ISSR标记;遗传多样性;保育措施
中图分类号:Q949.62　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2006) 03-0082-04
　　苏铁类植物是一类古老的种子植物 , 其起源可
追溯自下二叠世 , 在经历了中生代的繁荣之后 , 现
在已成为孑遗的类群 , 包含苏铁科 Cycadaceae、
S tangeriaceae及 Zam iaceae等 3科共约 240种 , 星
散分布于热带亚热带地区[ 1] 。大多数现生苏铁类
植物由于生境遭受破坏以及因为其园艺价值而被过
分采挖 , 已处于濒危的状态而面临灭绝的危险 。目
前 , 所有的苏铁类植物均被 《濒危野生动植物种
国际贸易公约》 (C ITES公约 )附录二收录 , 列为
限制贸易的物种 [ 2] 。我国仅有苏铁科苏铁属 Cycas
的野生种约 38种 , 全部处于濒危的状态 , 均被列
为国家 Ⅰ级重点保护野生植物 [ 3 - 4] 。广东省野生 2
种 , 即仙湖苏铁 Cycas fairy lakea D.Y.W ang和台湾
苏铁 C. taiwan iana Carru th. 。仙湖苏铁目前仅在广
东深圳市 (梅林水库上游 、 塘朗山长源村深秋龙
山沟)和曲江县 (罗坑镇罗坑水库上游 、 樟市镇
狮子山 )发现有野生种群分布 , 其个体数量已不
足 2 000株 , 根据国际濒危物种等级新标准 , 属于
濒危(EN)物种 , 对仙湖苏铁的保护已刻不容缓 [ 5] 。
仙湖苏铁由于其古老性和孑遗性 , 在系统发育
和进化生物学研究方面具有重要的意义。该种与台
湾苏铁较为相似 , 但羽叶最大长度较大 , 幼叶呈锈
红色 , 大孢子叶裂片的形态不同且种子成熟时为黄
褐色 [ 6] 。汪殿蓓 [ 7] 、 简曙光 [ 5] 等对野生仙湖苏铁
的群落特征进行了报道 , 但对仙湖苏铁现存种群的
遗传变异分析目前尚未见报道 。 ISSR ( inte r-simple
sequence repeats)是一种新型的分子标记 , 因其可
操作性 、 可重复性 、稳定性均优于 RAPD , 且具有
较高的多态性水平和信息容量大的优点 , 因而得到
较快发展 。目前 ISSR分子标记已广泛应用于经济
作物的品种鉴定和种质资源分析 、居群生物学及遗
传多样性的研究 [ 8] 。笔者运用 ISSR分子标记对深
圳梅林森林公园野生仙湖苏铁进行了分析 , 目的在
于揭示仙湖苏铁种群的遗传多样性水平 , 为保护和
合理利用仙湖苏铁遗传资源提供科学的依据 。
1　材料与方法
材料分别采摘分布于广东深圳市梅林森林公园
梅林后山的 14个仙湖苏铁个体的新鲜叶片 , 于
-20 ℃保存 。DNA提取采用改进的十六烷基三甲
基溴化胺 (CTAB)法 [ 9] 。测定紫外光吸收以确定
DNA浓度和纯度 , 琼脂糖凝胶电泳检查 DNA的完
整性 。引物的筛选 , 从加拿大哥伦比亚大学
(UBC)设计的 100条 ISSR引物中筛选出 10条条
带清晰 、 稳定性和 、 重复性好的引物用于全部
DNA样品的扩增 , 引物序列见表 1。
* 收稿日期:2005-09-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39800012);深圳市城管局基金资助项目
作者简介:王晓明 (1961年生), 男 , 博士 , 教授级高级工程师;通讯联系人:苏应娟;E-ma il: ls97@ zsu. edu. cn
　第 3期 王晓明等:深圳梅林仙湖苏铁野生种群遗传多样性 ISSR分析
表 1　仙湖苏铁 ISSR分析的引物及序列
Tab.1　P rim ers and their sequences for ISSR ana lysis in this study
引物编号 引物序列 5′-3′ 引物编号 引物序列 5′-3′
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC UBC844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC
UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG
UBC823 TCT CTC TCT CTC TCT CC UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A
UBC824 TCT CTC TCT CTC TCT CG UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA
UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT UBC881 GGG TGG GGT GGG GTG
数据统计与分析: ISSR是显性标记 , 同一引
物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同
源性 , 按照相同迁移位上有扩增带记为 1、 无带为
0的方法记录电泳谱带 , 仅清晰 、 可重复的并且长
度在 300 ～ 2 000 bp范围内的扩增带才被记录 。得
到的 ISSR表型数据矩阵用于进一步分析 。采用
POPG en32软件计算出观测等位基因数 、 有效等位
基因数 、 N eis基因多样性指数 (H )、 Shannon信
息多样性指数 (I) 及多态位点百分率;用 NT-
SYSpc2
[ 10] 软件进行 聚类分 析和主成 分分析
(PCA)。
2　实验结果
用 10条 ISSR引物对深圳梅林森林公园仙湖苏
铁种群 14个个体的基因组 DNA进行 ISSR分析显
示 , 每条引物产生的位点数在 1 ～ 15个位点之间 ,
10条引物共检测到 77个位点 , 平均每个引物检测
到的位点数为 7.7, 其中 67个为多态性位点 , 多
态位点所占比率为 87.01%。根据所有引物检测到
的数据求出的观察等位基因数为 1.870 1, 有效等
位基因数为 1.356 8, Neis基因多样性指数为 0.219 6,
Shannon信息多样性指数为 0.344 5 (表 2)。各引
物扩增出的条带分别估算的相应值也见表 2。
对 Jaccard相似性系数 UPGMA法进行聚类分
析的结果 (图 1)表明 , 深圳梅林森林公园的仙湖
苏铁个体明显地分为 2个亚群 , 其中个体 FJS4同
其他成员的遗传关系疏远。
图 1　基于 Jaccard相似性系数的仙湖苏铁的
UPGMA树系图
F ig.1　UPGMA tree show ing re lationships am ong
14 ind iv idua ls in Cycas fairy lakea ba sed on
Jaccard sim ila rity coeffecien ts
表 2　深圳梅林森林公园仙湖苏铁种群的遗传多样性
Tab.2　Gene tic dive rsity ofCycas fairy lakea popu la tion inM e ilin Park o f Shenzhen
引物 位点数 多态位点数 多态位点比率 观察等位基因数 有效等位基因数 N ei基因多样性指数 Shannon指数
S824 2 1 50% 1. 5000 1. 0351 0. 0328 0. 0740
S880 1 1 100% 2. 0000 1. 6209 0. 3831 0. 5712
S873 8 7 87. 50% 1. 8750 1. 1263 0. 1078 0. 2085
S844 7 6 85. 71% 1. 8571 1. 0617 0. 0556 0. 1211
S815 12 12 100% 2. 0000 1. 4786 0. 2962 0. 4567
S881 4 2 50% 1. 5000 1. 0946 0. 0795 0. 1479
S823 9 8 88. 89% 1. 8889 1. 4435 0. 2625 0. 4024
S834 15 13 86. 67% 1. 8667 1. 4157 0. 2566 0. 3966
S857 7 7 100% 2. 0000 1. 3063 0. 1911 0. 3056
S811 12 10 83. 33% 1. 8333 1. 5707 0. 3159 0. 4593
总计 77 67 87. 01% 1. 8701 1. 3568 0. 2196 0. 3445
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中山大学学报 (自然科学版) 第 45卷　
图 2是对 ISSR谱带表型进行主成分分析
(PCA)获得的三维分布图 , 显示了个体间相似性
的格局 , 支持 UPGMA聚类结果 。
图 2　基于 ISSR表型特征的主成分分析 (PCA)
F ig.2　P lo t of princ ipa l components anan ly sis (PCA)
ba sed on ISSR pheno typic charac te rs
3　分析讨论
3.1　梅林仙湖苏铁种群具有较高的遗传多样性
水平
普遍认为濒危的或分布区狭窄的物种遗传多样
性水平偏低 , 然而 , 本文通过对深圳梅林森林公园
仙湖苏铁 14个个体的 ISSR分析得到的多态位点百
分率为 87.01%, 远高于其他苏铁属植物 。与其他
苏铁类植物比较 , 也仅低于 Macrozam ia riedlei
(93.0%) (表 3)。
在深圳塘朗山 、 梅林后山在面积约 40 km2的
范围内有野生仙湖苏铁 1 000余株 , 与很多其他的
濒危植物相比 , 是一个较大的种群 , 数量众多的个
体构成了一个丰富的基因池 (gene poo ls), 这可能
是梅林郊野公园内仙湖苏铁种群内遗传多样性较高
的原因之一。
表 3　仙湖苏铁与其他苏铁类植物遗传多样性的比较 1)
Tab. 3　G ene tic variation fo rCycas fairy lakea com pared w ith o the rCycads
类群 多态位点百分率 /% Nei基因多样性指数 参考文献
Gymnosperm s 70. 9 0. 173 H am rick and Godt(1989)
Cycas fairy lakea 87. 01 0. 220 本项研究
C. debaoensis 57. 4 0. 215 X ie e t a.l (2005)
C. guizhouen sis 35. 9 0. 108 X iao e t a.l (2004)
C. pectina ta 58. 5 0. 076 Yang andM eerow (1996)
C. seemannii 50. 0 0. 138 Keppel e t a.l (2002)
C. segm entifida 70. 49 - 马永等(2005)
C. siam ensis 58. 9 0. 134 Yang andM eerow (1996)
C. taitungensis 2. 5 0. 013 L in e t a.l (2000)
D ioon edule 54. 78 0. 240 Gonzalez-A sto rga et a .l (2003)
Macrozam ia communis 50. 00 0. 045 E llstrand e t a .l (1990)
M. riedlei 93. 0 0. 274 By rne and Jam es(1991)
Zam ia pum ila 16. 7 0. 041 W a lters and Decker-W alte rs (1991)
1)部分数据转引自 X ie e t a l(2005)[ 11]
传粉生物学的研究显示 ,苏铁属的传粉动物主
要为甲虫和啮齿类动物 ,基因流的范围为 2 ～ 7 km
内 [ 12] 。深圳塘朗山的仙湖苏铁分布在面积约 40
km
2的范围之内 ,主要生长在沟谷两侧的坡地上 ,形
成了多个小种群 ,但多数小种群间的距离不超过 7
km ,因此应存在着一定强度的基因流 ,这也可能是
梅林郊野公园内仙湖苏铁种群内遗传多样性较高的
原因。当然 ,对更多不同地点的个体取样以计算仙
湖苏铁种群间的遗传分化也待开展。
3.2　对梅林仙湖苏铁保护的建议
值得注意的是尽管研究表明仙湖苏铁具有较高
的遗传变异水平 ,但 ISSR是中性的分子标记 , ISSR
位点的变异水平与影响物种现在或未来适应性的特
征位点的变异水平并不一定一致。因此 ,作为一个
狭域分布的濒危种 ,首先应该对现存所有野生的仙
湖苏铁种群进行保护。目前 ,只在广东深圳市和曲
江县发现有仙湖苏铁的自然分布 ,呈现出一种隔离
的分布模式 ,进一步取样分析两地种群的遗传分化
水平 ,对探讨仙湖苏铁的保育措施也有着很大的帮
助。深圳市共分布有仙湖苏铁 1 000余株 ,主要集
中在塘朗山一带 ,而曲江县仅存不到 30株 ,显然在
仙湖苏铁在深圳塘朗山一带保存着更多的遗传变异
性状 ,结合其较高的遗传变异水平 ,可以考虑在深圳
塘朗山(包括梅林后山在内 )建立仙湖苏铁自然保
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　第 3期 王晓明等:深圳梅林仙湖苏铁野生种群遗传多样性 ISSR分析
护区。建立自然保护区后 ,首先可以使得仙湖苏铁
的生境不再受到人为的干扰和破坏 ,同时也让各小
种群间的基因交流得以更好的进行 ,从而在整体上
保护了该物种的遗传变异水平 。
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Genetic Variation in the Endem ic P lantCycas fa irylakea (Cycadaceae)
from M eilin Forest Park in Shenzhen on the Basis of ISSR Analysis
WANG X iao-m ing1 , LAIYan-ling1 , XU X iang-m ing2 , Y ING Zhan-m ing3 , SU Y ing-juan3 ,
LI Que-bo3 , LIAO Wen-bo3
(1. M eilin Park o f Shenzhen C ity, Shenzhen 518031, China;
2. Ga rden of L ianhuaM oun tain of Shenzhen C ity, Shenzhen 518026, China;
3. Schoo l o f L ife Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China)
Abstract:Cycas fairy lakea D.Y.Wang is a rare and endangered cycad species narrow ly d istribu ted in Guangdong,
China, on ly w ith nomo re than 2000 indiv iduals. ISSR markers w ere used to assess the gene tic variations o fCycas
fairy lakea from M eilin Fo rest Park in Shenzhen. The species exh ib its a higher leve l o f gene tic d iversity compared
w ith o ther cycads and the re lative endanger p lants. Ten ISSR p rime rs detected 77 sites, ou t of wh ich 67
(87.01%) we re polymorphic loc.i Numbe r of observed alleles w as 1.8701, number o f e ffec tive a lle les w as
1.3568, Ne i s gene diversity w as 0.2196, and Shannon indexw as 0.3445. UPGMA tree based on Jaccard sim ilari-
ty coefficients exh ib ited that 14 individuals w ere c luste red in to tw o subg roups, which w as supported by a principle
components ana lysis (PCA) o f ISSR pheno typic data. O n the basis of the se resu lts, strateg ies w ere suggested for
the conse rvation andm anagement o f the species.
Key words:Cycas fa iry lakea;ISSR m arke rs;genetic diversity;strategies for conservation
85