全 文 ：文章编号:0490-6756(2000)06-0930-07
金属离子和变性剂对黄精凝集素 Ⅱ
构象与功能的影响
鲍锦库 ,吴传芳 ,吕　辉 ,周　红 ,曾仲奎 ,徐平龙 ,邹　键
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘要:黄精凝集素Ⅱ(Polygonatum cy rtonema Hua.LectinⅡ , PCLⅡ)具有 323nm 的荧光发
射峰和 281.6nm 的激发峰.其远紫外圆二色谱(CD 谱)显示 224nm 负峰 , 分子中含 17.3%的α
螺旋和 45.8%的 β 折叠.在 10mmol/ L的 SDS 中 , PCLⅡ完全丧失兔红细胞凝集能力及促 T-淋
巴细胞有丝分裂活性 , CD谱呈现双负峰的α螺旋构象;去除 SDS 后 , 则呈无规卷曲构象.此时 ,
荧光发射峰红移而激发峰蓝移 , PCL Ⅱ仍完全失活.在 EDTANa2 溶液中 , PCL Ⅱ凝集红细胞能
力及促淋巴细胞有丝分裂活性完全丧失;去除 EDTA 后 , 红细胞凝集活性完全恢复 ,但仍失去促
淋巴细胞有丝分裂能力.PCLⅡ二级结构变化不大 ,荧光光谱的变化表明微环境受到影响.
关键词:黄精凝集素Ⅱ ;金属离子;荧光光谱 ;圆二色性;结构与功能
中图分类号:Q 518.4 文献标识码:A
凝集素这类重要的非酶 、非免疫原的糖结合蛋白由于其多种重要的生理功能而日益受到
重视.对于许多凝集素而言 ,金属离子是他们保持糖结合活性不可缺少的[ 1] .但黄精凝集素Ⅱ
(Polygonatum cyrtonema Hua.Lect inⅡ , PCL Ⅱ)却不需要 Ca2+、Mg2+保持其凝集红细胞的
能力[ 2] ,研究金属离子在维持 PCLⅡ结构和生物学活性中的作用有助于揭示 PCL Ⅱ结构与功
能的关系.本文报道应用荧光光谱 、圆二色谱 ,结合生物学活性 ,研究 PCL Ⅱ去除金属离子以
及在 EDTANa2 ,SDS 溶液中构象与活性变化的关系.
1　材料与方法
1.1　材料
PCLⅡ按文献[ 3]的方法纯化 、经电泳和 HPLC 检测为单一蛋白带.人外周血取自成都市
妇幼保健院 ,兔红细胞由本室制备.
Sephadex G-25为 Pharmacia产品 ,十二烷基磺酸钠(SDS)为 Merk 产品 ,乙二胺四乙酸二
钠(EDTANa2)为上海化学试剂厂产品 ,其余试剂为分析纯.
1.2　方法
1.2.1　蛋白质浓度测定用 Folin-酚试剂测定 ,以牛血清白蛋白作标准.
1.2.2　凝集活性测定在微量血清稀释板上进行 ,在系列倍比稀释的“V”型孔中加入兔红细胞
振摇 10min ,室温放置 2h ,显微镜检查凝血活性.
1.2.3　促有丝分裂活性的测定 ,按 Itoh[ 4]的方法测定.
收稿日期:1999-11-09
基金项目:国家自然科学基金(39770178)
2000年 12 月
第 37卷第 6期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University(Natural Science Edition)
Dec.2000
Vol.37　No.6
1.2.4　金属离子的去除参照文[ 5]的方法进行 ,用原子发射光谱监测 PCLⅡ中金属离子的去
除程度 ,同时增加未去除过量 EDTANa2的 PCLⅡ样品的活性和光谱测定.
1.2.5　SDS对 PCLⅡ结构和活性的影响 ,用 10mmol/L 的 SDS 生理盐水溶液对 PCL Ⅱ样品
充分透析 ,经 Sephadex G-25去除过量 SDS ,收集样品部分浓缩至一定浓度和未去除 SDS 的样
品 ,同时进行活性和光谱测定.
1.2.6　光谱测定　荧光光谱在 Hitachi-850 荧光分光光度计上进行 PCL Ⅱ及去除 SDS 、ED-
TANa2 后 PCL Ⅱ样品的测定.测定溶液为生理盐水溶液 ,样品浓度 O.D280nm =0.01.以
280nm 、295nm 为激发波长 ,测得荧光发射谱 ,再以发射谱的 λmax(323nm)为发射波长 ,测得激
发光谱.
圆二色性(CD)谱的测定用 JASCO-500型自动记录分光偏振仪在 25℃时测定 ,蛋白质浓
度为 1mg/ml-1 ,生理盐水溶液配制 ,扫描范围分 320nm ～ 250nm 和 250nm ～ 200nm 两段 ,平
均残基分子量取 110 ,光程分别为 0.5cm和 0.02cm ,灵敏度二毫度每厘米;圆二色谱用平均椭
圆度[ θ]表示 ,单位为度.厘米/分摩尔(deg .cm2/dmol),并按 Chen ,Yang[ 6]的方法计算各构象
单元含量.
2　结果与讨论
2.1　10mmol/ L 的SDS 处理 PCL Ⅱ后 ,血凝活性[ 2]和促有丝分裂活性完全丧失(表 1),即使
去除过量 SDS后亦不能恢复.说明在变性剂作用下 ,活性中心被破坏导致失活.
表 1　经不同处理后黄精凝集素Ⅱ(PCL II)凝集活性变化
凝集素浓度(μg/ mL)
500 250 125 62.5 31.25 15.6 7.8 3.9 1.95 0.98 0.49 0.24
Control + + + + + + + + + + + +
PCL Ⅱin SDS
(10mmol/ L) — — — — — — — — — — — —
PCL Ⅱ去除过量
SDS
— — — — — — — — — — — —
PCL Ⅱ in EDTA
(20mmol/ L) — — — — — — — — — — — —
PCL Ⅱ去除
EDTA
+ + + + + + + + + + + +
2.2　经 EDTANa2去除 PCLⅡ的金属离子 ,其血凝活性保持不变[ 2] ,但促淋巴细胞有丝分裂
活性与天然PCLⅡ相比近乎完全丧失(表 2);同时 ,未去除过量EDTANa2的 PCLⅡ ,其血凝活
性及促细胞有丝分裂活性亦完全丧失.这些结果说明 PCL Ⅱ的促有丝分裂活性依赖 Ca2+ 、
Mg
2+的存在.促有丝分裂活性的完全丧失和凝血活性的完整保留 ,表明 PCL Ⅱ中这两个相关
的活性中心是相互独立的 ,过量 EDTANa2 存在时上述活性均完全消失 ,说明 EDTANa2 是
PCLⅡ的抑制剂 ,对有丝分裂活性的抑制是经鳌合 Ca2+ ,Mg2+来实现的 ,但凝血活性则不然.
用 EDTANa2 处理过的兔红细胞仍能被其凝集说明 EDTA 并非通过影响红细胞使 PCLⅡ不能
发生凝集作用 ,而是 EDTA直接作用于 PCLⅡ所致.推测可能是 PCLⅡ糖识别结合区域被封
931第 6期 鲍锦库等:金属离子和变性剂对黄精凝集素 Ⅱ构象与功能的影响
闭或所必需的构象被破坏 ,去除 EDTANa2 后又行恢复 ,故凝血活性完整保留.许多凝集素都
需要二价金属离子维持其功能 ,特别是豆科植物凝集素更是需要金属离子稳定其结合位点和
固定参与糖结合氨基酸的位置以保持糖结合活性 ,并且参与金属离子结合的氨基酸在所有豆
料植物中是高度保守的.至于来源于百合科植物的 PCL Ⅱ金属离子结合位点是否类似仍需进
一步研究.PCLⅡ不需要金属离子保持其凝血活性显然不同于许多凝集素 ,但它却需要金属离
子维持其促淋巴细胞有丝分裂活性.这是一个值得深入探讨的问题.
表 2　黄精凝集素 II 不同处理后促有丝分裂活性变化
转化细胞 分裂相 总数 转化率(%)
有丝分裂比
(%)
PCL II 2872 508 3081 93.2 16.5
PCL II in SDS
(10mmol/ L) 8 0 3219 0.25 0
PCL II 去除过 SDS 0 0 3171 0 0
PCL II in EDTA
(20mmol/ L) 0 0 3025 0 0
PCL II 去除 EDTA 20 0 3216 0.62 0
图 1　黄精凝集素 I I(PCL II)荧光光谱
1.323nm 激发谱;2.280nm 发射谱;3.295nm 发射谱----PCL II 经 SDS处理并去除过量
SDS;———天然 PCLII-·-·-PCL去除 Ca2+、Mg2+;-··-··-PCL II经 EDTA处理(20mmol/ L)
2.3　黄精凝集素Ⅱ的荧光光谱
PCLⅡ具有 λmax =323nm 的内源荧光发射光谱和 λmax为 281.6nm 的荧光激发光谱(图
l).当 O.D280nm =0.01时 ,荧光强度分别为 32.7和 33.05.而 295nm 激发的荧光发射峰强度远
小于 281.6nm ,由于 295nm 仅激发色氨酸(Trp)的荧光 ,且 PCLⅡ分子中约含 3个 Trp和 5个
酪氨酸(Try)残基[ 3] ,所以 281.6nm 激发的发射光谱由 Ty r和 Trp共同贡献 ,但在光谱中并无
Tyr残基产生的荧光峰 ,说明 PCLⅡ的内源荧光发生了从 Ty r和 Trp的能量转移.和游离色氨
酸最大荧光发射峰 348nm 相比 , 295nm 荧光最大发射峰为 323nm ,蓝移了近 25nm ,说明 Trp
932 四川大学学报(自然科学版) 第 37卷
周围的极性较弱 ,并未完全暴露于周围溶剂中 ,而是被屏蔽在一定的构象中 ,处于疏水的微区
环境或 Trp的吲哚环有着特殊的构象[ 7] .
SDS 与蛋白质分子间的作用主要是中和分子中的电荷及与分子内部疏水相互作用发生作
用 ,很容易与蛋白质结合.低浓度时就能与蛋白质高度结合 ,使蛋白质构象发生很大的变化.去
除过量的 SDS后 , PCLⅡ荧光发射谱λmax 红移至 331nm ,强度增加为 57.02 ,而激发谱蓝移至
279nm ,强度增加为 57.77(图 1),显示 Trp周围疏水环境被破坏 ,极性增加或 Trp残基所处的
特殊构象被破坏 ,从而导致λmax 的红移.荧光强度的增加可能是 SDS中和了可以淬灭荧光的
电离基团所致.
去除金属离子后 , PCL Ⅱ荧光发射峰蓝移至 320nm , 强度增加至 38.06 ,激发峰蓝移至
277nm ,强度为 38.14(图 1),表明 Trp周围介质极性减弱 ,疏水性增加 ,显示了 Ca2+、Mg2+对
PCLⅡ的空间构象具有独特的作用.它的去除 ,破坏了金属离子和某些氨基酸残基上带负电荷
的功能基团之间形成的具有一定空间构象的配位键 ,从而影响了 Trp所在微区的构象 ,导致
Trp残基进一步进入疏水环境 ,增大了 T rp残基的荧光发射量子产率[ 9] .
2.4　黄精凝集素Ⅱ的圆二色谱
PCLⅡ远紫外 CD谱显示 224nm 处单一大负峰和 212nm 及 234nm 两个负肩(图 2),分子
中含有 17.3%的α-螺旋 , 45.8%的 β-折叠和 36.9%的 β-转角和无规卷曲(表 3).
表 3　黄精凝集素 II 二级结构单元含量
凝集素 α-螺旋(%)
β-折叠
(%)
β-转角和无规卷曲
(%)
天然 PCL II 17.3 45.8 36.9
PCL I I in SDS 45.1 15.4 39.5
PCL I I去除 SDS 9.5 14.2 76.3
PCL I I in EDTANa2 14.6 45.2 40.2
PCL去除 EDTANa2 13.9 45.6 40.5
其近紫外 CD谱在 278nm 处有一大负峰 ,260nm 、285nm 和 300nm 处各有一肩(图 2),近
紫外 CD谱主要反映氨基酸侧链残基的构象 ,285nm 和 300nm 处的肩可能是 Trp贡献 ,278nm
负峰可能由 Tyr提供 , 260nm 肩则可能是 Phe贡献[ 10] .
在 10mmol/ L的 SDS中 ,PCL Ⅱ近紫外 CD谱完全消失 ,几乎呈一直线 ,说明侧链基团被
完全破坏;远紫外区 212nm 和 234nm 两肩消失 , 224nm 的负峰蓝移至 218nm ,极值大幅下移 ,
峰谷变钝 ,峰形变宽 ,同时在 208nm 左右出现一负峰 ,使 CD 谱在 200 ～ 225nm 之间形成一个
大的双负峰 ,显示α-螺旋的特征谱形 ,计算表明 , β-折叠大幅减少 ,α-螺旋增加较多(表 3),无规
卷曲亦有一定增加.结合 PCL Ⅱ此时完全失活 ,表明其已发生完全变性 ,可以推测活性中心构
象以 β-折叠为基础 ,它的减少正是导致失活的原因.对于许多蛋白质而言 ,其在 SDS 中的构
象 ,随着 Phe、Asp 、Leu 、Gly 含量的增加 , α-螺旋亦会相应增加[ 11] ,有的则不然 ,这可能就是
SDS 中 PCLⅡ螺旋结构有较多增加的原因 ,因为 PCL Ⅱ中这几种氨基酸含量较高[ 3] .去除过
量SDS后 ,近紫外 CD谱有所恢复 ,仅表现为 278nm 处小负峰 ,此时远紫外CD变化较大 ,双负
峰消失 ,负峰蓝移至 205nm ,极值下移 ,谱形显示 PCL II处于典型的无规卷曲状态[ 12] .计算结
构表明分子中含有 76.3%的 β转角和无规卷曲.显示此时 CD谱的变化是由于过量 SDS 去除
933第 6期 鲍锦库等:金属离子和变性剂对黄精凝集素 Ⅱ构象与功能的影响
所导致.说明结合的 SDS与溶液中游离的 SDS具有协调作用 ,使变性后的 PCL II呈现特殊构
象状态.推测这与溶液中 SDS 的电荷性质有关.由于 PCL II 的电荷性质和疏水作用受到破
坏 ,三级结构发生解体 ,二级结构受到破坏而呈现无规卷曲状态 ,荧光光谱的变化亦支持这种
结论.在过量的 SDS 溶液(10mmol/ L-1)中 ,由于 SDS 的电荷性质及 PCL II 中特殊的氨基组
成导致无规卷曲到α螺旋的过渡.对于一些典型的无规卷曲的蛋白质来说 ,在 10mmol/L 的
SDS 溶液中均呈现双负峰的α-螺旋构象[ 12] .
图 2　黄精凝集素 I I(PCL II)远近紫外圆二色谱
---PCL II 在 10mmol/ L SDS 中;-·-·-去除过量 SDS;———天然PCL II-×-×-PCL
II 在 20mmol/ L EDTANa2 中;-··-··-PCL II 去除 EDTANa2
在 EDTANa2 溶液中 ,PCL II 近紫外CD谱 278nm 处负峰红移至 283nm ,且极值下移峰谷
变尖 , 285nm 的肩红移至 290nm 、300nm 处的负肩变为下正峰 ,同时在 275nm 处出现新的负
肩;远紫外 CD谱仅表现212nm处负肩的消失.去除 EDTANa2 后 ,远紫外 CD谱几乎未发生变
化 ,近紫外区 275nm 的负肩消失(图 2).二级结构变化并不显著 ,仅表现为α螺旋含量有所减
少(表 3),可能是由于α螺旋依赖的分子内氢键以及带正电荷金属离子与氨基酸残基上带正
电荷的功能基团间形成的具有一定空间结构的配位键遭到破坏所致[ 13] .这些结果表明 EDTA
和金属离子对 PCLⅡ的主链构象影响并不大 ,结合 PCL Ⅱ活性和荧光光谱的变化 ,说明构象
的变化主要涉及到氨基酸侧链残基 ,尤其是芳香氨基酸所处的微环境 ,引起酪氨酸 ,色氨酸侧
链基团发生变化 ,也诱导主链构象发生细微变化 ,正是这种微环境的变化及主链构象的变化 ,
导致 PCL Ⅱ失活 ,比较去除和未去除 EDTANa2 的 CD谱 ,仅存在近紫外区 275nm 处有肩与否
的区别.可以推测 ,EDTA的存在封闭或扰乱了凝血活性中心 ,导致失活 ,去除 EDTANa2 后凝
血活性又行恢复 ,而促细胞分裂活性中心构象随着金属离子的去除遭到破环而无法恢复.
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THE EFFECTOF METAL ION AND DENATURANTON CONFORMATION
AND FUNCTIONOF POLYGONATUM CYRTONEMA HUA .LECTIN Ⅱ
BAO Jin-Ku , WU Chuan-fang , LU Hui , ZHOU Hong ,
ZENG Zhong-kui , XU Pin-long , ZOU Jian
(College of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:To demonstrate the roles of Ca2+ 、Mg2+ in the conformat ion and function of
Polygonatum cyrtonema Hua .lectin Ⅱ (abbev.PCL Ⅱ), the conformat ional changeof PCLⅡ
was studied by f luorescence and circular dichroism (CD)spectra.Intrinsic f luo rescence of PCLⅡ
showed the λmax of emission and excitation spectrum at 323nm and 281.6nm respectively , it indi-
cated that t ryptophan w as in a hydrophobic microenvironment.The relat ive fluorescence intensity
exci tated at 281.6nm was bigger than that at 295nm so far , so the energy w as transfered from ty-
rosin to t ryptophan.The far ultraviolet (UV)CD spect ra exhibited a rare negative peak w ith
minimum at 224nm and two negative shoulders at 212nm and 234nm , While its near-UV CD
spectra show ed negative peak at 278nm and shoulders at 260nm 、285nm 、300nm.It contains
about 17.3% α-helix and 45.8% β-sheet.In 10mmol/L sodium dodecy l sulphate(SDS), the
near-UV CD spect ra disappeared , while far-UV CD spectra show ed a typical double negat ive
peaks between 200 ～ 225nm , removed w ith excess SDS , the near -UV spectra centered at
278nm regained partly , but at far-UV region , it exhibited a random coil curve.The λmax of fluo-
rescence emission spect ra red-shif ted to 331nm.but exci tation spect ra blue-shif ted to 279nm , the
relative fluorescence intensity all increased about 70%, PCLⅡ lost activi ty as hemagglutination
and mitogen tow ards T-cell completely.Treated w ith disodium ethylene diamine tet racetate(ED-
TANa2), PCLⅡ lost activity as mentioned , the negative shoulder at 212nm disappeared , while
the peak and shoulder of near-UV region at 278nm and 300nm red-shif ted , and a new shoulder
appeared at 275nm .Removing EDTANa2 , the new shoulder at 275nm disappeared , λmax of emis-
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sion and excitation spectra were all blue-shif ted w ith the increased relative f luo rescence intensity ,
PCLⅡ lef t hemagg lutination activity intact , but lost mitogenic activity tow ards T-cell , so at least
there were tw o functional domain in PCLⅡ to start various reaction , EDTANa2 could inhibi te the
hemagglutination of PCLⅡ.Maybe Ca2+ , Mg2+ were need for PCLⅡ to maintain special micro-
environment confo rmation to trigger serial signal and result the division of T-cell , but not essential
for hemagglutination.
key word:lectin;polygonatum cy rtonema Hua lectin Ⅱ;bioactivity ;fluorescence;ci rcular
dichroism
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