全 文 ：第 31卷　第 4期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 31 No. 4
2003年 8月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Aug. 2003
缺磷白羽扇豆根系分泌物收集方法的比较研究
田中民1 ,秦芳玲 2 ,王　波 1
( 1西安交通大学生命科学与技术学院 ,陕西 西安 710049; 2西安石油大学 化学化工系 ,陕西西安 710065)
　　 [摘　要 ]　用高效液相色谱法研究了根系分泌物原位收集法和溶液培养收集法在分析缺磷白羽扇豆 (Lupi -
nus albus L. )幼苗根系分泌有机酸时的优劣性 ,同时分析了相应根组织、木质部伤流液和韧皮部汁液中有机酸的
种类和数量。结果表明: 2种收集方法所获得的有机酸种类和数量并不完全相同。原位收集法能获得白羽扇豆不同
根段分泌有机酸的状况 ,即排根主要分泌苹果酸、柠檬酸和反丁烯二酸 ,根尖主要分泌苹果酸、乳酸、反丁烯二酸 ,
且所反映的有机酸分泌状况与相应根组织以及木质部伤流液中有机酸的种类和变化趋势基本一致。溶液培养收集
法可获得白羽扇豆整个根系分泌有机酸的状况 ,在其根系收集液中含有酒石酸、苹果酸、乳酸、顺丁烯二酸、柠檬
酸、反丁烯二酸 ,但该方法在根系分泌物的收集过程中不可避免地引入了去离子水对根系的胁迫作用 ,增加了微生
物的污染环节。
[关键词 ]　白羽扇豆 ;有机酸 ;原位收集法 ;溶液培养收集法 ;高效液相色谱
[中图分类号 ]　 S643. 01　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2003) 04-0154-05
　　由于根际是一个复杂的微生态环境 ,根系分泌
物种类繁多 ,数量差异大 ,既有简单的被动泄漏又有
主动的分泌过程 ,再加上根系微生物和土壤溶液的
作用影响 ,所以给根系分泌物的研究带来了极大困
难。对根系分泌物的研究已有 100多年的历史 ,微量
有机物质的提取、分离和鉴定技术已取得了较大的
进展 ,但要获得植物根系分泌物的真实情况依然十
分困难。 Ma等 [1 ]和 Shen [2 ]用收集根洗液的方法分
析根系分泌物 ,该法能反映整个根系的分泌状况 ,但
不能反映根系具体部位的分泌特征 ,所获得的分泌
物成分复杂 ,不便于比较研究。 Tang [3 ]应用吸附树
脂膜的方法研究根系分泌物中的化感物质 ,但此方
法不适于从土培试验中提取根系分泌物 ,也不适于
根系分泌物的定位分析。本试验以白羽扇豆为材料 ,
在液体培养条件下分别采用溶液培养收集法和滤纸
片原位收集法获取白羽扇豆根系分泌物 ,同时收集
其相应根组织及茎伤流液 ,通过用高效液相色谱法
分析根系分泌物、相应根组织及茎伤流液中有机酸
的种类和数量 ,以确定白羽扇豆根系分泌有机酸的
真实状况 ,并对 2种收集方法在根系分泌物研究中
的优劣性予以比较。
1　材料与方法
1. 1　材料培养
　　挑选大小一致的白羽扇豆 ( Lupinus albus L.
cv. Amiga, Suedw estdeutsche Saatzucht , Rasta t,
Germany )种子 ,在体积分数 10% H2O2中浸泡 30
min进行表面消毒 ,而后用清水洗净 ,置于用饱和
CaSO4溶液浸泡过的纱布上催芽。待种子露白后 ,播
入用 CaSO4溶液浸泡过的石英砂中。等到两片子叶
完全展开后 ,移入通气的营养液中。幼苗分缺磷处理
和供磷对照 2组。在缺磷处理的第 17天进行根系分
泌物的收集。
幼苗在人工培养室中生长 ,营养液 pH为 6. 2,
每 3 d更换 1次 ,生长期间维持温度 18～ 26℃ ,光
照时间为 14 h /d,光照强度为 18 000～ 21 000 lx。营
养液组成参见文献 [4 ]。
1. 2　白羽扇豆根系分泌物的收集及根组织中有机
酸的提取
1. 2. 1　原位收集法　在白羽扇豆缺磷培养的第 17
天 ,分别用滤纸片原位收集法收集根尖和排根组织
分泌的有机酸 ,同时切取相应的根尖 ( 1 cm )和排根
组织 ( 0. 5 cm)各 0. 1 g在液氮中保存。根尖和根组
织样品在测定前加 1 mL 50 mL /L磷酸溶液匀浆 ,
12 000 r /min离心 10 min,取上清液 ,稀释 10倍后
分析有机酸的种类和数量。
原位收集法 [5 ]具体操作程序: 准备直径为 5 mm
的层析滤纸片若干 ,用甲醇清洗 3次 ,再用重蒸水清
洗 3次 ,在无菌条件下晾干备用。收集时从缺磷处理
[收稿日期 ]　 2003-01-07
[作者简介 ]　田中民 ( 1967- ) ,男 ,陕西合阳人 ,讲师 ,博士 ,主要从事植物生理生化研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2003. 04. 041
和供磷对照中各挑选 5株生长一致的幼苗 ,先将植
物根系在去离子水中清洗数次 ,以除去表面的营养
液 ,然后将根系平放于铺有湿滤纸的瓷盘中 ,在每个
植株上选取生长相近的 5个二级侧根的根尖和排根
为收集部位 ,在有机酸收集部位 (根尖、排根组织 )的
下方垫上 2 cm× 2 cm的塑料胶片 ,然后再在收集部
位根组织的上下方各放 1个预先处理好的层析滤纸
片。其余根段用营养液浸湿的滤纸片覆盖。最后用
黑塑料布将整个根系罩住 ,在光照下收集 2 h。收集
完后 ,将每个植株不同部位的滤纸片放入 2. 5 mL
Ependo rf管中 ,每 10个滤纸片加 300μL重蒸水放
入液氮中保存。测定前将其溶解 , 12 000 r /min离心
10 min,取上清液用以 HPLC分析。
1. 2. 2　溶液培养收集法　白羽扇豆在缺磷条件下
培养到第 17天时 ,用收集根洗液的方法收集根系分
泌物。 以盆为单位 ( 5株 /盆 ) ,首先将植株根系在去
离子水中漂洗数次 ,然后将植株放入盛有 500 mL
蒸馏水 (加少量的微生物抑制剂 )的小盆中 ,所选器
皿和 500 m L蒸馏水可以使水能够浸没整个根系 ,
植株在光照下收集 2 h。收集完后 ,将收集液在旋转
蒸发仪上浓缩至干。浓缩温度 30℃。然后用 10 mL
蒸馏水分 3次冲洗 ,每冲洗 1次 ,用超声波振荡使其
充分溶解 ,从而得到浓缩的根系分泌物收集液。浓缩
液在 12 000 r /min冷冻离心 10 min,取上清液用以
分析有机酸的种类和数量。
1. 3　白羽扇豆木质部和韧皮部汁液的收集
白羽扇豆在缺磷条件下培养到第 17天时 ,收集
木质部伤流液及韧皮部汁液。木质部伤流液的收集
采用薛应龙 [6 ]的方法 ,在早晨 8: 00～ 10: 00收集 2
h。韧皮部汁液收集采用 King等 [ 7]的方法。 木质部
伤流液和韧皮部汁液在 HPLC测定前均稀释 10
倍。
1. 4　有机酸的 HPLC分析
有机酸分离条件见文献 [8]。有机酸标准样品的
配制:分别称取草酸 5. 0 mg ,苹果酸 10. 0 mg ,乳酸
0. 01 mL,乙酸 0. 02 mL,柠檬酸 10. 0 mg ,丁二酸
20. 0 mg ,反丁烯二酸 1. 0 mg ,顺丁烯二酸 1. 0 mg ,
用 pH 2. 25的 H3 PO4-KH2 PO4缓冲溶液溶解于 100
m L的容量瓶中。取各自的母液进行混合 ,反丁烯二
酸和顺丁烯二酸稀释 100倍 ,其余各酸均稀释 10倍
作为有机酸标准溶液。在每次样品测定前 ,均用此溶
液作标准曲线。 每测定 10个样品加测 1次标准样
品。对于不易确定的有机酸吸收峰 ,用以上单个标准
样品做内标法鉴定 ,或用改变流动相 pH值和流速
的方法进一步确认。
2　结果与分析
2. 1　溶液培养收集法收集的白羽扇豆根系分泌有
机酸的种类和数量
用溶液培养收集法收集白羽扇豆根系分泌有机
酸的结果表明: 白羽扇豆根系分泌的有机酸主要为
酒石酸、苹果酸、乳酸、顺丁烯二酸、柠檬酸和反丁烯
二酸。缺磷处理白羽扇豆的根系除分泌以上几种有
机酸外 ,还分泌丁二酸。 从分泌量来看 ,缺磷处理白
羽扇豆根系分泌物中乳酸和柠檬酸的量均高于供磷
对照 (图 1)。
图 1　溶液培养收集法收集的白羽扇豆
全根系分泌有机酸的种类和数量
A.有机酸标准样品 ; B.缺磷培养 ; C.供磷培养 ;
1.草酸 ; 2.酒石酸 ; 3.苹果酸 ; 4.乳酸 ; 5.乙酸 ;
6.顺丁烯二酸 ; 7.柠檬酸 ; 8.丁二酸 ; 9.反丁烯二酸
Fig . 1　 The kinds and quantities of o rg anic
acids exuded from the who le roo t system af ter
the white lupine had been str essed by pho spho rus
deficiency fo r 17 days
A. The s tandard sample; B. Th e sample w i thou t P
su pplied; C. Th e sample w i th P supplied
1. Oxalic acid; 2. Tartaric acid; 3. Malic acid;
4. Lactic acid; 5. Acet ic acid; 6. Maleic acid;
7. Ci t ric acid; 8. Succinic acid; 9. Fumaric acid
155第 4期 田中民等: 缺磷白羽扇豆根系分泌物收集方法的比较研究
2. 2　原位收集法收集的白羽扇豆根尖和排根分泌
有机酸的种类和数量
用原位收集法分别收集白羽扇豆根尖和排根区
分泌的有机酸 ,其分析结果 (图 2)表明:缺磷处理白
羽扇豆的排根主要分泌柠檬酸、苹果酸和反丁烯二
酸 ,且柠檬酸和反丁烯二酸的分泌量明显高于对应
供磷植株排根的分泌量。 缺磷处理白羽扇豆的根尖
主要分泌苹果酸、乳酸、反丁烯二酸 ,且分泌量均明
显高于对应供磷植株根尖相应有机酸的分泌量。
图 2　原位收集法收集的白羽扇豆
根尖和排根分泌有机酸的种类和数量
A.缺磷排根 ; B.供磷排根 ; C.缺磷根尖 ; D.供磷根尖
3.苹果酸 ; 4.乳酸 ; 7.柠檬酸 ; 9.反丁烯二酸
Fig. 2　 The kinds and quantities o f o rganic
a cids exuded from the ro o t tips and the segm ents
of pro teoid ro ots afte r the white lupine had been
stressed by pho sphorus deficiency fo r 17 days
A. Th e proteoid roots w ithou t P supplied;
B. The proteoid roo ts w ith P supplied;
C. The root tips wi thou t P supplied;
D. Th e root tips w ith P supplied
3. Malic acid; 4. Lactic acid;
7. Ci t ric acid; 9. Fumaric acid
图 3　白羽扇豆培养 17 d时根系不同组织中
有机酸的种类和数量
A.缺磷排根 ; B.供磷排根 ; C.缺磷根尖 ; D.供磷根尖
3.苹果酸 ; 4.乳酸 ; 7.柠檬酸 ; 9.反丁烯二酸
Fig . 3　 The kinds and quantities of o rg anic acids
in the ro o t sy stem of the w hite lupine in
deficient phosphorus culture fo r 17 days
A. Th e proteoid roots w i thou t P supplied;
B. Th e proteoid roots w ith P supplied;
C. Th e root tips wi th out P supplied;
D. The root tips w i th P supplied
3. Malic acid; 4. Lactic acid;
7. Ci t ric acid; 9. Fumaric acid
　
　
2. 3　白羽扇豆根尖和排根组织中有机酸的种类和
数量
对白羽扇豆根组织中有机酸的分析结果 (图 3)
表明 ,排根组织中的有机酸主要为乳酸、苹果酸、柠
檬酸和反丁烯二酸 ,且缺磷处理的白羽扇豆排根组
织中苹果酸和柠檬酸的含量均高于供磷处理。 白羽
扇豆根尖和排根中有机酸种类基本相同 ,但缺磷处
理白羽扇豆根尖的苹果酸和反丁烯二酸的含量均高
于其供磷对照。
2. 4　白羽扇豆木质部伤流液及韧皮部汁液中有机
酸的种类和数量
在缺磷处理到第 17天时 ,白羽扇豆木质部伤流
液中含有大量的苹果酸、柠檬酸和反丁烯二酸 ,且其
含量均明显高于供磷处理。白羽扇豆韧皮部汁液中
共检测出 6种未知物 ,但除苹果酸外 ,其余 5种均为
未知 (图 4)。
156 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 31卷
图 4　白羽扇豆韧皮部汁液和木质部
伤流液中有机酸的种类和数量
A.缺磷韧皮部汁液 ; B.供磷韧皮部汁液 ;
C.缺磷木质部汁液 ; D.供磷木质部汁液
3.苹果酸 ; 7.柠檬酸 ; 9.反丁烯二酸
Fig. 4　 The kinds and quantities o f o rganic acids
in w hite lupine xy lem exuda tes and ph lo em sap
A. Th e phloem sap wi thou t P supplied;
B. Th e phloem sap w i th P supplied;
C. The x ylem exudates w ithout P supplied;
D. The xylem ex udates wi th P supplied
3. Malic acid; 7. Ci t ric acid; 9. Fumaric acid
3　讨　论
本研究结果表明 ,用原位收集法和溶液培养收
集法所收集的缺磷白羽扇豆根系所分泌的有机酸种
类差别很大。 用溶液培养收集法所收集的有机酸主
要为乳酸、顺丁烯二酸、柠檬酸和丁二酸 ,而用原位
收集法所收集的白羽扇豆根尖、排根分泌的有机酸
则以苹果酸、柠檬酸和反丁烯二酸为主。就根系分泌
物中有机酸的来源讲 ,根外分泌的有机酸主要来自
根细胞内三羧酸循环中形成的有机酸。 Keith等 [9 ]
证明 ,光合作用所固定的碳 0. 1%～ 10%在 24 h内
以根系分泌物的形式释放到根际。 Prikry l等 [10 ]认
为 ,小麦根系分泌物的释放和根的生长状况密切相
关 ,一旦根系停止生长 ,几乎没有根系分泌物的产
生。 根系分泌物量的多少还与植物的代谢强弱密切
相关 ,白天光合作用强 ,代谢旺盛 ,根系分泌物的量
也多。因此 ,根系分泌物中的有机酸也应该能在相应
的根组织细胞中检测到。本研究结果表明 ,在白羽扇
豆的排根组织和根尖细胞中含有苹果酸、柠檬酸、乳
酸和反丁烯二酸 ,不含有酒石酸、顺丁烯二酸和丁二
酸。由此可见 ,用原位收集法收集的有机酸种类与根
组织中的有机酸基本相同。另外 ,由于植物根系在向
根外分泌有机酸的同时 ,根组织中的部分有机酸会
随蒸腾进入木质部。所以 ,根系分泌的有机酸种类应
与木质部伤流液中有机酸的种类相一致。本试验中
白羽扇豆木质部伤流液中有机酸为苹果酸、柠檬酸
和反丁烯二酸 ,与原位收集法收集的有机酸种类相
一致。以上两个方面说明原位收集法能准确反映白
羽扇豆不同根段分泌有机酸的真实情况 ,即缺磷条
件下白羽扇豆根系分泌的有机酸为苹果酸、柠檬酸
和反丁烯二酸。
从溶液培养收集法的整个收集过程来看 ,具有
操作简单方便 ,能反映整个根系有机酸的变化状况
等优点。不足之处在于不能作局部取样分析 ,收集时
间较长 ,影响有机酸成分的环节较多 ,在浓缩过程中
大分子质量的有机酸可能分解 ,小分子质量的有机
酸可能挥发。另外 ,收集时间长使微生物的分解作用
增强。而原位收集法则可以作局部收集 ,收集时间
短 ,污染环节少。因此 ,从有机酸的分析结果来看 ,原
位收集法的分析结果更接近于根系分泌的真实情
况 ,不足之处在于扰动了根系原有的生长状态。
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Comparativ e studies on methods of co llecting ro ot
exudates from phosphorus deficient white lupin
TIAN Zhong-min
1 ,QIN Fang-ling
2 ,WANG Bo
1
( 1 School of Li fe Science and Technology ,Xian Jiaotong Universit y ,Xian, Shaanx i 710049,China;
2 Department of Chemistry and Chem ical Engineering,Xian Shiyou University ,X ian, Shaanxi 710065,China)
Abstract: The advantag es of di fferent roo t exudates col lecting methods were investiga ted via analy sis
o f HPLC. The seedling s of w hi te lupin w ere cul tured in the pho spho rus deficient nutrient solution and the
o rganic acids in the co rresponding roo t tissue w ere also investiga ted w hen root exudates w ere collected in
o rder to determine the real kinds and quantities o f o rg anic acids in the root exudates. The results showed
the kinds and quanti ties of o rganic acids collected by the tw o methods w ere no t identical. The methods of
lo calized col lection of roo t exuda tion can acquire the real kinds and quantities o f o rganic acids excreted f rom
the ro ot and can determine th e real si te w here the org anic acids w ere excreted. The o rg anic acids excreted
f rom the pro teoid w ere malic acid, ci t ric acid and fumaric acid, and the roo t tips excreted malic acid, lactic
acid and fumaric acid. The kinds and tendency o f o rganic acids in the roo t exuda tes accord wi th tho se in the
xylem exudation and co rresponding roo t tissues. The method o f bathing roo t system is advantag eous to de-
termine the to tal quanti ties of o rganic acids, w hich include tar taric acid, malic acid, lactic acid, maleic acid,
ci t ric acid, succinic acid, fuma ric acid, but it can not av oid the stress o f collecting solution and rhizosphere
micro-o rganism po llution.
Key words: Lupinus albus L. ; o rganic acids; localized collection; ba thing ro ot system; HPLC
158 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 31卷