全 文 ：第 25 卷 第 6 期 云南农业大学学报 Vol. 25 No. 6
2010 年 11 月 Journal of Yunnan Agricultural University Nov． 2010
收稿日期:2010 － 03 － 10 修回日期:2010 － 05 － 14
* 基金项目:江西省科技支撑计划项目 (2007BN21202) ;江西省科学院科研开发专项 ［赣科院字 (2006)15 号］。
作者简介:王小玲 (1979 －) ，女，陕西白水人，助理研究员，博士，主要从事林木与花卉育种研究。
E-mail:wangxiaoling1979@ 126. com
观赏羽扇豆离体培养生根关联酶活性及
可溶性蛋白含量变化规律研究*
王小玲，高 柱，余发新，刘腾云，王碧琴
(江西省科学院 生物资源研究所，江西 南昌 330029)
摘要:对观赏羽扇豆尖塔和奖品离体培养生根过程中叶片过氧化物酶 (POD)、吲哚乙酸氧化酶 (IAAO)、多
酚氧化酶 (PPO)3 种氧化酶活性和可溶性蛋白含量进行了动态跟踪分析。结果表明:尖塔和奖品的 POD 活
性均出现两个高峰，第 1 个高峰出现的时间一致，在培养后第 5 天;第 2 个高峰，奖品出现在第 15 天，比尖
塔早 5 d。IAAO活性和 PPO活性发展趋势相反。培养后，两个品种的 IAAO活性呈现“ →升高 降低”的趋势;
PPO活性呈现“ →降低 升高”的趋势。可溶性蛋白总体呈现波动下降趋势。研究还认为观赏羽扇豆离体培养
生根过程可分为根原基诱导期、不定根表达期和不定根伸长期 3 个时期。根原基诱导期，POD 和 IAAO 活性
升高有利于根原基诱导。不定根表达期和伸长期，POD 和 IAAO 活性下降，PPO 活性和可溶蛋白含量维持在
较高水平，有利于不定根的生长和发展。
关键词:观赏羽扇豆;过氧化物酶;吲哚乙酸氧化酶;多酚氧化酶;可溶性蛋白
中图分类号:S 68. 043 文献标识码:A 文章编号:1004 － 390X (2010)06 － 0835 － 05
Study on Rooting Correlative Enzymes Activity and Soluble
Protein Content of Ornamental Lupins in Vitro
WANG Xiao-ling，GAO Zhu，YU Fa-xin，LIU Teng-yun，WANG Bi-qin
(Institute of Biological Resources，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029，China)
Abstract:The purpose of this paper is to study the activity of peroxidase (POD)，indoleacetic acid oxi-
dase (IAAO)and polyphenol oxidase(PPO)，as well as，the content of soluble protein of the leaves of two
ornamental Lupins varieties，Minaretie and Russell Prize，in vitro． The result showed that POD activity of
two species had two peaks． POD activity increased and reached their first peak at the 5th day，and then they
decreased slightly following an increasing at the 10th day till reached Russell Prizes second peak at the 15th
day，Minareties at 20th day． The activity of IAAO and PPO had opposite trends． IAAO activity showed“in-
creasing-declining”trend，while PPO activity showed“declining-increasing”trend of two species． The con-
tent of soluble protein was declined as a whole． The study also considered that rooting processes could be
divided into three phases:root primordial inducing，adventitious root expressing and adventitious root elon-
gating． During the phase of root primordial inducing，POD and IAAO activity was increasing to induce root
primordial． POD and IAAO activities were declining，as well as PPO activity and the content of soluble pro-
tein at a higher level was conducive to root growth and development．
Key words:ornamental Lupins;peroxidase;indoleacetic acid oxidase;polyphenol oxidase;soluble protein
DOI:10.16211/j.issn.1004-390x(n).2010.06.019
羽扇豆 (Lupins polyphyllus Lindl)属于豆科蝶
形花亚科，羽扇豆属 1 年至多年生草本植物，根
据用途可分为观赏羽扇豆和食用羽扇豆［1］。羽扇
豆可通过播种育苗、扦插和组织培养［2］等 3 种方
法进行繁殖。自花授粉植物，种子繁殖系数低，
种子以进口为主，成本高;扦插繁殖技术目前还
不成熟;组织培养，成本低，可根据生产需求，
快速繁殖优良资源。作者通过几年的研究发现，
观赏羽扇豆离体培养生根的质量是限制试管苗移
栽成活的关键因子之一。
吲哚乙酸 (indoleacetic acid，IAA)一个重要
的生理功能就是促进不定根的形成，IAA 含量的
变化势必影响不定根的发生。过氧化物酶 (per-
oxidase，POD)能氧化内源 IAA，消除体内过多的
IAA，POD作用过程中某些产物是不定根发生和
发展所必需的辅助因子，有利于根原基的诱导和
不定根的形成。吲哚乙酸氧化酶 (indoleacetic
acid oxidase，IAAO)可以氧化 IAA，因此 IAAO
活性的大小与根的发生有重要关系［3 － 4］。多酚氧
化酶 (polyphenol oxidase，PPO)对不定根的形成
十分重要，酚类物质对不定根发生和发育起着重
要作用［5］，PPO的一个重要作用是催化这些酚类
物质与 IAA 综合而形成一种 “IAA 酚酸复合
物”［6］，这种复合物是一种生根的辅助因子，具
有促进愈伤组织的分化、促进不定根形成的活
性［7］。可溶性蛋白虽只占蛋白质的一部分，但是
生物体能吸收利用的主要是可溶性蛋白，它在生
命活动中发挥着运输协调、免疫保护、产生和传
导神经活动、控制生长分化等功能，为细胞的生
长提供了物质基础。
目前，国内未曾有关观赏羽扇豆离体培养生
根的生理生化研究报道。因此，本试验通过测定
尖塔和奖品两种观赏羽扇豆离体培养与生根关系
密切的 3 种氧化酶活性 (POD，IAAO、PPO)和
可溶性蛋白含量的变化，分析四种生化指标与生
根的关系，对研究其生根机理具有重要的理论价
值和实践意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验于 2008 年 3 月在江西省科学院“植物遗
传育种重点实验室”进行。分别选取观赏羽扇豆
“尖塔”和 “奖品”的继代培养苗，接种到 1 /2
MS + NAA 0. 25 mg /L +白糖 45 g /L +琼脂 6 g /L培
养基上［2］。自培养当天起，每隔 5 d 取样 1 次，
每种每次至少从 3 ～ 5 个培养瓶中取其叶片，混
匀，用液氮迅速冷冻后，测定其吲哚乙酸氧化酶、
过氧化物酶、多酚氧化酶活性和可溶性蛋白。试
验处理均设 3 次重复。
1. 2 方法
1. 2. 1 吲哚乙酸氧化酶和多酚氧化酶活性测定
称取样品 0. 1 g，加少许聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)和预冷的 pH 6. 0 磷酸缓冲液 1 mL，研磨
提取，转入 10 mL 离心管，用磷酸缓冲液定容至
10 mL。在 4 ℃条件下 6 500 r /min离心 10 min，上
清液为测定 IAAO和 PPO活性的酶液。IAAO活性
测定参考李明等方法［3］，于 530 nm 波长测定 OD
值。IAAO活性以每 g 鲜重在 1 h 内分解破坏 IAA
的 μg数 ［μgIAA· (gFW·h)－ 1］表示酶活性大
小。PPO活性测定参照李焕秀等［4］方法进行改
进，420 nm 波长测定。以每 g 鲜重每 min 变化
0. 01 为一个酶活性单位 (U·g －1FW)。
1. 2. 2 过氧化物酶活性和可溶性蛋白含量测定
称取样品 0. 1 g，加少许 CaCO3 和预冷的蒸馏
水 1 mL，冰浴中充分研磨成匀浆，转入 10 mL 离
心管，再用蒸馏水分次冲洗研钵，并入离心管，
定容至 9 mL。在 4 ℃条件下 6 500 r /min 离心 10
min，所得上清液即为 POD 活性和可溶性蛋白含
量测定的酶液。POD 活性测定采用愈创木酚染色
法［5］，470 nm波长测定。采用考马斯亮蓝 G － 250
染色法 (Coomassie brilliant blue G － 250)［5］，于
595 nm测定其吸光度。
1. 3 计算方法
POD活性［μg·(gFW·min)－1］=
(X －X0)×Vt
FW ×V5 × t
IAAO活性［μgIAA·(gFW·h)－1］=
(C2 － C1)×Vt ×60
V5 × FW × t
PPO活性(U·g －1FW)=
△A420 × Vt
(0. 01FW × t)×Vs
样品中蛋白质的含量(mg·g －1FW)=
C ×Vt
FW ×Vs ×1000
X为测定管四邻甲氰基苯酚的含量 (μg) ;
X0 为对照四邻甲氰基苯酚的含量 (μg) ;C 为查
标准曲线值 (μg) ;C1 为反应液中残留的 IAA 含
量 (μg /L) ;C2 为无酶反应液中的 IAA 量 (μg /
L) ;Vt 为酶液总体积 (mL) ;Vs 为测定时取酶
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液的量 (mL) ;FW为样品鲜重 (g) ;t为酶作用
的时间 (min)。
2 结果与分析
2. 1 离体培养生根过程中叶片 POD 活性的动态
变化
从试验的结果 (图 1)可以看出，尖塔和奖
品离体培养生根过程中不同时期叶片的 POD活性
变化呈现一定的规律性。两个品种叶片的 POD 活
性均有两个明显峰值。第 1 个峰值出现的时间一
致，在培养后第 5 天，尖塔 POD 活性比培养前增
加了 27. 38%，奖品增加了 27. 56%;培养后第 10
天，POD活性同时达到谷底，之后快速上升，此
后不久即见有不定根突破表皮;培养后第 15 天，
奖品 POD 活性达到第 2 个峰值，较尖塔早 5 d。
第 1 个峰值出现时，奖品 POD 活性略高于尖塔，
而此时的形态观察结果发现，奖品基部白色点状
颗粒明显多于尖塔。培养后第 10 天，两个品种的
POD活性均达到了谷底，POD 活性下降，导致体
内 IAA含量上升，有利于不定根的形成。第 2 个
峰值出现时，根已突破表皮，进入不定根表达期
和伸长期。
2. 2 离体培养生根过程中叶片 IAAO 活性的动态
变化
图 2 表明，尖塔和奖品离体培养生根过程中，
IAAO活性的变化规律一致:0 ～ 10 d 根原基诱导
期，IAAO活性直线上升。10 ～ 15 d 不定根表达
期，IAAO活性缓慢下降，内源 IAA 含量逐渐增
加，有利于不定根的形态建成。15 ～ 25 d 不定根
伸长期，IAAO 活性迅速下降，内源 IAA 水平大
幅度提高，从而促进不定根的伸长。培养结束时，
奖品的 IAAO活性为 203. 542 μgIAA / (gFW·h) ，
比培 养 前 降 低 了 63. 30%，尖 塔 为 313. 125
μgIAA / (gFW· h) ，降低了 34. 62%。奖品的
IAAO活性降低幅度明显大于尖塔。
2. 3 离体培养生根过程中叶片 PPO活性的动态变化
尖塔和奖品离体培养生根过程中，PPO 活性
呈现先下降后上升的趋势 (图 3)。在根原基诱导
期 (0 ～ 10 d) ，PPO 活性相继下降，催化生成的
“IAA －酚酸复合物”逐渐减少，对生根不利;随
着培养时间的延长，不定根表达期和伸长期 (10
～ 25 d) ，叶片中 PPO 活性增加，导致生成的
“IAA －酚酸复合物”也相应地增加，促进了不定
根的形成。
2. 4 观赏羽扇豆组培苗生根过程中植物可溶性蛋
白含量的动态变化
从图 4 中可知，尖塔和奖品叶片的可溶性蛋
白含量基本呈现波状下降趋势，可见不定根的形
成与可溶性蛋白质不断消耗有密切关系。培养后
10 d内，叶片可溶性蛋白质含量急剧下降，尖塔
和奖品分别比培养前下降了 25. 16%和 23. 37%，
738第 6 期 王小玲，等:观赏羽扇豆离体培养生根关联酶活性及可溶性蛋白含量变化规律研究
表明在根原基诱导过程中，试管苗体内原有可溶
性蛋白质转变为根原基细胞生长时所需的生根功
能蛋白，为进一步生根奠定了物质基础。第 10 天
起，叶片蛋白质含量开始上升，第 15 天达到一个
峰值，此时可溶性蛋白质的积累，为不定根的形
成提供充足的营养物质。之后蛋白质含量基本维
持在一个较高水平，促进不定根的伸长。
3 讨论与结论
本研究认为，观赏羽扇豆离体培养生根过程
可分为 3 个时期:根原基诱导期、不定根表达期
和不定根伸长期。根原基诱导期要求高活性的
POD和 IAAO，以消除体内过多的 IAA，促进根原
基的诱导。根原基诱导期，PPO 活性降低，结合
体内 IAA 形成 “IAA － 酚酸复合物”含量减少，
不利于生根。诱导期叶片可溶性蛋白转变为根原
基诱导所需要的营养物质，含量减少。不定根表
达期和伸长期，体内高浓度的 IAA 含量和较高水
平的蛋白质含量有利于不定根的发展和伸长。
POD与内源 IAA 含量、木质素形成、能量代
谢和呼吸代谢密切相关，推测在离体形态发生中需
要更多的能量和较大的呼吸强度，而 POD 正是与
能量和呼吸代谢密切相关，因此认为 POD 在离体
形态发生中起重要作用［8，9］，GASPAR等［10］将其视
为生根标志之一。离体培养生根过程中，尖塔和奖
品叶片 POD活性总体呈“ → →上升 下降 上升”趋
势，有 2个峰值出现。这一结果与蓝桉离体生根试
验中发现 POD 活性也有两个峰值，一个在组织培
养的第 1 天，他认为这一峰值与根原基的诱导有
关，第 2 个峰值在第 10 天左右，此时，根已突破
表皮，进入伸长时期的结论一致。奖品第 2 个峰值
出现的时间比尖塔早，原因可能有两个，一是与两
个品种的遗传特性有关;二是与两个品种的生根指
数有关。尖塔和奖品离体培养后第 5 天叶片出现的
第 1个峰值应是参与了根原基的诱导，POD活性不
断升高，高活性的 POD 能氧化内源 IAA，有效地
降低了体内过多的 IAA 含量，符合低浓度 IAA 诱
导根原基形成的观点［11］。因此，尖塔和奖品离体
培养不定根诱导期和表达期，高活性的 POD 是有
生根能力和生根指数较高的标志，此结果与 MON-
COUSIN［12］和 HAISSIG［6］的结论一致。
尖塔和奖品离体培养生根过程中叶片 IAAO
活性在根原基诱导期和不定根表达期升高，不定
根伸长期降低。由于 IAA 对不定根的起源和生长
的作用毋庸置疑，因此，任何影响 IAA 含量变化
的因素的存在势必影响不定根的发生和发展。绿
豆不定根起源的早期 IAAO 首先表现活性［13］，凤
仙花的插条发根时 IAAO 活性大幅度升高［14］。
GASPAR［10］等试验表明，离体生根过程中，高活
性的 IAAO使内源 IAA 水平降低，低浓度的 IAA
有利于根原基的诱导。本试验中，两种观赏羽扇
豆尖塔和奖品离体培养生根过程中 IAAO 活性的
变化规律与 PACHECO［5］和 CALDERóN － BALTI-
ERRA［15］的研究结论一致。
BALAKRISHNAMURTHY［16］曾经证明 PPO 催
化生长素代谢，促进不定根的起源与发育。而有
关不同时期 PPO活性变化的规律则因为植物种类
的不同而有差异。本研究发现，根原基诱导期
PPO活性虽然降低，但尖塔和奖品的最终生根率
都在 90%以上。可能是诱导期高活性的 POD 和
IAAO有效降低了体内 IAA 含量。不定根表达期
和伸长期，叶片中 PPO 活性逐渐增加，这与
MOLNAR［17］，HABAGUCHI［18］，UPADHYAYA［19］
和曹帮华等发现的 Hydrangen macrophylla，胡萝
卜，菜豆和桑树的试验中发现的不定根形成和伸
长时，体内 PPO活性剧烈上升的情况相似。
众多研究表明，生根过程中，可溶性蛋白质
含量的变化与生根密切相关［20］。培养 10 d内，尖
塔和奖品叶片的可溶性蛋白质含量均下降，一是
由于切口呼吸加强，代谢旺盛而下降;二是叶片
合成的蛋白质向生根部位运输，转变为根原基生
长所需要的物质。10 d 后不定根陆续突破表皮，
叶片合成蛋白质的能力增强，可源源不断地输送
838 云南农业大学学报 第 25 卷
到生根区域，为不定根的进一步发展提供丰富的
营养物质。
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