全 文 ：1999-09-13收到 , 1999-12-27接受。
国家自然科学基金资助项目(37670433 , 39790100)。本项工作在农
业部植物营养学重点开放实验室完成。
缺磷白羽扇豆排根与非排根区根尖分泌有机酸的比较
田中民1　李春俭1　王　晨2　赵紫娟1
(1中国农业大学农业部植物营养学重点开放实验室 , 北京 100094;2西北大学生物系 , 西安 710069)
摘要:采用根系分泌有机酸原位收集方法及高效液相
色谱技术分析了供磷及缺磷后不同时间白羽扇豆
(Lupinus albus L.)非排根区根尖和排根分泌有机酸的
种类和数量 , 以及相应的根尖 、排根组织 , 茎木质部 、
韧皮部汁液中有机酸含量的变化。结果表明:(1)缺
磷能够诱导白羽扇豆根系产生大量排根 ,根系的有机
酸分泌量也明显增加。(2)无论在供磷或缺磷条件
下 ,排根与非排根区根尖组织中的有机酸种类相同 ,但
排根主要分泌柠檬酸和苹果酸 , 而非排根区根尖主要
分泌苹果酸和乙酸。(3)缺磷后非排根区根尖分泌苹
果酸的量增加 ,至第 17 天达到高峰;排根开始分泌柠
檬酸的时间相对较晚。缺磷后排根分泌柠檬酸的量随
缺磷时间的延长不断增加。(4)在缺磷的排根与非排
根区根尖组织和茎木质部伤流液中含有大量柠檬酸和
苹果酸 ,但在茎韧皮部汁液中则几乎检测不到这两种
有机酸。上述结果表明 , 尽管排根和非排根区根尖组
织中的有机酸种类相同 , 但它们向外分泌的有机酸种
类不同。缺磷后排根及非排根区根尖增加向外分泌的
有机酸主要在根中合成。
关键词:白羽扇豆 , 有机酸 ,缺磷胁迫 , 排根
学科分类号:Q945
　　在缺磷条件下 ,白羽扇豆根系能够形成大量
的有限生长的侧根 ,这些侧根密集排列 ,并长满根
毛 ,从外观上看犹如一个个根簇 , 被称为排根
(Gardner 等 1981 , Dinkelaker 等 1989 , Gerke 等
1994),排根的重量可达根系总鲜重的 54%(Johnson
等1994);缺磷还可诱导排根分泌大量的柠檬酸和
苹果酸 ,其分泌量可高达植株干重的 11%～ 23%
(Braum 1995)。在排根区的根际 ,每克土壤中柠檬
酸的含量可达 50 ～ 88 μmol ,这一浓度足以活化土
壤中的Fe-P 、Al-P和 Ca-P , 以提高土壤中磷的有效
性(Gerke等 1994 ,Li等 1997)。Dinkelaker等(1989)
用X射线透视法测定了土壤中不溶性柠檬酸钙的
含量及其分布区域 ,结果表明柠檬酸主要是由植株
排根区分泌的。
尽管大量研究表明 ,缺磷后某些植物会通过增
加有机酸的分泌来改变根际环境 ,以获取更多的
磷 ,但关于根系有机酸分泌的调节 、分泌规律及所
分泌有机酸的来源研究很少 。 Johnson 等(1994)的
研究表明 ,缺磷后白羽扇豆排根组织中的磷酸烯醇
式丙酮酸羧化酶(PEPC)、苹果酸脱氢酶(MDH)和
柠檬酸合成酶(CS)的活性显著高于正常根系组
织 ,说明排根和正常根组织适应缺磷而对代谢过程
进行的调节方式有所不同。Hoffland 等(1990)的研
究也证明 , 缺磷诱导了油菜叶片中 PEPC活性显著
提高 ,并在叶片中伴随有大量的柠檬酸积累 。本文
用原位收集的方法研究缺磷白羽扇豆根系分泌有
机酸的部位 、有机酸的种类和数量 ,并进一步研究
根系有机酸的分泌规律及其可能来源 。
1　材料与方法
1.1　材料培养
挑选大小一致的白羽扇豆(Lupinus albus L.
cv.Amiga , Suedwestdeutsche Saatzucht , Rastat , Ger-
many)种子 ,用 10%的 H2O2 表面消毒 30 min ,清水
洗净后在饱和 CaSO4 溶液浸泡过的纱布上催芽 。
待种子露白后播入用 CaSO4 溶液浸泡过的石英砂
中。待两片子叶完全展开后 ,移入通气的营养液
中。营养液的 pH 为6.2 ,每3 d更换一次。幼苗在
光照 14 h/d ,光强 180 ～ 210μmol m-2 s-1 , 温度为
18 ～ 26℃的人工培养室中培养 。
营养液组成为(单位 mol/L):K2SO4 7.5 ×
10
-4 , MgSO4 6.5×10-4 , KCl 1.0×10-4 , Ca(NO3)2
2.0×10-3 , KH2PO4 2.5×10-4 , EDTA-Fe(Ⅱ)1.0
×10-5 , MnSO4 1.0×10-6 ,HBO3 1.0×10-5 , CuSO4
1.0×10-7 , ZnSO4 1.0×10-6 , (NH4)6Mo7O24 5×
10-9 。缺磷处理的营养液中不加 KH2PO4 ,用 2.5×
10-4mol/L 的KCl代替 。
1.2　根系分泌有机酸的原位收集及根组织中有机
酸的提取
在缺磷培养的第 3 、8 、13 、17 、22和 28天分别
用原位收集方法收集非排根区根尖 、排根组织分泌
的有机酸 ,同时切取相应的根尖(1 cm)和排根组织
各 0.1 g 在液氮中保存。
原位收集法首先准备直径为 5 mm 的层析滤
纸片 ,用甲醇清洗 3次后再用重蒸水清洗 3次 ,在
317植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(4):317 ～ 322
无菌条件下晾干备用 。收集时先将正常供磷和缺
磷的植物根系在去离子水中清洗数次 ,以除去根表
的营养液 ,然后将根系平放于铺有湿滤纸的瓷盘
中。在收集有机酸的非排根区根尖和排根组织下
方垫上 2 cm×2 cm的塑料胶片 ,然后在收集部位
根组织的上下方各放一个预先处理好的层析滤纸
片。其余根组织部分用湿滤纸片覆盖。最后用黑
塑料布将整个根系盖住 ,在光照下收集 2 h。各处
理重复5次 。
收集结束后将滤纸片放入 2.5 ml的试管中 ,
每10个滤纸片加 300μl重蒸水。根组织在测定前
加1 ml 5%的磷酸溶液均浆 ,经 12 000×g 离心 10
min后取上清液用于HPLC分析。
1.3　木质部及韧皮部汁液的收集
在白羽扇豆缺磷培养的第 28天收集木质部伤
流液及韧皮部汁液。木质部伤流液的收集采用薛
应龙(1985)的方法 ,在早晨 8 ～ 10时收集 2 h 。韧
皮部汁液的收集采用 King 和 Zeevaart(1974)的方
法。
1.4　有机酸的分离与鉴定
根组织提取液在 12 000×g下离心 10 min后 ,
取上清液用于 HPLC分析;根组织提取液及木质部
伤流 、韧皮部汁液在测定前均稀释 10倍 。
有机酸分离条件:使用岛津 LC-10A 高效液相
色谱仪 , 紫外检测器 SPD-10A ,流动相为 0.25×
10-3 mol/L 的 KH2PO4 , pH 为 2.25 , 流速为 0.7
ml/min ,柱温 26℃。有机酸的确定采用外标法 ,含
量的计算采用峰面积法。
1.5　植株生物量及磷含量的测定
在收集根分泌物的同时收获整个植物 ,从子叶
着生部位将植株分为地上部和根系 ,在 60℃下烘
干72 h后 ,分别称取干重。用史瑞和(1980)的方法
测定根及茎叶中的磷浓度 。
2　结果
2.1　排根的形成与植株发育
白羽扇豆在缺磷后第 13 天左右开始形成排
根 ,随着缺磷时间的延长 ,排根数目逐渐增多 ,在缺
磷后第28天排根鲜重可达根系总鲜重的 50%。此
阶段对照植株也有排根形成 ,但数量很少 ,排根区
的侧根不够密集 ,排根鲜重不到根系总干重的
10%(结果未列)。在缺磷后 28 d 的时间范围内 ,
植株地上部和根系生物量与对照相比没有明显差
异(图 1)。
图 1　缺磷对白羽扇豆根系及地上部干物重的影响
Fig.1　 Effects of P deficiency on shoot and root dry weights of
white lupin plants
2.2　根系及地上部磷浓度及其比值的变化
供磷植株根中的磷浓度明显高于地上部(图
2)。随着生长时间的延长 ,供磷植株中磷浓度不断
下降 ,其中地上部磷浓度的下降速率快于根系 ,使
根系与地上部的磷浓度之比加大(图 3)。在缺磷
条件下 ,随着生长时间的延长 ,根中的磷浓度下降
更快 ,使根系与地上部的磷浓度之比呈下降趋势 。
图 2　缺磷后不同时间白羽扇豆根系及地上部磷浓度变化
Fig.2 　 Changes in P concentration in shoot and root of white
lupin plants grown in nutrient solution with or without P supply
图 3　缺磷后白羽扇豆根系及地上部磷浓度比值的变化
Fig.3　 Changes of ratio of P concentration in shoot and root of
white lupin after P starvation
318 植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　26卷
2.3　根系分泌有机酸的 HPLC分析
白羽扇豆非排根区根尖分泌的有机酸主要为
苹果酸 、乙酸和富马酸 ,供磷和缺磷条件下分泌的
有机酸种类相同 ,但缺磷后苹果酸的分泌量有所增
加(图 4)。从不同取样时间看 ,缺磷的非排根区根
尖分泌的苹果酸一直多于供磷植株 ,缺磷后第 17
天苹果酸的分泌量达最大值(图5)。
图 4　缺磷 28 d 白羽扇豆非排根区根尖分泌的有机酸
Fig.4　 Exudation of different organic acids from tips of non-pro-
teoid roots of white lupin plants grown in nutrient solution with or
without P supply for 28 days
图5　缺磷后白羽扇豆非排根区根尖分泌苹果酸动态变化
Fig.5　Changes in rate of malic acid exudation from tips of non-
proteoid roots of P-deficient white lupin plants
　　排根分泌的有机酸以柠檬酸和苹果酸为主 ,缺
磷后柠檬酸的分泌量显著高于对照 ,而苹果酸的分
泌量变化不大(图 6)。从不同取样时间看 ,排根分
泌柠檬酸的量随着缺磷时间的延长而明显增加(图
图 6　缺磷 28 d 白羽扇豆排根分泌的有机酸
Fig.6　Rate of organic acid exudation from proteoid roots of white
lupin plants with or without P supply for 28 days
7)。综合上述结果 ,缺磷植株的非排根区根尖和排
根组织相比 ,非排根区根尖以分泌苹果酸和乙酸为
主 ,不分泌柠檬酸 ,而排根区以分泌柠檬酸和苹果
酸为主 ,不分泌乙酸 。
图 7　缺磷后白羽扇豆排根分泌柠檬酸动态变化
Fig.7 　 Changes in citric acid exudation from proteoid roots of
white lupin plants with or without P supply
2.4　根组织中有机酸的 HPLC分析
在白羽扇豆非排根区根尖组织中 ,有机酸以苹
果酸 、丙二酸 、柠檬酸和乙酸为主 ,并有极少量的富
马酸 。在供磷与缺磷条件下 ,组织中的有机酸种类
基本相同;但缺磷后 ,苹果酸 、丙二酸和柠檬酸的含
量有所增加 ,而乙酸含量明显减少(图 8)。
白羽扇豆排根组织中的有机酸种类与非排根
区根尖组织中相同 ,但缺磷后排根组织中的柠檬酸
含量明显增加 ,其余各有机酸浓度变化不大(图 9)。
图 8　缺磷 28 d 白羽扇豆非排根区根尖组织中的有机酸浓度
Fig.8　 Tissue concentration of organic acids in tips of non-proteoid
roots of white lupin plants on 28 days after P-deficiency treatment
图 9　缺磷 28 d 白羽扇豆排根组织中的有机酸浓度
Fig.9　 Concentration of organic acids in proteoid root tissue of
white lupin plants on 28 days after P-deficiency treatment
3194 期　　　　　　　　　　田中民等:缺磷白羽扇豆排根与非排根区根尖分泌有机酸的比较
2.5　木质部伤流液及韧皮部汁液中有机酸分析
从(图 10 、11)可以看出 ,缺磷后 28 d ,木质部伤
流液中的苹果酸和柠檬酸含量显著高于对照 。在
韧皮部汁液中只检测到极少量的苹果酸 ,而没有柠
檬酸(图 11)。
图 10　缺磷 28 d 对白羽扇豆木质部伤流液中有机酸浓度
的影响
Fig.10　Changes in concentration of organic acids in xylem sap of
white lupin plants grown with or without P supply for 28 days
3　讨论
以上结果表明 ,在缺磷条件下 ,随着生长时间
的延长 ,整个植株中的磷浓度迅速下降 ,其中根中
的磷浓度下降速率快于地上部 ,使得根与地上部的
磷浓度比值不断下降(图 3)。然而在缺磷后的 28
d时间内 ,尽管植物体内的磷浓度迅速下降 ,植株
生长基本没有受到影响(图 1)。说明在缺磷后的
这段时间内 ,子叶中贮藏的磷足以满足植株生长的
需要 。缺磷后单位磷素所产生的干物质增加(图
1 、2),表明磷的利用效率提高。
Gardner等(1981),Marschner等 (1986), Dinke-
laker等(1989)报告缺磷后白羽扇豆形成的排根数
量明显增加 ,这在我们的实验中也得到证实 。此外
我们还观察到 ,根系分泌的有机酸量也明显增加 ,
但排根与非排根区根尖组织分泌的有机酸种类有
明显差异 。正常供磷时 ,非排根区根尖主要分泌苹
图 11　韧皮部汁液和木质部伤流液中的有机酸分析
Fig.11　Analysis of organic acids in xy lem exudates and phloem saps
果酸和乙酸 ,缺磷后苹果酸的分泌量有所增加(图
4 、5)。排根主要分泌柠檬酸和苹果酸 ,缺磷后柠檬
酸的分泌量明显增加 ,苹果酸分泌量没有明显变化
(图 6)。由于柠檬酸主要由排根向外分泌 ,而缺磷
后植株形成的排根数量明显增加 ,所以就整个植物
而言 , 缺磷后根系分泌的柠檬酸量增加很多 。
Bloan等(1994)对苹果酸 、柠檬酸等 7种有机酸的
研究表明:在活化土壤磷的能力方面 ,三元羧酸>
二元羧酸>一元羧酸 。其中柠檬酸活化土壤中磷
的能力最强 ,而且还可以提高根际对铁 、锰的还原
能力。由于在排根区根际每克土壤中的柠檬酸浓
度可达 50 ～ 88μmol(Gerke 等 1994 , Li等 1997),因
而缺磷条件下根系增加柠檬酸的分泌对活化土壤
的磷具有重要的生态意义。
分析根组织中有机酸的种类和数量后可以看
出 ,非排根区根尖及排根组织中的有机酸种类基本
相同(图 8 、9),但非排根区根尖主要向外分泌苹果
酸和乙酸 ,排根主要分泌柠檬酸和苹果酸。即根组
织内的与向外分泌的有机酸种类不相同 ,这种分泌
是一种有选择的主动过程。已知磷是细胞质膜的
组成成份 ,缺磷会导致细胞质膜的透性增加(Rat-
nayake等 1978)。在本实验中 ,缺磷后非排根区根
320 植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　26卷
尖组织中的苹果酸 、丙二酸和柠檬酸含量增加(图
8),而排根组织中柠檬酸含量显著增加(图 9)。但
缺磷后非排根区根尖仅仅分泌苹果酸的量增加(图
5),排根则是分泌柠檬酸的量明显增加(图 6)。上
述结果说明 ,在本试验条件下 ,即使在缺磷条件下 ,
根组织向外分泌有机酸也是具有选择性的 ,说明这
一分泌是主动过程。已有研究证明 ,柠檬酸是以阴
离子的 形式通 过阴 离子 通 道向 外释 放的
(Dinkelaker等1989 , Johnson等 1996)。缺磷条件下 ,
施加阴离子通道抑制剂能够有效地抑制白羽扇豆
排根向外分泌柠檬酸(Neumann 等 1999)。但造成
不同部位根组织分泌有机酸种类差异的原因至今
尚不清楚 ,需进一步研究 。
缺磷后根系组织中的有机酸含量和向外分泌
的有机酸量增加的部分是由地上部合成还是在根
中合成 ?分析缺磷后木质部伤流液及韧皮部汁液
中有机酸的种类和数量可以看到 ,韧皮部中几乎检
测不到苹果酸和柠檬酸 ,缺磷后也基本没有变化
(图 11),但木质部中可检测到大量的柠檬酸和苹
果酸 ,而且缺磷后这两种有机酸在木质部中的浓度
都有明显增加(图 10)。根据这些结果可以推测 ,
缺磷后根组织中及增加向外分泌的有机酸不是由
地上部合成后运输下来的 。Neumann 等人(1999)
的结果表明 ,缺磷后白羽扇豆排根组织中柠檬酸含
量增加是由于根中柠檬酸生物合成增加及其代谢
减少的结果 ,因为缺磷后根中与非光合性CO2固定
有关的 PEPC活性明显增加 ,而与柠檬酸降解直接
有关的顺乌头酸酶活性明显下降。
参 考 文 献
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3214 期　　　　　　　　　　田中民等:缺磷白羽扇豆排根与非排根区根尖分泌有机酸的比较
Comparative Studies on Organic Acid Exudation by Tips of Proteoid and
Non-proteoid Roots of Phosphorus-deficient White Lupin
TIAN Zhong-Min1　LI Chun-Jian1　WANG Chen2　ZHAO Zi-Juan1
(1 Key Laboratory of Plant Nutrition from the Ministry of Agriculture , China Agricultural University , Beijing 100094;2Biology Department , North-West Univer-
sity , Xi an 710069)
Abstract:The present study was based on a non-
destructive method for collecting root exudates.
Organic acids exuded from tips of non-proteoid
and proteoid roots of white lupin (Lupinus albus
L.)grown in nutrient solution with or without P
supply were analyzed qualitatively and quantita-
tively by HPLC.Organic acids in root tissues ,
phloem sap and xylem exudate were also extracted
and analyzed.The results showed:1.More pro-
teoid roots were induced by P-deficiency stress in
white lupin.2.The same organic acids were
found in tissues of both proteoid and non-proteoid
roots (Figs.8 , 9).Malic acid and acetic acid
were the major organic acids excreted from the
tips of non-proteoid roots(Fig.4), while citrate
and malic acid were the major ones from proteoid
roots(Fig.6).Secretion of the organic acids by
both tissues was enhanced by P-deficiency.3.
Secretion of malic acid from the tips of non-pro-
teoid roots increased after the P-deficiency , and
reached the highest level on the 17th day (Fig.
5), while secretion of citric acid from the proteoid
roots began later , and increased steadily with the
prolongation of the P-deficient period (Fig.7).
4.Large mounts of malic and citrate acid were
found in tissues of P-deficient proteoid and non-
proteoid roots , as well as in xylem , while in
phloem saps almost no citrate and malic acids
were detected , even under the P-deficiency stress
(Figs.10 , 11).The results showed that , though
the organic acids in tissues of proteoid roots and
tips of non-proteoid roots were the same , the or-
ganic acids exuded by the two root tissues were
different.The increased amount of malic and cit-
rate acids in root tissues as well as that exuded
from roots to outside under the P-deficiency stress
were synthesized in roots themselves.
Key words:Lupinus albus L., organic acid , P deficiency , pro-
teoid roots
322 Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(4):317～ 322