全 文 ：收稿日期:2013-01-28; 修订日期:2013-09-07
基金项目:甘肃中医学院中青年基金项目( No． ZQ2011-4)
作者简介:高晓兰( 1969-) ，女( 汉族) ，陕西米脂人，现任甘肃中医学院讲
师，硕士学位，主要从事神经解剖学研究工作．
当归补血汤及其加味方
对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究
高晓兰 1，王 强1，陈彦文1，黄继锋1，郭 超1，刘 润1，朱增强2
(1．甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000; 2．兰州石化总医院，甘肃 兰州 730060)
摘要:目的 探讨当归补血汤及其加味方对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其机制。方法 采用线栓法制成大
鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，免疫组化染色法检测大鼠脑缺血再灌注后海马区 NGF阳性细胞的表达，TTC染色法体现
大鼠脑组织梗死体积的改变，观察当归补血汤及其加味方对其结果的影响。结果 脑缺血再灌注及生理盐水灌胃组大鼠
海马区 NGF阳性细胞分布稀疏，数目较假手术对照组、脑缺血再灌注后当归补血汤灌胃组及当归补血汤加味方灌胃组明
显减少( P ＜ 0． 05) ; 大鼠脑缺血再灌注后当归补血汤灌胃组及当归补血汤加味方灌胃组相对生理盐水灌胃组均能减少大
鼠脑缺血再灌注损伤后的脑组织梗死体积( P ＜ 0． 05) 。结论 当归补血汤及其加味方能增加大鼠脑缺血再灌注后海马区
NGF阳性细胞的表达，同时减少脑缺血再灌注后大鼠的脑组织梗死体积，对大鼠脑缺血再灌注后的神经组织具有一定的
保护作用。
关键词:脑缺血再灌注; 神经生长因子; 当归补血汤加味方; 海马; 大鼠
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 12． 026
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 12-2885-02
Study of the Danggui Complex Mixture and Its additional Prescriptions Neruroprotection
Function on the Ｒat Cerebral Ischemia － reperfusion
GAO Xiao-lan1，WANG Qiang1，CHEN Yan-wen1，HUANG Ji-feng1，GUO Chao1，LIU Ｒun1，ZHU Zeng-qiang2
( 1． Gansu College of Traditional Chinese Meditime，Lanzhou Gansu 730000 China; 2． Lanzhou Petrochemical
General Hospital，Lanzhou Gansu ，730060，China)
Abstract: Objective To investigate the Danggui( Angelica sinensis) complex mixture and its additional prescriptions＇ neuropro-
tection function on the rat cerebral ischemia － reperfusion．Methods Using thread － tie method to make middle cerebral artery is-
chemia － reperfusion model，immunohistochemical staining for NGF detection of focal cerebral ischemia － reperfusion in rat hip-
pocampus expression of cells，the TTC staining method to observe the brain infarction volume change and the Danggui complex
mixture and its additional prescription influence their results． Ｒesults Hippocampus of cerebral ischemia reperfusion and intraper-
itoneal fed of saline group NGF － immunoreactive cells have sparse distribution，compared with sham － operated control group，the
number of cerebral ischemia reperfusion after intraperitoneal fed of the Danggui complex mixture and its additional prescription
group significantly reduced ( P ＜ 0． 05) ; and the rat cerebral ischemia － reperfusion after by intraperitoneal fed of the Danggui
complex and its additional prescription group relative cerebral ischemia reperfusion of intraperitoneal fed group all can reduce rats
after ischemia － reperfusion injury of cerebral infarction( P ＜ 0． 05) ． Conclusion The Danggui comples mixture and its additional
prescription can enhance the expression of NGF － positive cells in hippocamus after，cerebral ischemia reperfusion，at the same
time reduce the rat cerebral infaction volume of brain tissue，which has a protective effect on ischemia reperfusion．
Key words: Cerebral ischemia and reperfusion; NGF; The Danggui complex mixture and its additional prescription; Hip-
pocampus; Ｒats
缺血性脑卒中的防治是当今社会和医学界关注的重要课题，
研究认为脑缺血再灌注损伤是大多数缺血性脑血管疾病的主要
病理生理过程。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种
最典型的神经营养因子，脑内主要来源于神经元。在缺血性脑损
伤的过程中，NGF对减轻神经元损伤、提高存活率和修复过程有
着重要作用［1］。当归补血汤主治血虚发热证，有补气生血之功
效。研究表明当归补血汤加味方可促进心肌代谢，解除冠状动脉
痉挛，减轻心肌的缺血性损伤［2］。有关当归补血汤及其加味方
对实验动物脑缺血再灌注损伤的作用和机理研究并不多见。本
实验分别观察当归补血汤及其加味方对大鼠局灶性脑缺血再灌
注损伤后海马各区 NGF 阳性细胞表达和脑组织梗死体积的改
变，从而探讨当归补血汤及其加味方对大鼠脑缺血再灌注损伤后
的神经保护作用及其相关机制。
1 材料
1． 1 实验动物 SPF 级 Wistar 大鼠 80 只，雌雄各半，体质量 180
～ 220 g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK
(甘 2011 － 0001)。
1． 2 实验药物和试剂 当归补血汤由黄芪 100 g、当归 20 g组成，
加味方添加党参 100 g(当归、黄芪、党参均购于兰州德生堂大药
房)。所有药物加纯净水浸泡 1 h后分别加 1 000 ml和 500 ml纯
净水煎煮 2 次，每次 1 h，合并药液并浓缩至质量浓度为 1 g 生
药 /mL后备用。使用时以纯净水配成所需浓度。造模术中麻醉
药物 10% 水合氯醛，上海化学试剂公司产品，批号 20110615。
NGF 多克隆抗体试剂盒、浓缩型 SABC(Strept Avidin － Biotin
Complex)免疫组化染色试剂盒 、二氨基联苯胺(diaminobenzi-
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dine，DAB)显色试剂盒以及 2，3，5 －氮化三苯基四氮唑(Triphe-
nyl tetrazolium chloride，TTC)染色试剂盒均购自武汉博士德生物
工程有限公司。
1． 3 实验材料及仪器 手术剪、眼科剪、手术刀、血管钳、线剪、微
型拉钩、小圆针、皮针、缝合线、手术灯、大鼠固定架、纱布、孔巾
等。医学图像分析系统:成都泰盟科技有限公司，BI － 2000 型;
轮转式切片机:美国，AO － 82 型;电子分析天平:上海精科天平
厂，FA2004N型;光学显微镜:日本 Olympus，CH － 212 型;台式离
心机:金坛市恒丰仪器厂;隔水式电热培养箱:上海跃进医疗器械
厂，PYX － PHS － B型。
2 方法
2． 1 造模、分组及给药 所有大鼠在实验室适应性饲养 1 周后，
开始进行局灶性脑缺血再灌注模型的制备，采用 Longa 等［3］的栓
线法制成大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。大鼠术前禁食 8 ～
12 h，自由进水。10%水合氯醛(0． 4 ml /100g)腹腔注射麻醉后，
将大鼠仰卧固定于手术固定板上，颈部皮肤备皮，碘伏消毒。颈
部稍左侧切口，分离皮下组织后，于切口下方的胸骨舌骨肌与胸
锁乳突肌之间找到大血管，触摸有搏动感，即颈总动脉。分离左
侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，在距颈总动脉分叉处 1 cm 位
置结扎左侧颈外动脉，同时动脉夹夹闭左侧颈总动脉，提起左侧
颈外动脉游离端使其与颈内动脉成一直线，于颈外动脉结扎处近
心端约 0． 5 cm 位置剪一小切口，将一根用肝素浸泡过的尼龙线
经左侧颈外动脉切口处缓慢向颈内动脉方向推进，以左侧颈总动
脉分叉处为标记，推进约 18 ～ 20 mm 感受到轻微阻力时即为阻
断了大脑中动脉。阻断 2 h后，拨出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合
皮下组织和皮肤，完成大鼠脑缺血再灌注的模型。假手术组除不
插线外，其他过程同上。
除去在造模术中因手术麻醉和出血死亡以及不符合模型标
准的 20 只外，其余 60 只随机分为 4 组，每组 15 只。①假手术及
生理盐水灌胃对照组(A 组);②局灶性脑缺血再灌注及生理盐
水灌胃组(B组);③局灶性脑缺血再灌注及当归补血汤灌胃给
药组(C组)，④局灶性脑缺血再灌注及当归补血汤加味方灌胃
给药组(D组)。大鼠从造模术后第 2 天起开始给药，C 组大鼠
每日灌胃法给药 2 次，每次给予当归补血汤 10g 生药 /kg体重，D
组大鼠每日灌胃法给药 2 次，每次给予当归补血汤加味方 10 g
生药 /kg体重，其余 A、B 两组大鼠每天同一时间给予生理盐水
10 ml /kg体质量灌胃，连续给药 2 周。
2． 2 动物模型评分及取材 大鼠造模术后按照 Bederson 等［4］的
5 分制评分法进行评分。0 分:无神经功能缺损症状;1 分:不能
伸展左侧前爪;2 分:向左侧划圈;3 分:向右侧倾倒;4 分;不能主
动行走，意识丧失。其中，0 分和 4 分者被剔除，取评分为 1 ～ 3
分者作为实验对象，不具备上述体征及术后未能生存至预定时间
的大鼠被淘汰。连续灌胃 2 周后将各组大鼠开胸，升主动脉插管
后肝素生理盐水冲洗血液，用 4%的多聚甲醛灌注，断头取脑，置
于 4%的多聚甲醛固定液中固定 12 h，常规石蜡包埋，取两耳级
连线前 6 mm左右冠状切面，切片厚 7 μm，4 ℃冰箱保存备用。
2． 3 SABC免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水化，用 1
∶ 50 过氧化氢 －甲醇混合液(20 ℃)处理 30 min，0． 01 M(Phos-
phate Buffered Saline)PBS缓冲液漂洗 3 次;将载玻片放入湿盒，
滴加正常山羊血清封闭液，室温(20 ℃)放置 30 min，不洗;滴加
NGF多克隆抗体，4 ℃冰箱过夜后，0． 01M PBS缓冲液洗涤 3 次;
滴加兔抗大鼠 IgG，室温(20 ℃)孵育 30 min，0． 01 M PBS缓冲液
洗涤 3 次;滴加 SABC，室温(20 ℃)孵育 30 min，0． 01M PBS缓冲
液洗涤 3 次;室温下 DAB显色，镜下控制反应时间，以 NGF 阳性
神经元呈棕黄色、背景为淡黄色为度，蒸馏水洗涤;梯度酒精脱
水，二甲苯透明，中性塑胶封片后显微镜观察大鼠海马各亚区及
齿状回(dentate gyrus ，DG)组织切片，取每张切片 5 个高倍视野，
计算 NGF免疫反应阳性细胞数。
2． 4 TTC染色 将大鼠断头取脑速冻后，取视交叉后方连续 2mm
脑组织冠状切片，放置于 2%的 TTC染液中，于 37℃恒温孵育 15
min后，梗死区脑组织呈现灰白色，而正常脑组织呈现鲜红色，将
显色后的脑组织切片放置于 4%多聚甲醛缓冲液中固定 24 h，分
离出梗死区脑组织，电子天平称重，然后以梗死区脑组织的重量
占缺血区脑组织重量的百分比作为相对梗死体积。
2． 5 统计方法 实验数据用 珋x ± s 表示，组间比较用单因素方差
分析，组间两两比较方差齐时用 LSD检验，方差不齐时用 Dunnett＇
s T3 检验，实验数据用 SPSS 10． 0 统计软件系统处理。
3 结果
3． 1 大鼠海马区 NGF 免疫组化染色结果 免疫组化染色后，假
手术及生理盐水灌胃对照组(A组)大鼠海马区神经元胞体及突
起内有黄色的 NGF阳性颗粒，排列整齐，而局灶性脑缺血再灌注
及生理盐水灌胃组(B组)大鼠海马各区及齿状回 NGF阳性细胞
分布稀疏，数目较假手术对照组(A 组)、当归补血汤给药组(C
组)、当归补血汤加味方给药组(D 组)明显减少，差异有统计学
意义(P ＜ 0． 05)。结果见图 1 和表 1。
图 1 各组大鼠海马 CA1 区 NGF免疫组化染色结果
表 1 高倍镜下各组大鼠海马各亚区及齿状回 NGF阳性细胞数比较(珋x
± s)
组别 例数 CA1 CA2 CA3 DG
A组 15 19． 10 ± 1． 15 19． 52． ± 2． 06 18． 97 ± 2． 13 14． 11 ± 2． 65
B组 15 13． 33 ± 0． 42* 12． 87 ± 1． 16* 12． 57 ± 2． 07* 10． 07 ± 1． 19*
C组 15 16． 69 ± 1． 14▲ 15． 21 ± 2． 56▲ 16． 61 ± 2． 96▲ 13． 76 ± 1． 25▲
D组 15 16． 83 ± 0． 16◆ 16． 15 ± 1． 61◆ 17． 01 ± 1． 24◆ 12． 92 ± 2． 47◆
A、B两组比较，* P ＜0． 05。B、C 两组比较，▲P ＜ 0． 05。B、D 两组比较，◆P ＜
0． 05
3． 2 当归补血汤及其加味方对大鼠脑脑组织梗死体积的影响
脑组织梗死体积比较结果表明，局灶性脑缺血再灌注及当归补血
汤给药组(C组)及其当归补血汤加味方给药组(D 组)相对局灶
性脑缺血再灌注及生理盐水灌胃组(B 组)均能在一定程度上减
少大鼠脑缺血再灌注损伤后的脑组织梗死范围(P ＜ 0． 05)，而
C、D两组之间比较，D组相对 C组更能较大程度地减少大鼠脑缺
血再灌注损伤后的脑组织梗死范围(P ＜ 0． 05)。见表 2。
表 2 TTC染色后各组大鼠脑组织梗死体积的比较 %
组别 脑组织梗死体积
A组 0． 00 ± 0． 00
B组 29． 87 ± 1． 32
C组 23． 65 ± 0． 75◆
D组 20． 50 ± 0． 08▲
D、C两组与 B组比较，◆P ＜ 0． 05;C、D两组比较，▲P ＜ 0． 05;n = 15
4 讨论
脑缺血再灌注损伤的治疗原则是:迅速改善脑部血液循环，
增加脑缺血区的血液流量和氧气供应，防止脑血管病变的继续加
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重，争取使功能受到抑制的脑细胞较快地恢复活力，增加脑血流
量，保护神经元［5，6］。本实验所采用当归、党参和黄芪均为益气
活血的中药，共同合用来研究对抗脑缺血再灌注损伤的机理，正
是建立在中医所认为对本病的病机为气虚血瘀的理论基础上。
中医认为脑卒中的主要发病原因是由于气血亏虚、心肾功能
失调、气血瘀滞而致。缺血再灌注属于中医“中风”范畴，气血是
脑部执行各种机能的物质基础，气血失常也是脑部发病的主要病
机，而益气活血是治疗中风的基本原则［7］。当归补血汤为金元
时代名医李东垣《内外伤辨惑论》所创，是中医补气生血代表方
剂，其中黄芪与当归用量比为 5∶ 1，具有明显的益气生血、扶正
固本的功效［8］。研究表明当归补血汤可以扩张周围血管，增加
冠状动脉和脑血流量，从而改善脑部的血液循环，使脑组织的缺
氧环境得到缓解，同时可以逐渐建立脑血管侧枝循环，增强脑细
胞代偿能力［9］。本实验为当归补血汤及其加味方治疗脑缺血再
灌注损伤提供了机能和形态学方面的进一步证据。
NGF是一种重要的神经细胞生长调节因子，它对中枢以及
周围神经元的发育分化、生长再生和功能特性的表达均具有重要
的调控作用，可以增加大脑的可塑性，提高脑损伤后大鼠的学习
记忆能力［10］。有研究表明 NGF 亦能促进交感神经元以及中枢
胆碱能神经元的存活，在脑损伤的情况下，这些组织就可以恢复
对外源性 NGF的反应［11］。缺血性脑损伤后遗症的发生和神经
再生障碍相关，一直以来人们普遍认为受损的神经细胞不能再生
的主要原因是因为缺乏神经营养因子等调节因素。
本实验结果表明大鼠脑缺血再灌注后 NGF免疫反应阳性细
胞的表达显著降低，而当归补血汤及其加味方能够增强大鼠脑缺
血再灌注后海马区 NGF阳性细胞的表达，同时一定程度上减少
了大鼠的脑组织梗死体积。需要说明的是在本实验中当归补血
汤加味方相对当归补血汤虽然并没有明显地提高脑缺血再灌注
损伤后的大鼠海马区 NGF 阳性细胞的表达，但是当归补血汤加
味方相对当归补血汤明显减少了大鼠的脑组织梗死体积，从而在
大鼠脑缺血再灌注损伤后发挥了更好的神经保护作用，所以实验
中所用当归补血汤加味方的选材及其对脑缺血再灌注损伤的疗
效还是肯定的。但是有关脑缺血再灌注损伤后的神经修复机制
十分复杂，当归补血汤对脑缺血再灌注后的神经保护作用及其机
理还需做进一步的研究。
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收稿日期:2012-12-28; 修订日期:2013-09-05
基金项目:科技重大专项“重大新药创制”( No． 2012ZX09101202)
作者简介:王晓毅( 1981-) ，男( 汉族) ，辽宁丹东人，现任天士力集团研究
院研究员，博士学位，主要从事中药质量标准控制工作．
* 通讯作者简介:范 颖( 1962-) ，女( 汉族) ，辽宁沈阳人，现任辽宁中医
药大学教授，博士学位，主要从事中药药效物质基础研究工作．
* 通讯作者简介:叶正良( 1967-) ，男( 汉族) ，浙江人，现任天士力集团股
份有限公司研究员，博士学位，主要从事中药新药研发工作．
丹参提取过程中酚酸类物质溶出情况
的超高效液相色谱监测
王晓毅1，2，章顺楠2，周立红2，叶正良2* ，范 颖1*
(1．辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032; 2．天津天士力集团，天津 300410)
摘要:目的 建立起用 UPLC检测丹参提取过程中酚酸类物质含量测定。方法 水提丹参，定时采样，使用 UPLC 测定不
同时间中酚酸类物质的溶出量。结果 该方法稳定，线性好，精密度佳。结论 可用该方法监测丹参提取过程中酚酸类物
质的溶出量。
关键词:超高效液相色谱; 丹参; 酚酸; 溶出量
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 12． 027
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 12-2887-02
丹参是唇形科植物丹参 Savia miltiorrhiza Bge．的干燥根及根
茎，是一味传统中药。《中华人民共和国药典》(2010 版)记载丹
参具有“活血祛瘀、通经止痛、清心除烦凉血消痈”等功效［1］。
丹参水溶性指标成分为丹酚酸 B。目前有研究发现，丹酚酸
B的口服利用度低［2］，导致丹酚酸 B不能被人体很好的吸收。与
此同时，有研究表明丹参中其他酚酸类成分，如丹参素和原儿茶
醛有着良好的活性［3］。因此，为了提高丹参的疗效，丹参的提取
工艺普遍采用水提工艺。
目前为止，尚无学者对丹参提取过程中酚酸类物质的溶出情
况进行考察，这实际上不利于丹参制剂的质量控制。因为酚酸类
物质化学性质活泼，在提取过程中会转化成其他物质，从而降低
丹参制剂的疗效。本文借助超高效液相色谱(UPLC)考察丹参
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