全 文 ：２０１４年３月 Ｖｏｌ．３２　Ｎｏ．３
Ｍａｒｃｈ　２０１４　 Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ２７８～２８３
研究论文 ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１３．１１０１０
＊通讯联系人．Ｔｅｌ：（０２１）３４２０４８３３，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈａｏｙａｎ＠ｕｎｉｍｉｃｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ（阎超）；Ｔｅｌ：（０２１）３４２０４８３３，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｙａｎ１１＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ（王彦）．
基金项目：国家自然科学基金项目（２１１７５０９２，２１１０５０６４）；国家重大科学仪器设备开发专项（２０１１ＹＱ１５００７２，２０１１ＹＱ１５００７２０４，
２０１１ＹＱ１５００７２０７，２０１１ＹＱ１５００７２１０）；上海市自然科学基金项目（１２ＺＲ１４１３６００）．
收稿日期：２０１３－１１－０５
细胞代谢组学用于羽扇豆醇干预
人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７的机理探究
史栋栋，　况媛媛，　王桂明，　彭章晓，　王　彦＊，　阎　超＊
（上海交通大学，上海２００２４０）
摘要：应用基于气相色谱－质谱联用（ＧＣ－ＭＳ）的代谢组学方法结合细胞周期实验，研究羽扇豆醇体外抑制人乳腺癌
细胞 ＭＣＦ－７增殖的作用机理。代谢组学的研究结果表明：通过正交偏最小方差判别分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）可以很好地
区分羽扇豆醇作用的 ＭＣＦ－７细胞代谢谱与对照组细胞代谢谱，模型参数为：Ｒ２　Ｙｃｕｍ＝０．９８８，Ｑ２　Ｙｃｕｍ＝０．９６４。
ＶＩＰ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）值大于１的差异代谢物进一步用ｔ检验进行单位分析，选择ｔ＜０．０５（ＶＩＰ＞１）
的代谢物作为羽扇豆醇作用组的生物标志物，得到琥珀酸、磷酸、亮氨酸、异亮氨酸等１１种代谢差异物。结合羽扇豆
醇将细胞周期抑制在Ｇ１期这一现象，推测羽扇豆醇可能是主要抑制了三羧酸循环中的琥珀酰辅酶Ａ的生成和底物
磷酸化生成ＡＴＰ的反应来抑制 ＭＣＦ－７细胞的增殖。本实验从代谢组学角度为乳腺癌抗肿瘤机制提供新的线索。
关键词：气相色谱－质谱；羽扇豆醇；ＭＣＦ－７细胞；乳腺癌；抑制机理；正交偏最小方差判别分析；细胞代谢组学；细胞周期
中图分类号：Ｏ６５８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１０００－８７１３（２０１４）０３－０２７８－０６
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｕｐｅｏｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｎ　ＭＣＦ－７
ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ
ＳＨＩ　Ｄｏｎｇｄｏｎｇ，ＫＵＡＮＧ　Ｙｕａｎｙｕａｎ，ＷＡＮＧ　Ｇｕｉｍｉｎｇ，ＰＥＮＧ　Ｚｈａｎｇｘｉａｏ，
ＷＡＮＧ　Ｙａｎ＊，ＹＡＮ　Ｃｈａｏ＊
（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｕｐｅｏｌ　ｏｎ　ＭＣＦ－
７　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ，ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｓ　ｂａｓｅｄ
ｏｎ　ｃｅｌ　ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ．Ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ　ａｓｓａｙ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｕ－
ｐｅｏｌ．Ｔｈｅｎ，ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｐａｒｔｉａｌ　ｌｅａｓｔ　ｓｑｕａｒｅｓ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＯＰＬＳ－ＤＡ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｐｒｏｃｅｓｓ
ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｄａｔａ　ａｎｄ　ｍｏｄｅｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｏｆ　ＯＰＬＳ－ＤＡ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：Ｒ２　Ｙｃｕｍ＝０．９８８，Ｑ２　Ｙｃｕｍ
＝０．９６４，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ　ｃｌｅａｒｌｙ．Ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ
（ＶＩＰ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）＞１）ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｔ－ｔｅｓｔ，ａｎｄ　ｆｉｎａｌｙ，ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ
（ｔ＜０．０５）ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｅｌｅｖｅｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｂｕｔａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ，ｐｈｏｓ－
ｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ，Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｔｏ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｅ－
ｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍａｓｓ．Ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＦＡＣＳ－
Ｃａｌｉｂｕｒ．Ｓｉｎｃｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　Ｇ１　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｌｕｐｅ－
ｏｌ，ｗｅ　ｓｐｅｃｕｌａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｌｕｐｅｏｌ　ｈａｓ　ａ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅａｃ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｓ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ
ｎｏｖｅｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｕｐｅｏｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｎ　ＭＣＦ－７　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ
ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）；ｌｕｐｅｏｌ；ＭＣＦ－７　ｃｅｌｓ；ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃ－
ｅｒ；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｐａｒｔｉａｌ　ｌｅａｓｔ　ｓｑｕａｒｅｓ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＯＰＬＳ－ＤＡ）；ｃｅｌ
ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ；ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ
　第３期 史栋栋，等：细胞代谢组学用于羽扇豆醇干预人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７的机理探究
　　代谢组学作为一种系统的研究方法，是通过考
察生物体系受刺激或扰动后（如将某个特定的基因
变异或环境变化后）其代谢产物的变化或其随时间
的变化来研究生物体系的代谢途径的一种技术［１］。
它不仅能够研究药物引起的内源性代谢物的变化，
还能够研究药物本身的代谢和动力学变化，更能直
接反映药物干预下体内生物学变化和动力学变
化［２］。通过认识生物体代谢指纹图谱变化的原因，
阐明药物的作用机理，用代谢组学方法研究所揭示
的生物化学变化很容易与传统手段的测定结果联
系，更容易评价药效作用和发现药物作用的生物化
学物质基础和作用机制［３］。代谢组中常用的分析平
台有ＧＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ和 ＮＭＲ等，其中 ＧＣ－ＭＳ优
良的定性和定量分析能力，加上其庞大的化合物谱
库为鉴定工作带来了很大的便利，使得 ＧＣ－ＭＳ在
代谢组学研究中显示出突出的优势［４，５］。
　　羽扇豆醇属于三萜类化合物，广泛存在于水果、
蔬菜和中草药等植物中［６］。大量的体外和动物实验
证明羽扇豆醇在抗炎、抗菌、抗疟疾、抗恶性肿瘤增
殖、抗血管再生等方面有很大的潜能［７］，并且已经有
实验证明羽扇豆醇对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑
色素瘤等肿瘤有明显的抗癌活性［８，９］。因此，羽扇
豆醇是具有很大潜力的天然抗肿瘤药物。
　　本课题以羽扇豆醇作用于乳腺癌细胞，基于
ＧＣ－ＭＳ联用技术发现潜在的生物代谢差异标志物，
并结合细胞周期实验结果对羽扇豆醇作用于乳腺癌
细胞 ＭＣＦ－７的机理进行深入研究，从代谢组学的角
度为羽扇豆醇的抗肿瘤机制提供新的线索。
１　实验部分
１．１　仪器与试剂
　　ＰＥＧＡＳＵＳ　４Ｄ　ＧＣ×ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ（美国ＬＥＣＯ
公司）；ＬＮＧ－Ｔ８８台式快速离心浓缩干燥器、Ｌ－３５
低温冷阱（太仓市华美生化仪器厂）；ＣＯ２ 培养箱
（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；ＸＷ－８０Ａ漩涡混合器（上海
青浦沪西仪器厂）；倒置显微镜（日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公
司）；９６孔培养板（丹麦Ｎｕｎｃ公司）；全自动酶标分
析仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；流式细胞仪ＦＡＣＳＣａｌｉ－
ｂｕｒ（美国ＢＤ公司）；
　　胎牛血清购于美国Ｇｉｂｃｏ公司，ＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ
ＧＬＵＣＯＳＥ　ＤＭＥＭ培养基、ＰＢＳ（磷酸盐）缓冲液、
胰蛋白酶均购于赛默飞世尔生物化学制品有限公司
（北京）；四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）、碘化丙啶（ＰＩ）、
ＲＮａｓｅＡ酶购于美国Ｓｉｇｍａ公司；二甲基亚砜（ＤＭ－
ＳＯ）购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇（ＨＰＬＣ
级，德国 Ｍｅｒｃｋ公司）；吡啶（分析纯）购于国药集团
化学试剂有限公司；硅烷化试剂 Ｎ，Ｏ－双三甲基硅
基三氟乙酰胺（ＢＳＴＦＡ）（含 １％ 三甲基氯硅烷
（ＴＭＣＳ））购自上海安谱科学仪器有限公司；甲氧
胺、２－氯苯丙氨酸均购自美国Ｓｉｇｍａ公司。
　　人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７购于中国科学院上海细
胞库。
１．２　ＭＴＴ实验测定羽扇豆醇对细胞增殖的影响
　　将 ＭＣＦ－７细胞培养于含１０％的胎牛血清的
ＤＭＥＭ培养液中，置于５％ＣＯ２、３７℃恒温箱中培
养，取对数生长期细胞，加入０．２５％胰蛋白酶消化
后，配成含量为４×１０４ 个细胞／ｍＬ，接种于９６孔
板，每孔接种１００μＬ（４×１０
３ 个细胞／孔）。培养１２
ｈ后添加药物羽扇豆醇，使其质量浓度梯度为１０、
２５、５０、１００、２００μｇ／ｍＬ。每组５个复孔。加完药后
置于５％ＣＯ２ 培养箱中，于３７℃恒温下继续培养。
继续培养的时间梯度为２４、４８、７２　ｈ。然后加入２０
μＬ５　ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ溶液，再继续培养４　ｈ，吸取上
清液，每孔加入１５０μＬ　ＤＭＳＯ，酶标仪测定５７０　ｎｍ
处的吸光度（Ａ），计算平均吸光度和抑制率。抑制
率＝（对照组的Ａ 值－实验组的Ａ 值）／（对照组Ａ
值－空白组Ａ 值）×１００％。
１．３　细胞提取及衍生方法
　　取一皿对数生长期的细胞，倒掉培养基，用生理
盐水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）清洗３遍以去除培养基中
复杂物质的影响。清洗完毕后，液氮猝灭以防止活
细胞在环境变化下代谢发生变化，影响代谢物的考
察。液氮猝灭后，每皿加入１　０００μＬ甲醇－水（４∶１，
ｖ／ｖ）溶液，用细胞刮刀刮下细胞置于样品瓶（玻璃）
中，在样品瓶中加入少量氯仿（体积为前述甲醇－水
溶液体积的１、５），使得细胞中的非极性成分溶在提
取液中。然后加入１０μＬ　０．３　ｍｇ／ｍＬ的２－氯苯丙
氨酸作为内标。涡漩，于４℃细胞超声破碎仪中破
碎细胞（功率２０％，破碎３　ｍｉｎ，期间开５　ｓ，关５　ｓ），
使代谢物质全部溶出，更加全面地提取代谢物。在
４℃、４　０００　ｒ／ｍｉｎ下离心１５　ｍｉｎ，去除大分子蛋白
等物质。
　　取８００μＬ上述上清液至ＧＣ进样瓶中，室温下
真空干燥，用氮气对样品进行再次干燥后，加入８０
μＬ甲氧胺（１５　ｍｇ／ｍＬ，溶剂为吡啶），混合１　ｍｉｎ，
于３０℃下反应９０　ｍｉｎ后，加入８０μＬ　ＢＳＴＦＡ和４０
μＬ正己烷，于７０℃下反应９０　ｍｉｎ。
１．４　ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ条件
　　色谱柱为 ＤＢ－５ＭＳ色谱柱（３０　ｍ×２５０μｍ×
０．２５μｍ，安捷伦科技有限公司）；进样量为１μＬ。
·９７２·
色 谱 第３２卷
进样口温度为２７０℃，程序升温：起始温度为８０℃，
保持２　ｍｉｎ，以１０℃／ｍｉｎ升至１８０℃，以５℃／ｍｉｎ
升至２４０℃，以５℃／ｍｉｎ升至２９０℃，保持９　ｍｉｎ。
接口温度为２６０℃；离子源温度为２００℃。载气为
氦气，载气流速为１　ｍＬ／ｍｉｎ。电子能量７０　ｅＶ，全
扫描方式，扫描范围为ｍ／ｚ　３０～６００，以２０张／ｓ的
速率采集ＴＯＦ质谱图。
１．５　数据统计方式
　　将 ＧＣ－ＭＳ获得的所有原始质谱数据通过
ＣｈｒｏｍａＴＯＦ软件（ｖ３．３０，Ｌｅｃｏ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）转化成
ＣＤＦ格式，然后用ＣｈｒｏｍａＴＯＦ软件对数据进行峰
识别、峰对齐、基线矫正、峰面积归一化预处理。导
入ＳＩＭＣＡ－Ｐ　１１．５软件进行多维分析。在本实验中
采用正交偏最小方差判别分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）模型区
别各组代谢物差异。结合评价 ＯＰＬＳ－ＤＡ模型质量
的３ 个关键指标 （Ｒ２　Ｘ，概括 Ｘ 矩阵结实率；
Ｒ２　Ｙｃｕｍ，反映模型的稳定性；Ｑ２　Ｙｃｕｍ反映模型的
预测性；其中Ｒ２　Ｙｃｕｍ和Ｑ２　Ｙｃｕｍ越接近１说明模
型的稳定性和预测性越好）及根据 ＯＰＬＳ－ＤＡ模型
得到的变量权重值（ＶＩＰ，ｖａｒｉａｂｌｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）找到潜在的代谢差异物（其 ＶＩＰ＞１）。
实验中采用了ｔ检验，以验证多维统计中得到的差
异物是否具有显著差异［１０］。搜索数据库为 ＮＩＳＴ
数据库。
１．６　羽扇豆醇对 ＭＣＦ－７细胞周期的影响
　　为了进一步确认羽扇豆醇对 ＭＣＦ－７细胞的抑
制作用，并且为全面阐述羽扇豆醇抑制 ＭＣＦ－７细胞
的作用机理，本实验进行了细胞周期实验。
　　取一皿对数生长期的细胞，接种于６孔板中，使
得每孔有３×１０５ 个细胞。培养１２　ｈ后，分别加入
２５μｇ／ｍＬ和５０μｇ／ｍＬ羽扇豆醇，作用２４　ｈ。２４　ｈ
后，加入胰蛋白酶消化细胞至细胞可以用移液管或
枪头轻轻吹打下来时，轻轻吹散细胞，将其收集到离
心管内。于约１　０００　ｇ离心力下离心３～５　ｍｉｎ，沉
淀细胞。小心吸除上清液，残留约５０μＬ左右的培
养液以避免吸走细胞。加入约１　ｍＬ预冷的ＰＢＳ缓
冲液，重悬细胞，并转移到１．５　ｍＬ离心管内。再次
离心沉淀细胞，小心吸除上清液，残留约５０μＬ左右
的ＰＢＳ缓冲液以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管
以适当分散细胞以避免细胞成团。
　　细胞固定：加入１　ｍＬ预冷至４℃的７０％（ｖ／ｖ）
乙醇水溶液，轻轻吹打混匀。固定１２　ｈ后于１　０００
ｇ左右离心力下离心３～５　ｍｉｎ，沉淀细胞。小心吸
除上清液，残留约５０μＬ左右的７０％乙醇，以避免
吸走细胞。加入约１　ｍＬ预冷的ＰＢＳ缓冲液，重悬
细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清液，轻轻弹
击离心管以适当分散细胞，避免细胞成团。
　　染色后进行流式细胞检测和分析。
２　结果与讨论
２．１　羽扇豆醇对乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７的抑制作用
　　图１为５个浓度梯度的羽扇豆醇和３个作用时
间对乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７增殖的影响。由图１可以
明显地看出，在羽扇豆醇作用时间为２４　ｈ，作用浓
度为１０和２５μｇ／ｍＬ时，抑制率低于１０％，对ＭＣＦ－
７细胞没有明显的抑制作用。而当羽扇豆醇的浓度
增加到５０μｇ／ｍＬ以上时，抑制率明显上升，均在
７０％以上，并且５０、１００和２００μｇ／ｍＬ羽扇豆醇的
抑制作用没有明显的差异。当作用时间增加到４８
和７２　ｈ时，抑制作用更加明显，且高浓度的抑制效
果好于低浓度。实验结果说明，羽扇豆醇对乳腺癌
细胞 ＭＣＦ－７的抑制作用不仅有时间依赖性，也具有
浓度依赖性。与文献［１１，１２］报道的羽扇豆醇对乳腺
癌细胞有抑制作用的研究结果一致。
图１　羽扇豆醇浓度及作用时间对 ＭＣＦ－７细胞增殖的影响
Ｆｉｇ．１　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｕｐｅｏｌ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｌｓ
２．２　基于ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ技术的细胞代谢组学分析
　　ＭＴＴ实验结果显示，当羽扇豆醇的作用浓度
高于２５μｇ／ｍＬ时，对 ＭＣＦ－７细胞的抑制率基本都
在７０％以上。由于细胞代谢组学使用的代谢物均
为活细胞的代谢物，因此选择羽扇豆醇作用浓度和
作用时间时不仅要考虑其对 ＭＣＦ－７细胞的抑制作
用，还要考虑保持 ＭＣＦ－７细胞的低致死率，因此最
终选择羽扇豆醇的作用浓度和作用时间分别为１０
μｇ／ｍＬ和２４　ｈ。以前述甲醇－水混合液与三氯甲烷
的５∶１（ｖ／ｖ）混合液为提取液，液液萃取提取细胞代
谢物，经硅烷衍生化后利用 ＧＣ－ＭＳ技术分析细胞
代谢物。图２为其中典型的 ＭＣＦ－７细胞对照组和
羽扇豆醇２４　ｈ作用组的ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ代谢物谱图，
·０８２·
　第３期 史栋栋，等：细胞代谢组学用于羽扇豆醇干预人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７的机理探究
在Ｓ／Ｎ＝１０时，ＭＣＦ－７细胞的代谢谱图的分子特 征峰个数在５００～６００之间。
图２　ＭＣＦ－７细胞对照组和１０μｇ／ｍＬ羽扇豆醇作用２４　ｈ干预组代谢物的ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ基峰色谱图
Ｆｉｇ．２　Ｔｙｐｉｃａｌ　ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ　ｂａｓｅ　ｐｅａｋ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ１０μｇ／ｍＬ　ｌｕｐｅｏｌ　ｔｒｅａｔｅｄ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　２４　ｈ
表１　ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ分析人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７对照组与
羽扇豆醇２４　ｈ作用组代谢差异物的鉴定结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　ＭＣＦ－７
ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｌｕｐｅｏｌ　２４　ｈ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ａｓ
ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ
ｉｎ　ｃｅｌｓ
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ／ｍｉｎ
ＶＩＰ
ｖａｌｕｅａ）
Ｆｃｂ） ｐ
ｖａｌｕｅｃ）
Ｌ－Ａｌａｎｉｎｅ　 ７．５２６９　 ４．５０ －１．２５　 １．２７×１０－３
Ｌ－Ｌｅｕｃｉｎｅ　 ９．６１１１　 ３．４５　 １．５９　 ７．４９×１０－３
ＤＬ－Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　 ９．８９１２　 ２．１７　 １．６５　 ６．６１×１０－３
Ｇｌｙｃｉｎｅ　 １０．０９０９　 ８．４２　 ２．９９　 ９．９７×１０－５
Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ　 １２．２８８７　 １．３２ －１．２７　 ０．０４
Ｌ－Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　 １２．７６７１　 ２．８９ －３．３７　 １．５５×１０－６
Ｌ－Ｐｒｏｌｉｎｅ　 １２．８７５３　 ６．１４ －３．４１　 １．４８×１０－３
Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　 １３．７９１９　 １．２５ ＋∞ ４．２９×１０－６
Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　 １６．６３７３　 ４．４９　 ６．２９　 ５．５５×１０－５
Ｄ－Ｍａｎｎｏｓｅ　 １８．１７６５　 ３．１８ －∞ ８．０１×１０－４
Ｒｉｂｉｔｏｌ　 ２０．４４５１　 １．３２ －１．６０　 ５．４９×１０－３
　ａ）ＶＩＰ　ｖａｌｕｅｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ
ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｉｎｇ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ＶＩＰ　ｖａｌｕｅｓ　ａｒｅ　ｍｏｒｅ
ｉｎｆｌｕｅｎｔｉａｌ．
ｂ）Ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ（Ｆｃ）ｉｓ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｍｅａｓｕｒｅｄ
ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｕｐｅｏｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｔｏ　ｔｈａｔ
ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ　ｉｎｄｉ－
ｃａｔｅｓ　ａ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｌｕｐｅｏｌ　ｔｒｅａｔｅｄ
ｇｒｏｕｐ　ｗｈｉｌｅ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ　ｍｅａｎｓ　ａ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎ　ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．
ｃ）ｐ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ．ｐ＜０．０５　ｍｅａｎｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉ－
ｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．
　　羽扇豆醇分别作用于 ＭＣＦ－７细胞６、１２和２４　ｈ
后，在上述优化的色谱条件下，分别对细胞样品进行
分析，采集 ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ数据并进行多维统计处
理。
　　考虑到干扰因素的复杂性，为了消除非药物作
用的影响，最大化组间分离，并寻找各组间的差异代
谢物，利用有监督的 ＯＰＬＳ－ＤＡ方法去除与样品分
类无关的信息，对不同时间点样本的细胞代谢全谱
进行分析。图３显示的是 ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ细胞代谢
物全谱数据的 ＯＰＬＳ－ＤＡ得分图，该模型包含４个
主成分，Ｒ２　Ｙｃｕｍ＝０．９８８，Ｑ２　Ｙｃｕｍ＝０．９６４，说明
模型的稳定性和预测率较高；且得分图显示对照组
与给药组样本能明显区分，作用２４　ｈ的差异物区别
最大。
图３　人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７代谢物的ＯＰＬＳ－ＤＡ分类图
Ｆｉｇ．３　ＯＰＬＳ－ＤＡ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ
ＭＣＦ－７　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ
　　ＶＩＰ值是ＯＰＬＳ－ＤＡ有监督性分析方法中评价
变量贡献的最常用方法，根据ＶＩＰ＞１．０和ｐ值＜
０．０５（ｔ－ｔｅｓｔ），通过 ＮＩＳＴ和标准库，对一些具有显
著性差异的物质进行了初步的结构鉴别。本实验单
独将差异性最大的对照组和羽扇豆醇２４　ｈ作用组
两组进行ＯＰＬＳ－ＤＡ模型分析，获得了１１种细胞代
谢差异物（见表１）。
　　在肿瘤细胞代谢物中，丙氨酸、天冬氨酸、脯氨
酸、琥珀酸、甘露糖和核糖醇的含量下降。亮氨酸、
异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和磷酸的含量上升。琥
珀酸的含量下降、磷酸的含量上升可能是羽扇豆醇
破坏了 ＭＣＦ－７细胞能量代谢途径三羧酸循环造成
的［１３］。亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺均可以
通过转氨作用脱掉α－氨基生成有机酸类物质，再通
·１８２·
色 谱 第３２卷
过分解代谢作用而生成三羧酸循环的底物，作为能
量的来源［１４］。也有可能是三羧酸循环受到了抑制。
丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸的含量下降，可能是因为
药物抑制了 ＭＣＦ－７细胞的氨基酸代谢［１５］。
２．３　细胞周期分析
　　基于代谢组学数据，为了进一步研究羽扇豆醇
作用于 ＭＣＦ－７细胞后的作用机制，我们考察了羽扇
豆醇对 ＭＣＦ－７细胞周期的影响。在这个实验中，羽
扇豆醇作用时间为２４　ｈ，作用浓度为２５μｇ／ｍＬ和
５０μｇ／ｍＬ。结果见图４和表２。首先溶剂对于细胞
几乎没有影响。在排除溶剂影响的前提下，羽扇豆
醇主要将细胞抑制在细胞周期的Ｇ１期（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。
羽扇豆醇作用浓度为２５μｇ／ｍＬ和５０μｇ／ｍＬ时，
Ｇ１期细胞所占比例从５０．９２％分别增长到６１．６９％
和６３．６１％。同时Ｓ期的细胞数量显著下降，推测
可能是由于羽扇豆醇抑制了 ＭＣＦ－７细胞中蛋白质
和能量的合成，从而使得停留在 Ｇ１期的细胞数量
上升，Ｓ期的数量下降［１６］。
图４　羽扇豆醇作用于 ＭＣＦ－７细胞２４　ｈ的细胞周期图
Ｆｉｇ．４　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｌｕｐｅｏｌ　ｔｒｅａｔｅｄ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　２４　ｈ，
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＦＣＭ （ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｈａｓｅ　ｉｎ　ａｌｌ　ｃｅｌｌｓ
ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ；ｂ．ｓｏｌｖｅｎｔ（ｍｅｔｈａｎｏｌ／ＤＭＥＭ（１／６０，ｖ／ｖ））；ｃ．ｌｕｐｅｏｌ（２５μｇ／ｍＬ）；ｄ．ｌｕｐｅｏｌ（５０μｇ／ｍＬ）．
２．４　代谢差异物及作用机理推测
　　Ｇ１期细胞内进行着一系列极为复杂的生物合
成变化，如合成各种核糖核酸（ＲＮＡ）及核蛋白体，
这些物质的形成导致结构蛋白和酶蛋白的形成，为
Ｓ期ＤＮＡ的复制准备物质和能量［１７］。羽扇豆醇将
细胞阻滞在Ｇ１期，所以推测羽扇豆醇的作用机理
可能与能量和蛋白质的合成有关。
　　琥珀酸是三羧酸循环的中间代谢产物［１８］，它的
含量下降，磷酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰
胺的含量上升，均可能是因为三羧酸循环受到了抑
制。三羧酸循环是机体获得能量的主要方式，是机
体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式。
在琥珀酸硫激酶（ｓｕｃｃｉｎａｔｅｔｈｉｏｋｉｎａｓｅ）的作用下，琥
珀酰－ＣｏＡ的硫酯键水解，释放的自由能用于合成三
磷酸鸟苷（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＧＴＰ），再生成
ＡＴＰ，作为能量的来源。羽扇豆醇可能抑制了琥珀
·２８２·
　第３期 史栋栋，等：细胞代谢组学用于羽扇豆醇干预人乳腺癌细胞 ＭＣＦ－７的机理探究
酸硫激酶的活性而使得底物磷酸化的反应受到抑
制，磷酸的含量上升。而琥珀酸脱氢酶的活性受到
抑制后，琥珀酸的含量下降。
　　综合分析，羽扇豆醇主要抑制了细胞中的能量
代谢途径三羧酸循环，使得细胞在 Ｇ１期不能够充
分地准备Ｓ期进行 ＤＮＡ复制所需要的能量和物
质，从而使得Ｇ１期细胞数量大量上升，Ｓ期细胞数
量急剧下降。
３　结论
　　本文以 ＧＣ－ＭＳ技术为平台，通过多元统计分
析等手段探索了羽扇豆醇作用于 ＭＣＦ－７细胞后细
胞代谢物的变化，结果表明加药组和未加药组存在
显著的差异。对具有显著性差异的物质进行分析，
得到了Ｌ－丙氨酸、磷酸等１１种代谢差异物。并结
合羽扇豆醇将 ＭＣＦ－７细胞抑制在 Ｇ１期的细胞周
期实验结果，推测羽扇豆醇主要通过抑制三羧酸循
环代谢途径中琥珀酰辅酶Ａ的生成和底物磷酸化
生成ＡＴＰ的反应来抑制 ＭＣＦ－７细胞的增殖。
　　本研究利用代谢组学的方法研究中药活性物质
作用于细胞的生物化学变化，并且与传统手段的测
定结果相联系，为药物的机理研究提供了一种新的
有效平台。
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