全 文 ：收稿日期:2008-12-22;　修订日期:2009-12-20
基金项目:河北省中医药管理局基金项目(No.2006022)
作者简介:陈鹊汀(1974-),男(汉族),广东潮州人 ,现任河北大学附属医
院肿瘤外科副主任医师 ,硕士学位 ,主要从事肿瘤临床治疗与基础研究工
作.
当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响
陈鹊汀1 ,刘智勤 2 ,朱惠学3 ,王海波 1 ,李　中 1
(1.河北大学附属医院 ,河北 保定　071000;
2.河北大学药学院 ,河北省药物质量研究重点实验室 ,河北 保定　071002;
3河北省唐县人民医院　072350)
摘要:目的 观察当归补血汤对环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法 建立 S180荷瘤小
鼠模型后 , 随机分为 4组 ,荷瘤对照组 、CTX组 、当归补血汤 +CTX组及当归补血汤组 。造模次日开始给药 , 共 10 d,停药
次日处死 , 测定脾脏和胸腺指数 、腹腔巨噬细胞吞噬功能 、NK细胞活性 、T淋巴细胞增殖能力。结果 当归补血汤可提高
化疗荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数 、腹腔巨噬细胞吞噬功能和 NK细胞活性 ,同时还对刀豆素 A(ConA)诱导的 T淋巴细胞增
殖有促进作用。结论 当归补血汤具有提高机体免疫功能 , 抵御化疗所引起的免疫功能下降的作用。
关键词:当归补血汤;　肿瘤;　免疫功能;　化疗
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)01-0120-02
　　当归补血汤方出自李东垣 《内外伤辩惑论· 暑伤胃气论 》,
为气血双补之经典名方。 研究表明 , 此方具有增强免疫的效
果 [ 1] 。但有关当归补血汤对化疗荷瘤小鼠免疫系统的影响报道
较少 , 我们通过建立 S180荷瘤小鼠模型 ,观察了当归补血汤对环
磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响 ,
旨在为该方的临床应用提供一定实验依据。
1　材料与仪器
1.1　动物及细胞株 清洁级昆明小鼠 , 7 ～ 9周龄 , 雌雄各半 ,体
质量 18 ～ 22g, 由河北医科大学实验动物中心提供 ,许可证:SCXK
(冀)2003-1-003。动物在实验前适应性驯养 1周。饲料和垫
料由河北医科大学实验动物中心提供。实验期间自由采食饮水。
腹水型 S180瘤株由河北医科大学实验动物中心提供 , L929细胞株
由北京市中医研究所提供。
1.2　药品 当归补血汤由黄芪和当归组成(饮片由河北大学附
属医院中药房提供 , 所有药品均经中药专家鉴定), 将上述药物
加水浸泡 20min后 , 煎煮 3次 , 约 30min/次 , 3煎溶液混合过滤 ,
取汁 300ml,离心取上清 , 80℃水浴浓缩至每毫升含生药 1.2g,分
装 , 高温消毒后置于 4℃冰箱保存备用。化疗药物:注射用环磷
酰胺 , 江苏恒瑞医药股份有限公司(批号:06112021)。
1.3　试剂及仪器 DMSO(Amresco公司产品), 四氮甲唑蓝
(MTT, Amresco公司产品),刀豆蛋白 A(ConA, Sigma公司产品),
RPMI-1640完全培养基(Amresco公司产品)。 酶标分析仪(北
京普朗新技术有限公司产品), CO2培养箱(上海福玛实验设备
有限公司产品),超净工作台(苏净集团 , 苏州安泰空气技术有限
公司产品),倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司产品)。
2　方法
2.1　动物模型的建立 [ 2] 无菌条件下抽取 6 ～ 7 d生长良好的
S
180
小鼠的腹水 ,按 1∶3比例用生理盐水稀释 ,反复冲打 , 充分混
匀 , 在显微镜下计数 ,用生理盐水调整细胞浓度为 1.5×107 /ml,
取 0.2ml于每只小鼠右侧腋窝下碘酊消毒后皮下接种。 瘤株接
种前 , 均用 0.2%台盼蓝染色 ,计算活细胞数为 95% ～ 98%。从
抽取腹水时开始 , 到移植完最后 1只小鼠的总时间控制在 1 h
内。
2.2　分组及给药 小鼠接种 24 h后按体质量和性别随机分成荷
瘤对照组 、CTX组 、当归补血汤 +CTX组和当归补血汤组。荷瘤
对照组均用生理盐水灌胃 , 同时腹腔注射生理盐水 ,单纯化疗组
腹腔注射 CTX0.02g· kg-1· d-1 , 同时用生理盐水灌胃 ,当归补
血汤 +CTX组腹腔注射 CTX0.02 g· kg-1· d-1 , 同时用当归补
血汤 12g· kg-1· d-1(按生药量计算 , 剂量由预实验得出)灌胃 ,
当归补血汤组用当归补血汤 12 g· kg-1· d-1灌胃 , 同时腹腔注
射生理盐水 , 各组灌胃容积均为 0.4 ml/只 , 腹腔注射容积均为
0.2 ml/只 , 各组于瘤细胞接种第 2日开始用药 , 1次 /d, 连续 10
d。
2.3　脾脏 、胸腺指数 小鼠脱臼处死 , 以无菌操作取下脾脏 、胸
腺 , 电子天平称质量并计算脏器指数。
2.4　腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 [ 3] 小鼠脱臼处死 , 75%酒精
中浸泡 2 min, 置超净台。每只小鼠腹腔注射冷 PBS液 10 ml, 轻
揉腹部 2 min, 回抽腹腔液 , 离心弃上清。 RPM1 -1640培养液洗
两次 , 计数并调节细胞浓度为 2×106个 /ml, 加入 96孔培养板 ,
每孔 100 μl, 每样本均设 3个复孔。 37℃, 5%CO2培养箱培养 4
h,温 PBS液洗并吸出未贴壁细胞 , 得到巨噬细胞单层。 于每孔
中加入 0.03%的中性红溶液 100μl, 置 CO2培养箱培养 1 h, 用温
PBS液反复冲洗未被吞噬的中性红 3次。于每孔中加入细胞裂
解液(1∶1的冰醋酸和无水乙醇)100 μl, 4℃静置过夜 , 用酶标
仪在 570nm处测定 OD值。
2.5　NK细胞活性测定 [ 4] 无菌摘取脾脏 , 按常规制备脾细胞悬
液 , 用含 10%小牛血清的 RPMI-1640培养液配成 1×107 /ml浓
度作为效应细胞。取传代培养的 L929细胞 , 用 0.25%胰酶消化
液消化 2min, 加入完全 RPMI-1640培养液 , 调细胞浓度为 2 ×
105 /ml作为靶细胞 ,在 96孔平底板上每孔加入靶细胞悬液 100
μl, 37℃, 5%CO2培养 90 min, 使其贴壁成单层细胞 , 然后实验孔
加入 100 μl效应细胞悬液 , 做 4个复孔 , 靶细胞对照孔加完全
RPMI-1640培养液 100μl;然后将 96孔板放在 37℃, 5%CO2孵
箱中孵育 20 h, 去上清 ,用生理盐水轻轻注满各孔 , 反复 3次 , 以
除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞 , 在滤纸上吸干孔内水分;
每孔加入 0.1%的中性红染液 100μl,孵育 30min,弃去染液 , 用生
理盐水洗 3遍 , 每孔加 100μl细胞裂解液 , 使含有中性红的靶细
胞溶解 ,摇匀 ,用酶标仪在 450 nm测 OD值 , 用以下公式计算杀
伤率。
杀伤率(%)=(靶细胞 OD值 -实验组 OD值)/靶细胞 OD值 ×
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.1
100%
2.6　T淋巴细胞增殖能力的测定 [ 5] 无菌摘取脾脏 , 常规制作脾
细胞悬液 , 用含 10%小牛血清的 RPMI-1640培养基重悬细胞 ,
调细胞浓度至 5×106 /L, 加入 96孔细胞培养板 100μl/孔 , 再分
别加入 ConA100μl/孔使其终浓度为 6μg/ml, 将上述加好的培养
板置 37℃、5%CO2培养箱 68h,取出 , 每孔吸出 10μl, 加 0.5 g/L
MTT10 μl/孔 ,置培养箱内 4 h, 取出 ,加 10%SDS-HCl溶液 100
μl/孔 , 振荡过夜 ,酶标仪测 570 nm波长的吸光度(OD)值。以各
样本 A值代表其 T淋巴细胞增殖能力。
2.7　统计学处理 各组数据以 x±s表示 , 用 SPSS14.0进行方
差分析。
3　结果
3.1　当归补血汤对化疗小鼠免疫器官重量的影响 荷瘤小鼠在
注射 CTX后脾脏和胸腺指数均下降 , 与荷瘤对照组相比差异显
著(P﹤ 0.01), 而在联合应用当归补血汤治疗后 , 二者均增高 ,
差异显著(P﹤ 0.05或 P﹤ 0.01)。结果见表 1。
表 1　当归补血汤对化疗荷瘤小鼠免疫器官重量的影响( x±s)
g· kg-1
组别 胸腺指数 脾脏指数
荷瘤对照 3.09±0.46＊＊ 8.09±0.97＊＊
CTX 2.33±0.39 5.97±0.99
当归补血汤+CTX 2.82±0.43＊ 7.17±1.01＊
当归补血汤 3.23±0.36＊＊ 8.93±1.11＊＊
　　与 CTX组比较 , ＊P﹤ 0.05, ＊＊P﹤ 0.01;n=10
3.2　当归补血汤对化疗荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
由表 2可知 , CTX组与各组相比 , 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能降
低(P<0.01);CTX联合当归补血汤治疗后 , 小鼠巨噬细胞吞噬
功能升高 , 差异显著(P<0.05)。
表 2　当归补血汤对化疗荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响( x±s)
组别 巨噬细胞吞噬功能(OD) NK杀伤率(%) T淋巴细胞增殖(OD)
荷瘤对照 1.127±0.097＊＊ 9.98±1.92＊＊ 0.317±0.017＊
CTX 0.826±0.139 4.51±0.92 0.272±0.012
当归补血汤 +CTX 1.001±0.165＊ 9.93±1.75＊＊ 0.336±0.025＊＊
当归补血汤 1.268±0.175＊＊ 14.11±2.49＊＊ 0.367±0.026＊＊
　　与 CTX组比较 , ＊P﹤ 0.05, ＊＊P﹤ 0.01;n=10
3.3　当归补血汤对化疗荷瘤小鼠 NK细胞杀伤率和脾淋巴细胞
增殖的影响 荷瘤小鼠用 CTX化疗后 , NK细胞杀伤率和 T淋巴
细胞增殖显著降低 , 统计学差异显著(P﹤ 0.05或 P﹤ 0.01);
而联合当归补血汤治疗后二者明显升高 , 差异显著(P<0.01)。
见表 2。
4　讨论
目前除手术外 , 化学疗法是治疗肿瘤的重要手段 ,然而化疗
在杀灭肿瘤细胞的同时也抑制了机体的免疫功能 [ 6] , 脾脏和胸
腺是机体重要的免疫器官。胸腺为初级(中枢)淋巴器官 , 游走
的造血干细胞进入胸腺 ,在此分化增殖成 T淋巴细胞 , 与细胞免
疫有关。脾脏为次级淋巴器官 ,免疫活性细胞移行于此 , 并在此
进一步增殖 、分化和成熟 , 脾脏中有 T淋巴细胞 、B淋巴细胞和巨
噬细胞 ,与体液免疫 、细胞免疫均有密切关系。二者对细胞毒剂
高度敏感 ,在化疗药物作用下明显萎缩 , 其组织结构较快地发生
严重损伤 , 从而抑制了机体的免疫和抗病能力。胸腺 、脾脏指数
在一定程度地反映了机体免疫功能的强弱 ,因而可用作药物对免
疫功能影响的初步观察指标。本实验发现 , CTX化疗小鼠的胸
腺 、脾脏指数明显低于荷瘤组 , 而荷瘤小鼠用 CTX联合当归补血
汤治疗后 ,两脏器指数明显升高 , 说明当归补血汤可对抗 CTX引
起的免疫器官受损 ,保护机体免疫功能。
T淋巴细胞是体内重要的免疫活性细胞 , 主要发挥细胞免疫
功能 , 在抗肿瘤 、免疫监视等方面发挥重要作用。 T淋巴细胞在
特异性抗原或非特异性抗原 , 如 ConA等的诱导下 , 会发生转化
增殖。因此 , 常将 T淋巴细胞的增殖反应作为评价 T细胞功能 ,
反映机体免疫状况的常用指标 [ 7] 。 NK细胞是抗肿瘤的重要效
应细胞 , 它不仅可以直接杀伤肿瘤细胞 , 也可以通过产生 IL-2、
干扰素等增强其他细胞的抗肿瘤作用 [ 8] 。 本实验发现 , 荷瘤小
鼠用 CTX治疗后 , T淋巴细胞增殖能力 、NK细胞杀伤率和腹腔
巨噬细胞吞噬功能均显著降低 , 说明 CTX可抑制荷瘤小鼠的免
疫功能 ,而用当归补血汤联合 CTX治疗后 , 荷瘤小鼠以上免疫学
指标的数值均有所增加 ,与 CTX组比较差异显著 , 提示当归补血
汤可增强化疗荷瘤小鼠的免疫功能 ,恢复化疗所引起的免疫功能
低下 , 这为该方在临床的应用提供了一定实验依据。
参考文献:
[ 1 ] 　苗明三 ,方晓艳.当归补血汤粗多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影
响 [ J] .中药药理与临床 , 2003, 19(6):8.
[ 2 ] 　刘智勤 ,朱惠学 ,陈鹊汀 ,等.六君子汤对环磷酰胺的增效减毒作用
研究 [ J] .时珍国医国药 , 2008, 19(9):2150.
[ 3 ] 　贺宇彤 ,刘殿武 ,丁里玉.抗纤Ⅰ号和硒对肝纤维化大鼠免疫功能
的调节作用 [ J] .中国中医基础医学杂志 , 2004, 10(3):40.
[ 4 ] 　付　于 ,夏　天.消瘤汤治疗肿瘤及调节免疫功能的实验研究 [ J] .
中国中西医结合杂志 , 2004, 2(12):1114.
[ 5 ] 　陈　奇.中药药理研究方法学, 第 2版 [ M] .北京:人民卫生出版
社 , 2006:748.
[ 6 ] 　SakamotoJ, TeramukaiS, NakazatoH, etal.Eficacyofadjuvantimmu-
nochemotherapywithOK-432forpatientswithcurativelyresectedgas-
triccancer:ameta-analysisofcentralyrandomizedcontroledclinical
trials[J] .JImmunother, 2002, 25(5):405.
[ 7 ] 　ZhouG, ShengW, YaoW, etal.Efectoflowmolecularlambda-carra-
geenanfromChondrusocelatusonantitumorH-22 activityof5-Fu
[ J] .PharmacolRes2006, 53(2):129.
[ 8 ] 　YangL, ParkinDM, LiLD, etal.BrayFEstimationandProjectionof
thenationalProfileofcancermortalityinChina[ J] .BrJCancer, 2004,
90(11):2157.
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.1 时珍国医国药 2010年第 21卷第 1期