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野生黄精的多糖含量测定及提取工艺研究



全 文 :第 4 期 徐兵兵,等:野生黄精的多糖含量测定及提取工艺研究
doi:10. 3969 / j. issn. 1006 - 9690. 2016. 04. 005
收 稿 日 期:2016 - 01 - 28
基 金 项 目:宁波市农业科技攻关项目(2014C10059);慈溪市农业与社会发展项目(CN2014004)。
作 者 简 介:徐兵兵(1994—),男,本科生,研究方向:植物生物技术。E - mail:1286624023@ qq. com
* 通讯作者:倪穗,女,教授,研究方向:植物生物技术。E - mail:nisui@ nbu. edu. cn
野生黄精的多糖含量测定及提取工艺研究
徐兵兵,倪 穗 *
(宁波大学 海洋学院,浙江 宁波 315211)
摘 要 采用 3,5 -二硝基水杨酸法(DNS 法)测定了宁波四明山区野生黄精的多糖含量,并对水煎煮法提取黄精
多糖的工艺进行优化。通过单因素实验获得了提取温度、提取时间、液料比对黄精多糖得率的影响;在单因素实验
的基础上采用 L9(3
4)正交试验优化黄精多糖提取工艺。研究结果表明,宁波野生黄精多糖的含量为 25. 09%;各
因素对黄精多糖得率的影响不同,液料比对黄精多糖得率的影响最大,其次是提取温度和提取时间。黄精多糖最
佳提取工艺为:提取温度为 80 ℃,提取时间为 2 h,液料比为 20∶ 1,在该条件下,黄精多糖得率为 27. 43%。为黄精
多糖的开发利用奠定了理论基础。
关键词 野生黄精;多糖;含量测定;提取工艺
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1006 - 9690(2016)04 - 0019 - 04
Content Determination and Extraction Process of Polysaccharides
from Wild Polygonatum sibiricum
Xu Bingbing,Ni Sui*
(School of Marine Sciences,Ningbo University,Ningbo 315211,China)
Abstract In this article,DNS method was adopted to determine the content of Polygonatum sibiricum pol-
ysaccharides and the process of water extracting was optimized. This effects of liquid - material ratio,ex-
traction temperature and extraction time of Polygonatum sibiricum polysaccharides yield were investigated by
the single factor experiment,and the parameter of extracting was determined by four - factor and three lev-
els orthogonal experiment. The result indicates that the content of Ningbo wild Polygonatum sibiricum poly-
saccharide is 25. 09%;the various factors have different influences on the extraction,and the liquid - ma-
terial ratio has the greatest impact,followed by extraction temperature and extraction time. Results show
that the optimum process parameters are liquid - material ratio 20∶ 1,extraction temperature 80℃,and ex-
traction time 2 h. In this condition,Polygonatum sibiricum polysaccharides yield is 27. 43% . This research
provides a scientific basis for the further development and utilization of Polygonatum sibiricum polysaccharides.
Key words wild Polygonatum sibiricum Red.;polysaccharides;determination of content;extraction process
黄精(Polygonatum sibiricum Red.)别名老虎姜、
鸡头参,为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)
的多年生草本植物,是中国传统的中药,属于药食同
源性中草药[]。黄精的根状茎黄白色,味稍甜,肥厚
而横走,直径达 3 cm,由数个或多个形如鸡头的部
分连接而成为大头小尾状,节明显,节部生少数根。
其根茎供药用,《中华人民共和国药典》(2000 年版,
一部)收载的黄精来源于百合科黄精属的黄精、多
花黄精(P. cyrtonema Hua.)和滇黄精(P. kingia-
num Coll. et Hemsl.)的干燥根茎[2]。传统医药认
为,黄精性平、味甘,具有补肾益精、滋阴润燥之功
效,用于滋补强身和治疗肾虚精亏、肺虚燥咳以及脾
胃虚弱之证,是中医常用药物之一[3]。
黄精在我国分布广,主要分布在我国的西南、东
北、内蒙古以及安徽、浙江等地。但黄精的适应性较
差,生境选择性强,喜生于土壤肥沃、表层水分充足、
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 35 卷
荫蔽、上层透光性充足的林缘、灌丛和草丛或林下开
阔地带[4]。黄精根茎的化学成分主要有黄精多糖、
甾体皂苷、维生素和多种对人体有用的氨基酸等。
其中多糖是黄精根茎中的主要成分,含量最高,但由
于生存环境的差异,各地产的黄精其多糖含量有
所不同,如泰山生黄精为 12 . 56% ,安徽生黄精
为 9 . 92% ,泰山熟黄精为 7 . 36% ,浙江生黄精为
8. 54%[5]。现代医学研究表明黄精多糖具有抗衰
老作用、抗肿瘤作用、增强免疫力、降血糖、降血脂及
抗氧化损伤等作用[6 - 8]。
由于黄精多糖具有多种生物活性,且无明显毒
副作用,使得黄精成为天然的药物和保健食品。随
着对黄精应用研究的不断深入,黄精多糖的用途大
大拓宽,除药用而外,还可加工成食品、饮料、保健
品、护肤品等。近年来,各地黄精的多糖含量测定及
提取方法研究仅见零星报道,鲜有对宁波地产的野
生黄精进行研究。本文采用 3,5 -二硝基水杨酸法
(DNS 法)[9]测定了宁波四明山区野生黄精的多糖
含量,并对水煎煮法提取黄精多糖的工艺进行优化,
以期为宁波的野生黄精开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
黄精块根采挖于浙江宁波的四明山区。块根清
洗后于 60 ℃烘干,粉碎过 40 目筛,4 ℃保存备用。
苯酚、氢氧化钠、亚硫酸钠、乙醇、酒石酸钾钠、
3,5 -二硝基水杨酸、盐酸、葡萄糖等购于国药集团
化学试剂有限公司,均为分析纯。
1. 2 仪器与设备
TU - 1810 紫外可见分光光度计:北京普析通用
仪器有限责任公司;L600 台式低速离心机(湖南湘
仪实验室仪器开发有限公司)、AL104 电子天平(梅
特勒 -托利多仪器有限公司)、HH - S4 数显恒温水
浴锅(金坛市医疗仪器厂)。
1. 3 研究方法
1. 3. 1 葡萄糖标准液的配制
准确称取 100 mg 的无水葡萄糖置于 100 mL 的
容量瓶中,溶解并稀释至刻度,混匀,得标准溶液。
1. 3. 2 DNS 显色剂的配制
甲液:溶解 2. 3 g 苯酚于 5 mL、10% NaOH 溶液
中并稀释到 23 mL,在此溶液中加入 2. 3 g Na2 SO3;
乙液:称取 85 g 酒石酸钾钠加入 100 mL 10% 的
NaOH 中,再加入 293 mL、1% 的 3,5 - 二硝基水杨
酸溶液。将甲乙溶液相混合,即得黄色溶液,贮于棕
色试剂瓶,室温下阴暗处放置 7 ~ 10 d 后使用[10]。
1. 3. 3 DNS 法测定黄精多糖含量
标准曲线的绘制:依次精密量取 0. 2、0. 4、0. 6、
0. 8、1. 0、1. 2、1. 4 mL 浓度为 1 mg·mL - 1葡萄糖标
准液,分别置 50 mL 容量瓶中,利用蒸馏水补水至 2
mL,再精密加入 1. 5 mL DNS 试剂,混匀,于沸水浴
中煮沸 5 min,取出立即冷却,加水至刻度,摇匀。测
定其在 500 nm 下吸光度值,绘制标准曲线。
样品溶液的制备及多糖含量的测定:分别取 0. 5 g
烘干黄精粉末两份于锥形瓶中(样品液 1、样品液 2),
样品液 1 加入 10 mL 浓度为 6 mol·L - 1的盐酸与 15
mL 的蒸馏水摇匀,样品液 2 加入 25 mL 的蒸馏水摇
匀,水浴加热 30 min。冷却后,样品液 1 加 1 滴酚酞
指示剂,用 10% 氢氧化钠溶液中和至微红色,过滤
后,滤液定容至 100 mL 备用。样品液 2 直接过滤,滤
液定容至 100 mL 备用。平行移取样品液 1、2 各 3
份,每份 2 mL,按照上述方法测定吸光度值,由标准
曲线方程计算多糖含量。多糖含量计算公式:
多糖含量(%)=
m1 - m( )2 × n
Μ
× 0 . 9 × 100 %
式中:m1 为样品液 1 转换为葡萄糖的质量
(mg),m2 为样品液 2 转换为葡萄糖的质量(mg),M
为黄精粉末质量,n 为稀释倍数,0. 9 为葡萄糖对多
糖的校正系数。
1. 3. 4 黄精多糖的提取工艺优化
1. 3. 4. 1 黄精多糖提取[11]
精确称取黄精粉末 5. 0 g 加入到烧杯中,按照一
定的液料比为向烧杯中加入蒸馏水,将烧杯放置在一
定温度的恒温水浴锅中提取一定时间,提取结束后趁
热抽滤,得到滤液,将滤液合并并浓缩至 20 mL,缓慢
加入乙醇,并迅速搅拌至含醇量达 80%,离心 10 min,
过滤后取沉淀,干燥后得到黄精粗糖,精确称重记录
多糖得率。每组实验进行 3 次,结果取平均值。
1. 3. 4. 2 单因素实验
影响多糖得率的因素主要是提取时间、浸提比、
提取次数、温度、pH 值、溶剂和搅拌等[12]。通过单
因素实验,分别考察提取温度、提取时间、液料比多
黄精多糖得率的影响[13]。提取温度对黄精多糖得
率的影响:精确称取黄精粉末 5. 0 g,在提取时间为
2 h,液料比为 20 ∶ 1的条件下,考察不同提取温度
(50、60、70、80、90、100 ℃)对黄精多糖进行提取;提
取时间对黄精多糖得率的影响:精确称取黄精粉末
5. 0 g,在液料比为 20 ∶ 1,提取温度为 80℃ 的条件
下,考察不同提取时间(1、2、3、4、5、6 h)对黄精多糖
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第 4 期 徐兵兵,等:野生黄精的多糖含量测定及提取工艺研究
进行提取;液料比对黄精多糖得率的影响:精确称取
黄精粉末 5. 0 g,在提取时间为 2 h,提取温度为 80
℃的条件下,考察不同液料比(5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶
1、25∶ 1、30∶ 1)对黄精多糖得率的影响。
1. 3. 4. 3 正交试验
在单因素实验的基础上,选择提取温度、提取时
间、液料比作为变量,以黄精多糖得率为考察指标,
按照 L9(3
4)正交实验设计得到的黄精多糖提取工
艺因素水平表如表 1 所示。
表 1 正交试验因素水平表
水平
因素
A(提取温度 /℃) B(提取时间 / h) C(液料比)
1 80 1 10∶ 1
2 90 2 15∶ 1
3 100 3 20∶ 1
2 结果与分析
2. 1 野生黄精的多糖含量
葡萄糖标准曲线如图 1 所示。由图 1 可见,拟
合得到的标准曲线方程为 y = 0. 478 4x - 0. 021 6,
相关系数 R2 = 0. 999 7,葡萄糖在 500 nm 处,0. 2 ~
1. 4 mg 范围内与吸光度值呈良好的线性关系。
图 1 葡萄糖标准曲线
根据上述标准曲线,计算所得的黄精多糖含量
为 25. 09%。
2. 2 黄精多糖的提取工艺优化
2. 2. 1 提取温度对黄精多糖得率的影响
在液料比为 20∶ 1、提取时间为 2 h 的条件下,不
同的提取温度对黄精多糖提取的影响见图 2。
图 2 温度对黄精多糖得率的影响
从图 2 可见,随着提取温度上升,黄精多糖得率
逐渐升高,这是因为多糖的溶解度随着温度的升高
而增大,在提取温度为 50 ~ 90 ℃范围内,黄精多糖
的溶解性对温度具有较高的敏感性,表现出明显的
增幅变化。但当提取温度大于 90 ℃时,多糖得率反
而随温度的升高反而缓慢降低,所以提取温度应选
择 90 ℃为宜。
2. 2. 2 提取时间对黄精多糖得率的影响
在液料比为 20∶ 1,提取温度为 80 ℃的条件下,
不同的提取时间对黄精多糖提取的影响见图 3。
图 3 时间对黄精多糖得率的影响
如图 3 所示,提取时间在 1 ~ 2 h 范围内,多糖
得率迅速上升,2 h 时多糖得率达到最大值;而提取
时间大于 2 h 多糖得率随提取时间的增大反而下
降,在 4 ~ 6 h 多糖得率基本保持不变,根据实验结
果,选择 2 h 为最佳提取时间。
2. 2. 3 液料比对黄精多糖得率的影响
在提取温度为 80 ℃,提取时间为 2 h 的条件
下,不同液料比对黄精多糖得率的影响见图 4。
从图 4 可见,随着液料比的增加,多糖得率逐渐
升高。原因可能是液料比上升,溶剂体积增大,多糖
易扩散于溶剂中,当液料比为 15 ∶ 1时,多糖得率最
高,随后多糖得率有所下降。因此,黄精多糖提取适
宜的液料比为 15∶ 1。
图 4 液料比对黄精多糖得率的影响
2. 2. 4 正交试验结果
在单因素实验的基础上,选择液料比、提取温
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度、提取时间作为变量,以黄精多糖得率为考察指
标,按照 L9(3
4)正交实验设计得到的黄精多糖提取
工艺因素水平表进行实验,对黄精多糖的提取工艺
条件进行优化,结果如表 2 所示。
表 2 正交试验结果及分析
序号 A(温度) B(时间) C(液料比) D 多糖得率(%)
1 1 1 1 1 21. 57
2 1 2 2 2 22. 12
3 1 3 3 3 26. 50
4 2 1 2 3 19. 30
5 2 2 3 1 24. 71
6 2 3 1 2 18. 30
7 3 1 3 2 22. 70
8 3 2 1 3 21. 78
9 3 3 2 1 23. 21
k1 23. 397 21. 187 20. 548 23. 16
k2 20. 768 22. 871 21. 542 21. 041
k3 22. 561 22. 668 24. 636 22. 526
R 2. 627 1. 680 4. 087 2. 123
据表 2,因素组合为 A1B3C3 时多糖得率最大。
对于 A 因素有 k1 > k3 > k2,表明提取温度为 80℃时
提取率最高;对于 B 因素有 k2 > k3 > k1,表明提取时
间为 2 h 时最好;对于 C 因素有 k3 > k2 > k1,表明液
料比为 20∶ 1时提取率最高。
综上所述,3 个因素的最优组合是 A1B2C3,即
提取温度为 80 ℃、提取时间为 2 h、液料比为 20∶ 1。
根据极差分析,影响多糖得率主次因素排序是:C >
A > B,即液料比 >提取温度 >提取时间。根据方差
分析[14],液料比对多糖得率有显著影响,属于主要
影响因素,提取温度与提取时间对多糖得率无显著
影响,属于次要因素。
2. 2. 5 验证试验
正交实验所得的最优水平和直观分析的最优水
平不一致,因此进行优化试验,在正交试验所得的最
优水平条件下对黄精多糖进行提取,所得的黄精多
糖得率为 27. 43%,结果高于直观分析的多糖得率,
表明此优化工艺可行[15]。
3 结论与讨论
采用 DNS 法对宁波四明山区野生黄精中的多
糖含量进行测定,结果表明:宁波野生黄精多糖含量
为 25. 01%。传统的多糖含量的比色测定方法主要
是苯酚 -硫酸法、硫酸 -蒽酮法[16]。这两种方法只
能测定样品中的总糖含量,样品中存在单糖影响实
验效果,若不能完全除去单糖,容易使得测得的数据
偏大,且操作繁杂,DNS 法测多糖含量时,只需同时
测定总糖与单糖的含量,两者之差则为准确的多糖
含量。该法操作简单、快速、灵敏度高、杂质干扰
较小[17]。
通过单因素实验研究了液料比、提取温度、提取
时间对黄精多糖得率的影响,在单因素试验的基础
上通过 L9(3
4)正交试验得到水煎煮法提取黄精多
糖的最优工艺条件:液料比 20 ∶ 1,提取温度为 80
℃,提取时间为 2 h,在该条件下,黄精多糖得率为
27. 43%。水煎煮法提取黄精多糖的过程中,液料比
是影响多糖提取的主要因素。在提取过程中用
80%乙醇醇沉用以除去单糖,低聚糖,苷类及生物碱
等成分,避免杂质成分影响实验结果,实验结果相对
真实准确。提取后的黄精多糖生物活性尚待进一步
研究。
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