全 文 ：绪 1` 奋 第 乏期
lo s e年 14月
东 北 林 业 大 学 学 报
J O UR NAL O F NR O T壬 1一 E A S’ P FR O邸 TR Y U I NV ER I ST Y
V
o
l
.
l` 材。 .乏
A P r一。 6 8
长 白 山 天 然 红 松 林伺 .功 酶
遗 传 变 异 的 研 究 `
一红松云冷杉林醋酶遗传及组成 ’
杨一平 尹瑞雪 张军丽
(中国科学院林业土壤研究所 )
珍贵的天然红松林主要分布在我国东北部山区 。 在长白山地区不但有水平分布 , 同
时还有垂直分布 , 因长白山海拨高达 2 7 0 0米 , 而 2 0 0 0 米以下为森林植被所覆盖 。 北坡
自上而下 , 形成亚高山岳桦林 、 暗针叶林和红松阔叶林三个明显垂直分布带 lt) 。 天然红
松林 , 除主要分布在红松阔叶林外 (海拨 5 0 一 1。。 o 米 ) , 在暗针叶林下限 (海拨 1 1 0 一
1 3 0 0 米 )( O 向红松阔叶林过渡的地段 , 形成红松云冷杉林。 因此 , 天然红松林在长白山
洽垂直分布形成红松云冷杉林和红松阔叶林 。
天然红松林在长期进化因素作用下 , 形成一定遗传结构及其功能 , 本文继分析研究
红松阔叶林红松群体醋酶遗传变异冈之后 , 仍采用凝胶电泳技术分析研究红松云冷杉林
红松群体大配子体醋酶同功酶遗传变异 , 来揭示红松云冷杉林红松群体遗传组成变异 ,
幅度及其频率分布。 以便和红松阔叶林红松群体比较 , 并能较全面了解长白山地区天然红
松林总的遗传组成及其频率分布规律 。 为合理保护和经营好这部分宝贵森林资源 , 保护
和利用好这珍贵森林基因资源提供科学依据 。
一 、 材 料 与 方 法
以休眠种子大配子体为酶源材料 。 红松种子是分两次收集的 。 1 982 年在海拨 1 2。。m
红松云冷杉林单株收集 (n 二 30 ) , 1 9 8 4年从海拨 1 1 0 0m 开始向 1 3 0 0m 的红松云冷杉 ,
沿线由下向上单株收集 (n 一 3 2) 球果 , 球果净种后 , 种子放入 4℃ 冰箱中贮藏待用 。
电泳样品 , 单个大配子体匀浆的粗蛋 白 , 40 m g 大配子 体 材料放人 1 m l 提取液中
( p H S
.
3 0
.
I M t r i s一甘氨酸电极缓冲液 + 1 5%蔗糖 ) 研磨后 , 以 4 0 0 o r p m 离心 1 0 m i n ,
其上清液为电泳样品液 。
采用聚丙烯酞胺不连续双垂直板式凝胶电泳 , 分离胶浓度为 7 . 5% , 间隔胶浓度为
3%
, 电极缓冲液为。 . 1 M t r i s一甘氨酸 p H 8 . 3 , 电泳开始时每个样品 0 . 7 m A 电流 , 1
工述礼 同志步加 198 2年样 品收集工作 : 代 洪才 同志协助收集样 品 . 在此谨致谢意 ,
她含期 长白山天然红松林同功酶遗传变异的研究
小时后 , 增加到 l . s m A , 并持续稳流条件直至电泳结束 。
染色 , 凝胶取下后用去离子水漂洗三次 , 凝胶片放入 。 . I M ` r r i s 一马来酸 p H 6 . 4
缓冲液预浸 15 分钟 , 取出放人染色液 中 (染色液 , 40 m g a一醋酸蔡醋 + 3 m l 丙酮 +
1 0 0 m g 坚牢兰十 0 . I M T r is 一马来酸 p H 6 . 4 缓冲液至 1 0 m l) , 在 25 ℃ 恒温下染色 1
小时。 取出凝胶片用去离子水洗数次 , 再放人装有 5一 8℃ 的 7% 冰乙酸的 电 泳脱色仪
中脱色至酶带清楚时取出 , 制成标本 。 上述方法 , 墓本上采用红松阔叶林醋酶的方法 。
但也有些环节进行 了改进 , 凡改进部分均与红松阔叶林醋酶遗传 〔4 〕方法进行检验后 , 未
有出人时方采用的 。
为了分析单株树大配子体分离型 , 每株树一般情况下 , 测定 6 粒种子大配子体 , 有
的多达 24 个大配子体 , 个别的树号受材料数量所限 , 还有不足 6 个大配子体的 。 酶谱
及每个基因位点的等位基因表型分离比例 , 均采用含有一个自由度的 “ Y at e / 5 o or r 。 -
。 t io n ” 卡方进行检验的。
由于我们的资料有限 , 只有醋酶的数据 , `基因位点还少 , 所以对红松群体 基因变
异 , 采用基因位点杂合性或多样度来度量 。 用 N e i ( 19 75 ) 〔了〕介绍的方法 。
群体基因频率的观察 , 与哈代一温伯格氏 ( H ar d y 一W e i的 e r g ) 定律的随机交配
群体的样品预期值是否一致 , 用 护 检验法检查 。
二 、 结 果 与 讨 论
一 ` 、 红松云令护林醋酶遗传 :从单株收集的劝J子中 , 以单株分别分析测定 34 株大配子体样品 , 每株测定 6 个大配子
体 , 共获得 2 0 4 个醋酶标本中 , 发现有 14 种类型醋酶酶 谱 , 其 中工一 刃编号的酶谱与
阔叶红松林醋酶酶澹种类相同外 , 还增加了 1 : 、 x : 、 又 : 三个新酶谱而缺少皿 , 新酶
谱仍由 5一 9 条组成 。 只是由不同基因位点不同等位基因重组的结果 。 其酶谱编号 , 考
虑进一步研究 , 便于对比应用的需要 , 未重新单独排列 , 而是以红松阔叶林红松群体酩
酶酶谱编号为基础 , 新发现的酶谱 , 靠近哪个原有酶谱 , 就以哪个酶谱右下角附加 1、 .2 二
等表示 , 如皿 、 、 x 、…等 (见图 1 ) 。
红松云冷杉休除发现上述合乎普遍规律的 14 种醋酶酶谱外 , 还发现一种罕见稀有醋
酶谱类型 。 在 E s t一 C 基因位点等距二条带 , 靠近起点线距离最近那一条带 , 染色特深
而清楚 , 另一条带处 , 不显带 。 E st 一 B 位点两条带 , 比正常两条带带距窄 , 其相对迁
移率也与正常不 同。 E s t一 A 基因位点的带也与正常不同 。 总之 , 这类酶谱不符合正常
规律 , 是一种特别类型 , 但机率很少 。
14 种醋酶谱 , 共有三个活性位点区 , E s t一 A 、 E s t一 B 和 E “ t一 C 基因位点。 同质
基因位点区 E s t一 C , 在红松云冷杉林该位点区有个普遍特点 , 即等距两条带中距离起点
线近的那条带 , 普遍不清楚 ; 其余两个基因位点区的 E s t一 A , 仍有 6 个等位基因 , 山
具有不同迁移率的 1一 5 条带组成 , E s t一 B 位点是由不同迁移率等距 两 条带组成 , 有
二个等位墓因表型 (见图 1一 3) 。
侧粥因峭曰汁长母 8 !卜S a的田
!… l
11
`
如侧 ! |…
谈裂
酬粥箱能智姐ǎ卜S 灿à谧窘翁工田
.........
一 ........
... .
...
ó ..........
;
,、.,卫里口
良同-时
.... ..“”n
1
1..
.. ..........
-
川
! l
川
}川
川
l l
川
川
l川
}川 }}
l川 · }
叫目日卜咸
` , 声甲帐
~
尹
甲 甲曰 卜留 留
第之期 长白山天然红松林同功酶遗传变异的研究
红松每个种子的大配子体是单倍体 , 它是在大抱子母细胞减数分裂后形成四个大抱
子之一产生的 , 其余三个退化了 , 推测是随机的。 从具有异质的二倍体单株收集种 一子的
大配子体基因型分离也应是随机的 , 一个位点有两个等位基因系统 , 其分离应服从 1 : 1
比例 , 这样对红松林群体遗传变异的研究 , 可以不经过大量有性繁殖实验 , 而是用子代
推测亲代林木群体遗传组成的方法 , 利用酶谱不同基因位点的等位基因表 型 和墓因型 ,
直接对红松林群体遗传组成进行估价 , 并能在分子水平上反映林木群体组成 , 对研究基
因位点多 , 而世代交替周期长的天然红松林 , 是特别有效而又方便的方法 。 本文的酶谱
资料 , 其分离比例 , 基本上附合 1 : 1。 其分离型 , E s t一 B 和 E st 一A 基因位点的等位
基因分离比例及卡方检验 (见表 1 和表 2 ) 。
衰 1 单株树大配子体醋醉醉谱衰型分离和卡方检验
-一~ 一一一一一一一 , 一一一一一 一 `分离衷型 树 号 株 数 分离比例
I : 砚 6
I : V 8 2一 5 2 l 2 6 : 6 0
0I : I 盆 8 4 e l o 6 3 : 3 0
。
16
丁 ’ : V 6 2 : 4V ; I 8 2一 6 1
砚 : I
8 2 es 6 3 6 3 : 3 0
6 08 2一 6 6 3 : 3
8 3一 1 3飞 : V 2二 4 0 。 1 6
植 : 飞 08 4一 2 4 6 3 : 3
8 2一 6 8 6l : 砚 3 : 3 0
_ _ _
_ “ · ` “ …X : X i 8 4 es 39 ! 2 : 4
l : 飞 8 4一 11 6 3 : 3 0
8 4se 2 8 6
砚 : 飞 叮一~ 一 ~ ~ 一 ~ , 一 一一 03 : 3
砚 : 飞 8 4一 30 6 3 : 3 0
V : l 8 2se 5 8 6 2 : 4 0
。
1 6
祖 : 1 1 3 : 3 08 4一 3 5 6
I : 飞 8 2e 5 0 6 3 : 3 0
V : X 三 8 4一 2 0 。 1 66 4 : 2
V : 互 8 2 e 5 7 6 4 : 2 0 。 16
I : 互 8 2e 7 7 6 2 : 4 0 。 16
I : 百 : 植 8 4一 3 12 4 : 4 : 4 0
3 2一 59 1 1 1 : 4 : 2 : 盛 1 。 0
0
。
2 - 0
。
3
。
7一 0 。 8
,0
。
7一 0 . 8
一…一二
0
.
7 e 0
.
8
一 一 ~ ~ ` ~ 一 ~ 贵一
1
0
。
7一 0。 8
仁口UùOU洲· j,一
ùnō一ùUō卜几U
产仲`一7,.。口
1
一
C.一Oùn
3 8 东 北 林 业 大 学 学 报 第14 卷
表 2 单株树大配子体等位基因表型分离及卡方检验
分离裹型 树 号 株 数 分离比例 2 X
B i :B z
0
.
1 6
4 0
.
7一 0 . 8
8 2一 8 63 :3
B I :B s
8 2一 51 1 2 6 6 :
8 4一 13 4 6 :2 0 . 1 60 . 7一 0 。 8
8 2一 5 53 :3 0
8 2一 2 63 :石
卜.1
!— 一 }— -— 一8 2一 3 6 6 :3 0 _ _{ _ _ _ _ _ _ _ __一 _ _ _一8 4 e s l8 9 :9
3 2 :
_ _ _ _一 ~一 } O`
.一 ;…ì !。
B么 :B s
8 4- 28
8 4 e3 0 63 :3一 }— -—8心 e s2 48 4一 10 3 3 :3 :3 0 _ _ _ _ _ _l _0
8 4一 3 9 2 :4 0 。 1 0 6。 7一 0 。 8
}
” 4一 “ 3 3 :
E ST- A
A名 :A含 8 2一 60 2 4 0 :。 1 60 。 7一 0 . 8
8 2一 58
8 4 e sl
4 :2 0
。
1 60
。
7一 0 。 8
2 4 1 0 :14 0
。
38 0
.
5一 0 。 7一 {8 4一2 88 4 w e3 0 6一 3 3 :A t :A3 8 2一 50 3 :3 了
8 2一 13 一一一一 ~— 、 一一一2 :4 1 0 。 1 60 . 7一 0 . 88 2一 7 52 4 :0 。 1 60 。 7 e so。 88 2一 64
8 4一 3
4 :2
8 :4
0
。
1 6
0
。
7 5
0
.
7一 0 . 8
O
。
3一 O。 5
第 2期 一民白山天然红松林同功酶遗传变异的研究 胜
(续表 2 )
分离表型 {树 号
2 8一 6 3
株 .数 {分离比例
A Z: A s2 8一 51
2 8一 5 5
82一 9 7
l
{l
,
5 0
.
2一0 . 3
A 3 : A
`
1 8卜 2 0 . 7 e 0 . 8
A 3 : A 。 8 4一 39 0 . 3 e 0 . 5
从上述资料可以清楚看出 , 红松云冷杉林红松醋酶同功酶遗传 , 基本酶谱仍然由共
有不同迁移率的 5一 9 条带组成 , 共有三个基因位点区 , 除 E S T一C 基因位点由等距两
条带组成同质位点外 , E S T一 B 和 E S T一 A 为异质基因位 点 , E S T一 A 位点有 A ; 、
A Z
、
A 3
、
A 4
、
A S和 A 。等位基因 , E S T一B 位点有 B : 、 B : 和 B 3三个等位墓因 , 这些
基本遗传型均与阔叶红松林醋酶同功酶遗传型相同 , 只有酶谱类型比红松阔叶林多出三
个新酶谱 , 胆这也是不同基因位点不同等位基因重组的结果、 因此 , 本文进一步证实天然
红松林醋酶同功酶的遗传型 , 这 给进 一涉研究红松群体遗传结构及地理群体变异打下 良
好基础 。 特别应指出的 E S T一 B 基因位点 , 重复性高 , 规律性强 , 可以进一步利用它 。
三 、 天然红松林醋酶遗传组成
遗传型确定之后 , 就可探讨红松遗传组成方面问题 。 群体遗传组成主要涉及基因频
率和基因型频率 。 考虑到长白山垂直分布 , 将红松云冷杉和红松阔叶林 ( 白河林业局种
子 ) 基因频率和基因型频率 (见表 3 ) 。
表 3 等 位 墓 因 衰 型 频 率 分 布
E S T一 A
类 型 ’ A : : 人 : 人 : … A ` { A 。 } A . { 杂合性 ( h ) { 株 ,
一黔望擎一…一哩一 {止坦竺一 }兰翌二 {止里兰一…一:竺 -红 松 姻 叶 林 } 0 · 2 9 0 } 0 · 0 5 0 } o · 5 2 0 】 0 · 12 0 1 0 · 0 2 0 旦
·竺1旦_ _ _ {_ 竺竺一一 }_
_ “ 5
一 1 o . eZ s Z 1 5 6
类 型 }
B: i 杂合度 ( h ) 1
红松云冷杉林
红 松 阔 叶 林
0
。
19 4 0
。
29 0 0
。
5 16
0
。
16 7 0
。
4 2 9 0
。
4 0 6
0
。
6 1 2 0
0
。
6 2 3 2
6 2
4 2
从表 8 中可以看出红松云冷杉林 E s t一 A 基因位点 A : 墓因频率 , 比红松阔叶林高 ,
而A , 基因频率则显著下降 。 其杂合性 ( h) 红松云冷杉林为 。 · 6 9 34 , 略高于阔叶红怜
4 0 东 北 林 业 大 学 学 报
林的 。 .6 28 2, 两个林型 E s t一 B : 因基位点 , B : 基因频率的接近 ,
第“ 卷
B 3基因频率红松云
冷杉林比红松阔叶林偏高 , B : 基因频率红松云冷杉林比红松阔叶林明显提高了。
群体遗传组成 , 第二个问题是基因型频率分布问题 , 因 E s t一 B 基因位点等位基因分
布有规律 , 重复性又高 , 以此位点进行两个林型红松的基因频率组成的观察值与哈代一
温伯格式定律比较 , 并用卡方检验 , 其结果均较接近 (见表 5 ) 。 红松云冷杉林为 0 . 8 <
p < 0
.
9
, 红松阔叶林为 0 . 8 < p < 0 . 9 。
衰 4 · 红松林 E ST一 B 基 因位点遗传结构
基 因 型 频 率 等位基因频率 !—类 咆 〔画…{~望竺 { B 3B 3 ;飞少兰 } B : B 3 }不可 ! B : I B: 1 B 3燮竺{竺…竺{红 t松 门 叶 林 1 0 · o` 8 } o · 2 3 8 1竺!竺}一生里~ {一燮}竺}一? ·乡’ 。0 · 19 0 1 0 · 0 9 5 】 0 · 14 3 { 0 · 28 6 ! 0 · 16 7 } 0 · 4 2 9 “少为一少 _ _0 . 4 06 } 4 2
衰 5 红松林墓 因型频率观察值与哈代一温伯格式定律
E S T一 B 位点基因型频率
0
。
0 3 2 0
。
09 7
!一
。`习l!川引.类 型 B I B I B: B : { B 3B : B: B: ! B : B。 ! B: B:一值一察望户一观期
红松云冷杉林 0 。 0 3 8 0 。 0 8 4
0
,
9 5 X 10
- 0
。
0 0 2
一二: 一 ,二 }一 {一燮一 }一 `一 .一卫竺竺` {二里二卜.一卫迎竺 ,卜二竺匕 }一一0 . 2 4 x l 0一 a 】 0 . 0 0 2 1 0 . 0 2 2 } 0 . 2 7 x l 0一 ! 。竺二二苦 l 门 . U 。 U“
红 松 阔 叶 林
观察值
期望值
}
二全_
一生燮 - }
一旦二
“ · 0 14
1
0
·
2 3 8
18 4
0
。
1 9 0
0
。
1 6 5
0 16 1 0
·
0 0 4
一 ;竺1一竺竺一 }- 上竺竺一}一一 {里少1卜三二里竺- 卜- 兰燮止…-一} 0 。 0 16 ! 0 . 3 6 X 10 一 J } 0 。 0 1 1 } . ’二二二:咨 】 1 ) U 一 U O I ,
再从 E S T一B 位点杂合体占的百分率看 , 红松云冷杉林占 61 % , 而红松阔叶林占
52 %
, 同时红松云冷杉杂合性 ( h) 也比红松阔叶林偏高 , 从这些度量值可以初步看出
红松云冷杉林长期受高山生态条件选择压力作用 , 多样度略偏高些 , 因此 , 可能更好地
适应其特定条件 。
第 2期 长白山天然红松林同功酶遗传变异的研究 4 1
参 考 文 献
〔 1 )吴少伯 .17 9 9 .植物组织 中蛋 白质及同功酶聚丙烯酞胺盘状电泳 , 植物 生理 通讯 1 . 30 一 3 .
〔 2 〕 王战 、 徐振邦等 , 1 9 80 , 长白山北坡主要森林类型及其群落结构特点 , 森林生态 系统研究 1 , 2 5一 42 .
〔3 〕 沈熙环 , 19 81 , 用同功酶研究欧洲赤松在有性无性萦殖下遗传结构 , 遗 传学报 , 8 , 3 , 2了5一 2 81 .
( 4 ) 杨一平 , 王述礼等 1 9 8 4 , 长 白山天然红松林 同功酶遗传变异的研究 . 1 . 阔叶红松林 困醉遗传 (油 印本 )
〔 6 〕 S o k a l , R . R . a o d F . J . R o h lf , 19 e 。 , B i。口 e t r y . W . H . F r o e m a n , S a n F r a o e is e o .
〔 6 〕 T ig e r s t e d t . P . M . A . , 10 7 4 , T h e a即 l se a t拓n o f o e o l o g j e a l g 。 。 e t ie p r i n e ip l e s o f f o re s t t r e e b r e e -
d i
n g
,
S i l v a e G e o e t
.
2 3 , 6 2一 6 6 .
〔 7 〕 N e i , M . , 一。 7 5 , M o le e u l a r p o p o l a t i o n g e n o t i e s a n d e v o lo t io o . N o r th一H o l la o d P u b l . C o . , A m e -
s t e r d
a断 A m e r i e a n E ls e r ie : , N e w Y o r k , O x f o r d ;
〔 8 〕 F e r o t 。 P . P . o n d F . B e r g功 a o n , 1。了6 : G e l e l e e tor p h o r o s i s o f p r o t a i n a n d e n z y m e . I n 0 0电r n
二 e ; il o d s i n f o r e s t g e n e t i e s , J . p . M i k s e h e , s p r i n g e r 一V e r l a g , N e w Y o r女 , B e r li o g , eH i d e l b e r g
·
P P 49一 7 7 .
〔 9 〕 F o w le r , D . p . a n d M o r r i s , R . W . , 19 77 , G e n e t i e d iv e r s i ty 三n r e d P又u o e v i d e n e e f o r lo w 日e 。元`
h e t e r o z了g o si t y . C a 。 : 丁, F o r e s t R o s . , 7 . 34 3一 34 7 .
G EN E IT C V A R IA T IO N
N A T U R A L F O R E S T O F
O F I SO E N Z Y M E I N
K O R E A N P IN E IN
C H A N G B A I M O U N T A IN S
— IN H E R IT A N C E O F E S T E R A S E I SO E N Z Y M E IN
K O R E A N P IN E S P R U R E
二
F I R F O R E S T A N D
G E N E T I C S T RU C T U R E O F E S T E R A S E
ISO E N Z Y M E IN K O R E A N P IN E
Y a n g Y i
一
P i n g Y i n R u i
一
x u e Z h a n g J u n 一 11
( I
n s t i t u t e o f F
o r e s t r y a n d 5 0 11
,
A
c a d e m i a S i n i e a )
A B S T R A C T
T h e i n h e r i t a n e e o f e s t e r a s e i s o e n z y m e i n K o r e a n P i n e ( K
o r e a n
p i n e
一
S P r u r e
一
F i r f o r e s t t y p e ) w
a s d e t e r m i n e d b y a n a n a l y s i s o f t h e s e
-
g r e g a t i o n p a t t e r n a m o n g t h e m e g a g a m e t o p h了t e s o f d o r m a n d s e e d c o l l e c t e过
万r o 平 i n d i v i礴林。 1 t r e e s ,
4 2 东 北 林 业 大 学 学 报 第4 1 卷
A t ota l of f u r ote e e s nte rasz e ym og ramP h e n oy tP e s ae rf ou ndi nse ed
f r om a ntu a r lP oP u la ti n o of K r oe a npi ne
一
SP u r re
一
Fi rf ore s t tp ye
.
N o
.
I 一 X lz ym og ra血 pi le n ov p tc e s onf orm ta n oa tu a r lp op u la ti n o of b ra od
le av ed K ore a npi e nf ore s t type bu t th e e re nw z ym og ram s N o
.
l!
,
X z
,
X l l a r e f o u n d
.
T h r e e g e n e l o e i
,
w h i e h o n z y m o g r a m s a r e a l s o d e t e e t e d
, a r e d e s i g n e d
a s E S T一A , E S T一 B , o r E S T一 C . H o w e v e r , t w o o f t h e s e l o e i a r e p o -
l y m o r p h i s m
.
I t 15 f o u n d t h a t E S T一A l o e u s p o s s e s s s i x d i f f e r e n t a l l e l e s ,
w h i e h a r e P h e n o t y p i e a l l y e x P r e s s e d i n o n e o r s e v e r a l b a n d s
.
T h r e e
拜1l e l e s w i t h t w o b a n d s o f E S T一 B l o e u s a r e f o u n d . T h e s e d a t a d e m o -
n s t r a t e f u r t h e r g e n e t i e P o ly m o r Ph i s m
`
P a t t e r n o f e s t e r a s e i s o e n z y m e i n
t h e m e g a g a m e t o p h y t e s o f n a t u r a l p o p u l a t i o n o f K o r e a n p i n e
.
H o w 弓v e r , o n l y o n e o f t h e s e l o e i ( E S T一 B ) s h o w s a r e l a t i v e l y h i g h
e n z y m e a e t i v i t y a n d s u f f i e i e n t b a n d i
n g r e p e a t a b i l i t y
.
T h e g e n o t y p e a t
t h e E S T一B l o e u s o f e a e h o f i n d i v i d o a l t r e e s i n t w o f o r e s t t y P e s 15
i d e n t i f i e d b jr m e g a g a m e t o p h y t e a n a l y s i s
.
T h
e o b s e r v o d g 眨n e t i e s t r u e t u r e
a t t h e E S T一 B g e n e l o e u s i n t w o f o r e s t t y P e s 15 p r e s e n t e d a n d e o m p a r e d
w i t h t h e ; c o r ` e , s p o n d i n g , 、 H a r d y 一w e i n b , r g p r o p o r t i o n s , z T h e
.
d a v i a t元o n s
b o t w e e o b o t h a r e v e r y s m a l l。