全 文 ：响应面法优化烟草花超临界二氧化碳萃取工艺及香气分析
刘煜宇，李 仙，念小魁，普元柱，郑 琳
云南瑞升烟草技术（集团）有限公司，昆明市高新技术产业开发区海源北路1699号 650106
摘要：为了研究烟草花在烟草、香料、医药等方面的应用，以响应面法对烟草花超临界 CO2萃取工艺进行
了优化。以烟草花萃取率为响应值，根据 Box-Behnken Design（BBD）设计实验，确定各工艺条件对萃取
率的影响；采用气相色谱-质谱法对萃取物挥发性成分进行分析鉴定。结果表明：①烟草花的最佳超临
界 CO2萃取条件为：萃取压力 31.9 MPa，萃取温度 47.3 ℃，萃取时间 108.5 min。②烟草花超临界 CO2提
取物中共鉴定出 28种化合物，其中，含量最高的是 1,5,9-三甲基-12-（1-异丙基）-4,8,13-环十四碳三
烯-1,3-二醇（43.81%）。
关键词：烟草花；超临界 CO2萃取；响应面法；挥发性成分；气相色谱－质谱法
中图分类号：TS411 文献标识码：B 文章编号：1002-0861（2013）06-0045-05
作者简介：刘煜宇（1971—），硕士，工程师，主要从事天然香精香
料产品开发研究。E-mail：liuyvyv@126.com 电话：0871-8325388
收稿日期：2012-12-20
责任编辑：茹呈杰 E-mail：rucj69@sina.com
电话：0371-67672513
Optimization of Supercritical CO2 Fluid Extraction of Flowers of Nicotiana tabacum by Response
Surface Method and Analysis of Aroma Components
LIU Yuyu, LI Xian, NIAN Xiaokui, PU Yuanzhu, and ZHENG Lin
Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Co., Ltd., Kunming 650106, China
Abstract: Supercritical CO2 fluid extraction (SCFE) was optimized by response surface method (RSM) to study
the utilization of flowers of Nicotiana tabacum in tobacco, spice and medicine, etc. Taking the extraction yield
of flowers of Nicotiana tabacum as response value, the effects of technical conditions on the extraction yield
were determined by designing experiments according to Box-Behnken Design (BBD). The volatile components
in the extract were identified by GC/MS method. The results showed that: 1) The optimal extraction conditions
were: pressure 31.9 MPa, temperature 47.3 ℃ , and time 108.5 mins. 2) 28 components were identified, and
their contents were determined with peak area normalization method, among them, the component with the
highest content (43.81%) was 1, 5, 9-trimethyl-12-(1-methylethyl)-4, 8, 13-cyclotetradecatriene-1, 3-diol.
Keywords: Nicotiana tabacum; Supercritical CO2 fluid extraction (SCFE); Response surface method (RSM);
Volatile component; GC/MS
烟草科技 / Tobacco Science & Technology 2013 年第 6 期（总第 311 期）
烟 草 花（Nicotiana alata cv.）具 有 烟 草（Nicotiana
tabacum）的清新香气和自然风味，是一种天然植物香料［1-5］。
超临界萃取技术（Supercritical fluid extraction, SFE）特别
适合于生物活性物质和热敏性物质的分离提取，在天
然香料生产工业中得到了广泛的应用［6-8］。文献［9-15］
报道了利用超临界 CO2萃取技术（Supercritical CO2 fluid
extraction, SCFE）萃取啤酒花、白刺果油、芹菜籽精油和
苹 果 籽 油 等 的 研 究 。 响 应 面 法（Response surface
methodology, RSM）是一种优化反应条件和加工工艺参
数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程和食品
工业等方面［16-21］。迄今未见采用响应面法设计优化超
临界萃取烟草花的工艺并分析其挥发性香气成分的研
究报道。为此，以烟草花萃取率为考察指标，通过响应
面法优化确定了烟草花超临界 CO2萃取的最佳工艺条
件，并通过气相色谱 -质谱法分析和鉴定了挥发性成
分，旨在为烟草花在烟草、香料和医药等方面的进一步
开发应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
烟草花品种为红花大金元，取自云南大理。
烟草化学 / Tobacco Chemistry
45
CO2气体（食品级，纯度 99.5%，昆明梅塞尔公司）；
95%乙醇（食品级，云南汕滇药业有限公司）；无水硫酸
钠（AR，广东省汕头市西陇化工厂）；二氯甲烷（AR，天
津市博迪化工有限公司）。
HA221-50-06超临界流体萃取装置（江苏省南通市
华安超临界萃取有限公司）；Agilent 6890N/5975气相色
谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；HXC576血液冷藏
箱（青岛海尔特种电器有限公司）；PB5001-S电子天平
（感量：0.1 g，梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）；
R-3000旋转蒸发仪（瑞士 BUCHI公司）；SHZ-D（Ⅲ）循
环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 萃取
称取 500.0 g 烟草花，加入 50.0 g 95%乙醇为夹带
剂，按照响应面实验设计的条件［22］进行萃取，得到粗
品，经脱水、过滤等处理后得到黄绿色样品。设定其他
萃取条件为：
CO2流量：20 L/h；分离 I的压力：7~8 MPa，温度：45 ℃；分
离 II的压力：4~6 MPa，温度：35 ℃。
1.2.2 响应面法实验设计
根据有关资料和预备单因素实验，利用响应面法的
Box-Behnken Design（BBD）设计，以萃取压力、萃取温
度和萃取时间 3个因素为自变量，每个因素取 3个水
平，以-1, 0和+1编码，以烟草花的萃取率 Y为响应值进
行萃取工艺因素水平设计（表 1）。
萃取率的计算公式为：
烟草花的萃取率 =［烟草花萃取物质量（g）/原料质量
（g）］×100%
1.2.3 GC/MS分析［23-25］
称取 1.0 g样品，以 10 mL二氯甲烷溶解，加入适量
无水硫酸钠，置于 4 ℃冰箱脱水 12 h，过滤，滤液用气
相色谱-质谱联用仪进行检测。分析条件为：
色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进
样口温度：240 ℃；载气：He，流速 1.0 mL/min；恒压模式：
70 kPa；程序升温：50 ℃（1 min） 8℃ /min 160 ℃（2 min）
8℃ /min
260 ℃（15 min）；进样量：0.5 μL；分流比：25∶1；传输
线温度：280 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：
230 ℃；四级杆温度：160 ℃；扫描范围：35~455 amu；溶剂延
迟：2 min；检测模式：SCAN和 SIM同步。
所得图谱经计算机谱库（NIST05, Wiley275）检索，
并结合标准质谱图和有关文献［26-28］，确定挥发性成
分，用色谱峰面积归一化法测得各挥发性成分的峰面
积。
2 结果与讨论
2.1 响应面实验结果及分析
2.1.1 响应面实验结果
按照响应面法的 Box-Behnken Design（BBD）的实验
方案进行 3因素 3水平实验，结果见表 2。
表 2 实验设计及结果
Tab.2 Experimental design and results
实验方案的 15个实验点中包括 12个析因点（1~12）
及 3个中心点（13~15），中心点重复的目的是估计整个
实验的纯实验误差，以烟草花的萃取率 Y作为响应面分
析的响应值。
2.1.2 响应面实验结果分析
对表 2实验数据进行多元回归拟合，得到烟草花萃
取率（Y）对萃取压力（X1）、萃取温度（X2）和萃取时间
（X3）的二次多项回归方程模型为：
Y=-0.88751+0.016925X1+0.026525X2+3.16667×10-3X3+7.75000×
10-5X1X2-3.16667×10-5X1X3+2.33333×10-5X2X3-2.67917×10-4X12-
3.32917×10-4X22-1.50463×10-5X32
该二次回归方程方差分析结果和回归方程系数显
著性检验结果见表 3。3因素交互作用对烟草花萃取率
的响应面分析结果见图 1~图 6。
由表 3 和图 1~图 6 可以看出，该模型极显著（P<
0.01），失拟项不显著，说明未知因素对实验结果干扰很
小。模型的决定系数 R2为 0.9889，大于 0.9，说明模型能
水平
+1
0
-1
X1萃取压力 /
MPa
40
30
20
X2萃取温
度 /℃
55
45
35
X3萃取时间 /
min
120
90
60
表 1 实验因素水平编码
Tab.1 The level of experimental factors coding table
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
X1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
0
0
0
0
0
0
0
X2
-1
-1
+1
+1
0
0
0
0
-1
+1
-1
+1
0
0
0
X3
0
0
0
0
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
0
0
0
Y/%
0.095
0.112
0.103
0.151
0.092
0.138
0.151
0.159
0.114
0.116
0.127
0.157
0.173
0.176
0.177
46
方差
来源
模型
X1
X2
X3
X1X2
X1X3
X2X3
X12
X22
X32
残差
失拟项
纯误差
总和
总和
0.012
1.770×10-3
7.801×10-4
2.244×10-3
2.402×10-4
3.610×10-4
1.960×10-4
2.650×10-3
4.092×10-3
6.771×10-4
1.364×10-4
1.277×10-4
8.667×10-6
0.012
R2=0.9889
自由
度
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
3
2
14
均方
1.354×10-3
1.770×10-3
7.801×10-4
2.244×10-3
2.402×10-4
3.610×10-4
1.960×10-4
2.650×10-3
4.092×10-3
6.771×10-4
2.728×10-5
4.258×10-5
4.333×10-6
R2Adj=0.9690
F值
49.62
64.88
28.59
82.27
8.81
13.23
7.18
97.14
149.99
24.82
9.83
P值
0.0002
0.0005
0.0031
0.0003
0.0312
0.0149
0.0438
0.0002
<0.0001
0.0042
0.0938
显著
性①
**
**
**
**
*
*
*
**
**
**
表 3 回归方程模型的方差分析结果
Tab.3 Variance analysis results of the regression
equation model
图 4 萃取压力和萃取时间对萃取率的等高线
Fig.4 Contour map of extraction pressure and time on the
extraction rate
注：①*表示 P<0.05，模型或考察因素有显著影响；**表示
P<0.01，模型或考察因素有极显著影响。
图 1 萃取压力和萃取温度对萃取率的响应面分析
Fig.1 Response surface analysis of extraction pressure and
temperature on the extraction rate
图 2 萃取压力和萃取温度对萃取率的等高线
Fig.2 Contour map of extraction pressure and temperature
on the extraction rate
图 3 萃取压力和萃取时间对萃取率的响应面分析
Fig.3 Response surface analysis of extraction pressure and
time on the extraction rate
图 5 萃取温度和萃取时间对萃取率的响应面分析
Fig.5 Response surface analysis of extraction temperature
and time on the extraction rate
图 6 萃取温度和萃取时间对萃取率的等高线
Fig.6 Contour map of extraction temperature and time
on the extraction rate
47
解释烟草花萃取率响应值的变化。该模型与实际情况
拟合较好，可用于分析和预测超临界萃取烟草花的实
际情况。
由表 3 可知，一次项 X1, X2 和 X3 差异极显著（P<
0.01），二次项 X12, X22和 X32均达极显著水平（P<0.01），说
明萃取压力、萃取温度和萃取时间对烟草花萃取率有
极显著影响；交互项差异显著（P<0.05），说明 3因素交
互作用对烟草花萃取率有显著影响。
2.1.3 验证实验
为了进一步验证该模型以及测定的可靠性，对方程
最优条件（萃取压力 31.9 MPa，萃取温度 47.3 ℃，萃取
时间 108.5 min）进行 3次实验，烟草花萃取率的平均值
为 0.181%，与通过 Design Expert 7.1.1软件对经手动优化
后的回归方程求解得到的预测值 0.183%接近，这说明
该模型是较可靠的，响应面法适用于对烟草花的超临
界萃取工艺进行回归分析和参数优化。
2.2 烟草花萃取物的挥发性成分分析
烟草花萃取物的挥发性成分共鉴定出 28 种化合
物，经质谱数据库检测与标准图谱核对，利用峰面积归
一化法测定了各种成分的相对含量（表 4）。
表 4 烟草花挥发性化学成分
Tab.4 The volatile compositions in the perfume of Nicotiana alata cv.
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
保留时间 /min
5.370
7.657
8.145
9.892
11.014
11.416
11.493
11.596
12.195
12.277
12.354
12.512
12.628
12.709
12.748
12.846
13.210
13.330
13.570
13.698
13.878
14.114
14.221
14.315
14.529
14.897
15.861
18.653
化合物
苯乙醛 /Benzeneacetaldehyde
(1S)-α-蒎烯 /(1S)-α-Pinene
石竹烯 /Caryophyllene
十八醛 /Octadecanal
十九烷 /Nonadecane
棕榈酸 /n-Hexadecanoic acid
邻苯二甲酸二丁酯 /Dibutyl phthalate
棕榈酸乙酯 /Hexadecanoic acid, ethyl ester
寸拜醇 /Thunbergol
(1 α,2 α,3 α,5 α)-2,3-二甲基 -1,5-二乙烯基环己烷/(1 α,2 α,3 α,5 α)-1,5-Diethenyl-2,3-dimethyl-
cyclohexane
1- 甲 基 -1- 乙 烯 基 -2-(2- 甲 基 -1- 丙 烯 基 )-4- 亚 甲 基 环 庚 烷 /4-Methylene-1-methyl-
2-(2-methyl-1-propen-1-yl)-1-vinyl-cycloheptane
洋橄榄油酸 /(E)-9-Octadecenoic acid
(1R,2R,5R)-2,6,6-三甲基二环 [3.1.1]庚烷 /(1R,2R,5R)-2,6,6-Trimethyl-bicyclo[3.1.1]heptane
(－ )-二氢-新丁子香烯-(I)/(－ )-Dihydro-neoclovene-(I)
α-蛇床烯 (7CI)/α-Selinene(7CI)
西柏烯 /Cembrene
4-(5,5-二甲基-1-氧杂螺 [2.5]-4-辛基)-3-丁烯-2-酮/4-(5,5-Dimethyl-1-oxaspiro[2.5]oct-4-yl)-
3-buten-2-one
1,5,9-三甲基-12-异丙基-4,8,13-环十四碳三烯-1,3-二醇 /1,5,9-Trimethyl-12-(1-methylethyl)-
4,8,13-cyclotetradecatriene-1,3-diol
氧化石竹烯 /Caryophyllene oxide
14-甲基孕-4-烯-3,20-二酮 /14-Methyl-pregn-4-ene-3,20-dione
(1S,2E,4S,5R,7E,11E)-西柏 -2,7,11-三烯 -4,5-二醇 /(1S,2E,4S,5R,7E,11E)-Cembra-2,7,11-triene-
4,5-diol
2-甲基 -4-(1,3,3-三甲基 -7-氧杂二环 [4.1.0]-2-庚基)-3-丁烯 -2-醇/2-Methyl-4-(1,3,3-
trimethyl-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-2-yl)-3-buten-2-ol
(E,E,E)-3,7,11,15-四甲基 -2,6,10,14-十六碳四烯 -1-醇乙酸酯 /(E,E,E)-3,7,11,15-Tetramethyl-
2,6,10,14-hexadecatetraen-1-ol, acetate
(8S)-8,14-柏木烷二醇 /(8S)-14-Cedran-diol
苎烯双环氧化物 /Dipentene diepoxide
2-乙基吖啶 /2-Ethylacridine
(+ )-反式 -3,4-二甲基 -2-苯基四氢 -1,4-噻嗪 /(+ )-trans-3,4-Dimethyl-2-phenyltetrahydro-1,4-
thiazine
二乙基双 (三甲基甲硅烷基 )硅酸酯 /silicic acid, diethyl bis(trimethylsilyl) ester
相对含量 /%
0.26
0.18
0.01
0.07
0.03
0.23
0.22
0.14
6.54
1.41
0.81
2.89
0.68
1.90
1.00
1.05
5.92
43.81
2.30
0.50
4.17
2.83
3.04
4.00
6.56
1.29
1.00
0.05
48
3 结论
（1）通过响应面法得到萃取压力、萃取温度、萃取
时间对烟草花萃取率的二次多项回归方程模型，方差
分析说明该方程能很好地解释烟草花萃取率随各参数
变化的规律。
（2）优化后的最佳工艺条件为：萃取压力 31.9 MPa，
萃取温度 47.3 ℃，萃取时间 108.5 min；该条件下烟草花
萃取率为 0.181%。对最优实验条件进行验证表明结果
可靠。
（3）挥发性成分分析结果表明，超临界 CO2萃取工
艺制备的烟草花萃取物中含有大量的致香成分，如萜
类化合物、酸类和酯类等。
参考文献
［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会 . 中国植物志［M］．北
京：科学出版社，1997：162-167.
［2］ 王瑞新 . 烟草化学［M］. 北京：中国农业出版社，2003.
［3］ Davis D L, Nielsen M T. 烟草——生产，化学和技术［M］．
国家烟草专卖局科技教育局，中国烟草科技信息中心，译 .
北京：化学工业出版社，2003：253-266.
［4］ 赵铭钦 . 卷烟调香学［M］. 北京：科学出版社，2008：
144-145.
［5］ 张悠金，金博闻 . 烟用香精香料［M］. 合肥：中国科技大学
出版社，1996：52.
［6］ 曾锁林，丁焕文 . CO2超临界流体萃取的新进展［J］. 医疗卫
生装备，2009，30（2）：31-33.
［7］ 赵春海 . 超临界流体萃取技术原理及应用研究简述［J］. 生
命科学仪器，2006，4（12）：33-35.
［8］ 郭璇华，周丽屏 . 超临界流体萃取技术及其应用［J］. 现代
仪器，2006, 24（4）：18-20.
［9］ 于长青，阳辉文，陈磊，等 . 超临界二氧化碳流体萃取啤酒
花的工艺参数选择［J］. 甘肃农业大学学报，1999（2）：
15-19.
［10］ 朱芸，刘金荣，王航宇 . 超临界 CO2萃取与浸渍法提取白刺
果油化学成分的分析与比较［J］. 精细化工，2007, 24（3）：
239-242.
［11］ 李雪梅，周谨，张晓龙，等．超临界 CO2流体萃取与常规提
取方法制备芹菜籽精油的比较［J］. 精细化工，2004, 21
（8）：581-585.
［12］ 杨继红，李元瑞，蒋晶 . 苹果籽油的超临界 CO2萃取及其脂
肪酸含量分析［J］. 西北农林科技大学学报：自然科学版，
2007, 35（3）：195-199.
［13］ 张明福，张建平 . 烟草二氧化碳超临界萃取物的初步研究
［J］. 烟草科技，2001（8）：24-28.
［14］ 高勇，朱友民，吴庆之 . 烟草净油的超临界流体技术提取
［J］. 烟草科技，1995（5）：28-30.
［15］ Yang Y K, Li X M, Zhang X L. A study of the extraction of
tobacco with supercritical carbon dioxide［C］. Bucharest,
Romania： CORESTA Smoke Science and Product
Technology Meeting, ST06, 2003.
［16］ 王永菲，王成国．响应面法的理论与应用［J］. 中央民族
大学学报：自然科学版 . 2005, 14（3）：236-239.
［17］ 何祯，张生虎，刘子先，等 . 双响应曲面方法在改进产品设
计中的应用研究［J］. 系统工程理论与实践，2001, 9（3）：
140-144.
［18］ 杨文雄，高彦祥 . 响应面法及其在食品工业中的应用［J］.
中国食品添加剂，2005（2）：68-71.
［19］ 慕运动 . 响应面方法及其在食品工业中的应用［J］. 郑州
工程学院学报，2001, 22（3）：91-94.
［20］ 谭伟，丘泰球，阳元娥 . 响应面优化超声强化近临界 CO2萃
取葵花籽油工艺［J］. 中国油脂，2008, 33（6）：9-11.
［21］ 刘明芝，周仁郁 . 中医药统计学与软件应用［M］. 北京：中
国中医出版社，2003：220-226.
［22］ 何为，薛卫东，唐斌 . 优化试验设计方法及数据分析［M］.
北京：化学工业出版社，2012：218-250.
［23］ 谢剑平 . 烟草香料技术原理与应用［M］. 北京：化学工业
出版社，2009：146-148.
［24］ Hou Y，Yang L，Wang B X，et al. Analysis of chemical
components in tobacco flavors using stir bar sorptive
extraction and thermal desorption coupled with gas
chromatography-mass spectrometry［J］. Chinese Journal of
Chromatography, 2006, 24（6）：601-605.
［25］ 王玉，王保兴，武怡，等 . 卷烟化学指标的聚类分析［J］．
烟草科技，2007（2）：1-7.
［26］ 施钧慧，汪聪慧 . 香料质谱图集［M］. 北京：中国质谱学
会，1992.
［27］ Heller S R, Milne G W A. EPA/NIH Mass Spectral Data Base
［M］. Washington：US Government Printing Office, 1978：
1-46.
［28］ Bauer R. Quality criteria and standardization of
phytopharmaceuticals：Can acceptable drug standards be
achieved?［J］. Drug Information Journal, 1998, 32（1）：
101-110.
49