全 文 ：·食用菌· 北方园艺２０１５（１７）：１３２～１３６
第一作者简介：魏海莲（１９８９－），女，硕士研究生，研究方向为微生
物学。Ｅ－ｍａｉｌ：７７１４５３６６８＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：李翠新（１９７２－），女，博士，副教授，研究方向为微生物学
与森林保护学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｕｉｘｉｎｈｅｌｉ＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设资助项
目（５００９７５０５）；云南省应用基础研究计划资助项目（２０１１ＦＺ１４１）；
西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室开放基金资助项
目（ＫＬ２００７０７）；云南省高校特色专业建设点资助项目（５０１１６００１）。
收稿日期：２０１５－０５－２８
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５１７０３５
云南昭通野生紫丁香蘑群体的遗传多样性分析
魏 海 莲，刘 志 曦，张 婉 洁，何 　 德，李 翠 新，马 　 建
（西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明６５００００）
　　摘　要：以采自云南昭通的６６株野生紫丁香蘑（Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ，Ｌ．ｎｕｄａ）为研究对象，分析了
其ＩＴＳ序列及其单核苷酸多态性（ＳＮＰ）。结果表明：经结合形态和分子水平的鉴定，确定所采的
野生蘑菇为紫丁香蘑；６６个紫丁香蘑的ＩＴＳ序列长度变化范围为６６６～６７１ｂｐ，ＩＴＳ１为２４１～
２４４ｂｐ，５．８Ｓ为１５５ｂｐ，ＩＴＳ２为２６７～２７５ｂｐ，Ｇ＋Ｃ含量的变化范围为４１．５％～４２．４％，所有样本
的平均遗传距离为０．００３　０；通过序列比对，共筛选出７个ＳＮＰ位点，单突变位点３个，简约信息
位点４个；转换与颠换的比值Ｒ为０．６７２；该群体的核酸多态性指数Ｐｉ为０．００２　９１，每位点核苷
酸多态性指数Ｔｈｅｔａ（ｐｅｒ　ｓｉｔｅ　ｆｒｏｍ　Ｅｔａ）为０．００２　３６。采用邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ　ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）构建的系
统发育树分支支持率低，表明群体内各菌株遗传距离小，该群体的遗传多样性丰度较低。综上说
明云南昭通野生紫丁香蘑群体的遗传多样性水平很低，需要加强保护。
关键词：紫丁香蘑；ＩＴＳ；ＳＮＰ；遗传多样性
中图分类号：Ｓ　６４６．１＋９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１５）１７－０１３２－０５
　　紫丁香蘑（Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ）又名紫晶蘑、裸口蘑［１］。分
布于我国黑龙江、福建、青海、新疆、西藏、山西等地区。
可食用，菌肉厚，具香气，味鲜美，是优良食药用菌［２］。子
实体中含有人体必需氨基酸，维生素及矿质元素，具有
较高的营养价值。紫丁香蘑内含丰富的维生素Ｂ１、硬脂
酸、神经酰胺和麦角甾醇类化合物；其子实体提取物能
抑制癌细胞、病毒、并能调节机体正常的糖代谢，促进神
经传导［３－４］。用此菌所做的抗癌试验表明，对小白鼠肉
瘤１８０的抑制率为９０％，对艾氏癌的抑制率为１００％［５］。
为了保护和开发利用这一优良的食药用真菌资源，需要
进一步了解其群体结构、遗传多样性及其群体演化历
史，这对其保护与可持续利用具有重要意义。
遗传多样性是种质资源保护的核心，体现了物种对
环境变化的适应能力和开发利用的潜力。核糖体ＤＮＡ
内转录间隔区（ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ
ｓｐａｃｅｒｓ，ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ）是核糖体基因中位于核糖体１８Ｓ、
５．８Ｓ和２８Ｓ之间的转录间隔区的ＤＮＡ片段，包含被
５．８ＳｒＤＮＡ片段所分隔的ＩＴＳｌ和ＩＴＳ２两个片段。由于
转录间隔区内多为中性碱基突变，使得ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ受到
的选择压力较小，具有相对较快的进化速率，能为研究
真菌的分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息［６］。
单核苷酸多态性（ＳＮＰ）是指生物基因组水平上由单个核
苷酸的变异所引起的ＤＮＡ序列多态性［７］。ＳＮＰ是目前
所有分子标记中多样性最丰富的标记，是继以ＲＦＬＰ（限
制片段长度多态性）、ＳＳＲ（简单序列重复标记）为代表的
第一、二代分子标记之后的最新一代分子标记［８］。ＳＮＰ
能够广泛用于遗传多样性研究，对于资源保存、种质利
用有重要意义。
该研究对采自云南省昭通市昭阳区三甲村附近山
上的６６个样本进行群体ＩＴＳ序列测定和分析，通过单
核苷酸多态性（ＳＮＰ）研究了昭通紫丁香蘑群体ＩＴＳ序列
碱基群体内变异，构建系统发育树进行聚类与遗传多样
性分析。为菌种的选育、引种栽培、遗传多样性等研究
提供基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料为采自云南省昭通市昭阳区三甲村附近
山上的６６株野生紫丁香蘑，形态上初步判断为紫丁香
蘑（图１）。
２３１
北方园艺２０１５（１７）：１３２～１３６ ·食用菌·
　　　　
图１　云南昭通采集的野生紫丁香蘑
Ｆｉｇ．１　Ｌ．ｎｕｄａｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｚｈａｏｔｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ
１．２　试验方法
１．２．１　ＤＮＡ提取　采用ＣＴＡＢ法提取紫丁香蘑子实
体全基因组ＤＮＡ［９］。将ＤＮＡ溶于ＴＥ溶中，终浓度为
５０ｎｇ／μＬ，于－２０℃保存备用。
１．２．２　ＰＣＲ扩增及测序　用２×含染料高保真Ｔａｑ酶
预混ＰＣＲ反应体系（含优化浓度的ＧｅｎＳｔａｒ　ＨｉＦｉ　Ｔａｑ
ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋、反应缓冲液和稳定剂等
成分，北京康润诚业生物科技有限公司），利用真菌通用
引物ＩＴＳｌ（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ４
（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）扩增ｒＤＮＡ　ＩＴＳ片
段（引物由上海生物工程公司合成）。反应体系３５μＬ：
ＤＮＡ 模板１μＬ，ＩＴＳ１、ＩＴＳ４　０．７μＬ，２×ＨｉＦｉ　Ｔａｑ
ＰＣＲＳｔａｒＭｉｘ　１７．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１５．１μＬ。ＩＴＳ片段扩增反
应程序采用９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃退
火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３４个循环后，７２℃延伸８ｍｉｎ。
扩增得到的ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由
北京六合华大基因科技股份有限公司完成测序。为避
免误差所有片段采用双向测序。
１．２．３　序列分析　将测序所得序列用ＢｉｏＥｄｉｔ［１０］进行序
列查看；用Ｃｏｎｔｉｇ［１１］进行序列拼接并人工校正，在ＮＣＢＩ
数据库中进行ＢＬＡＳＴ搜索，在分子水平鉴定所得菌株情
况。用ＣｌｕｓｔａｌＸ［１２］进行序列比对，利用 ＭＥＧＡ　５．０５［１３］软
件分析碱基组成，计算群体平均遗传距离，用ＤＮＡｓｐ［１４］软
件分析确定ＳＮＰ位点，分析样本单核苷酸多态性。
１．２．４　聚类和遗传多样性分析　将菌株序列与从
ＧｅｎＢａｎｋ数据库中获得的其同科不同属的Ｃｏｌｙｂｉａ
ｃｉｒｒｈａｔａ（登录号ＤＱ８３０８０４）、Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ　ｄｅａｌｂａｔａ（登录号
ＪＦ９０７８０４）序列，运用Ｃｌｕｓｔａｌｘ软件进行序列排比，生成
Ｐｈｙｌｉｐ格式文件，使用Ｐｈｙｌｉｐ［１５］软件构建系统发育树。
用Ｓｅｑｂｏｏｔ程序优化系统树，通过自举分析（ｂｏｏｓｔｒａｐ）进
行置信度检测，自举支持率为１　０００次。序列间进化距
离根据Ｋｉｍｕｒａ－２参数遗传距离模型计算，用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ
程序（邻位相接法）构树。
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ提取、ＰＣＲ扩增及测序鉴定结果
由图２可知，提取时未特意除去ＲＮＡ，ＲＮＡ残留较
多。得到的野生紫丁香蘑菌株ＤＮＡ约２３　１３０ｂｐ，ＤＮＡ
电泳条带清晰，ＤＮＡ的纯度、浓度及产率都较高，可用于
ＰＣＲ扩增。
　　注：Ｍ为琼脂糖凝胶电泳的分子量标准。下同。
Ｎｏｔｅ：Ｍ　ｉｓ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｉｎ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｄｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ－
ｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．
图２　部分样品总基因组ＤＮＡ检测电泳图
Ｆｉｇ．２　Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
图３　部分ＩＴＳ扩增产物电泳图
Ｆｉｇ．３　Ｐａｒｔ　ｏｆ　ＩＴＳ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
由图３可知，ＰＣＲ产物分子量相同，长度在７００ｂｐ
左右。经测序后，所得序列在ＮＣＢＩ中Ｂｌａｓｔ，Ｂｌａｓｔ结果
ｈｉｔ中紫丁香蘑序列一致性达９９％，Ｅ　ｖａｌｕｅ（期望值）为０，
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·食用菌· 北方园艺２０１５（１７）：１３２～１３６
ＬＡＮＤＥＷＥＥＲＴ等［１６］认为通过ＩＴＳ序列比对，序列一
致性≥９９％，为相同种；序列一致性＞９５％，＜９９％，为相
同属；序列一致性≤９５％，为相同科。该试验Ｂｌａｓｔ结果
显示，供试菌株与紫丁香蘑的序列一致性达９９％，结合
形态上的鉴定，确定所采的野生蘑菇为紫丁香蘑。
２．２　ＩＴＳ序列分析
由表１可知，软件 ＭＥＧＡ　５．０分别对ＩＴＳ、ＩＴＳｌ、
５．８Ｓ、ＩＴＳ２序列的长度、４种碱基的含量、Ｇ＋Ｃ的含量
进行统计分析。由表１可以看出，ＩＴＳ长度有１２ｂｐ长
度的变化。ＩＴＳ序列中Ｇ＋Ｃ含量变化范围为４１．５％～
４２．４％，其中５．８ＳＧ＋Ｃ含量相对ＩＴＳ１，ＩＴＳ２较高。
ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２中碱基Ｔ含量都较高。ＭＡＧＥ　５．０计
算得出所有样本在内的遗传距离变化范围在０～０．００９　７
之间，平均遗传距离为０．００３　０。群体内各个体之间遗传
距离较小。
表１　紫丁香蘑ＩＴＳ序列长度及碱基组成
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ａｎｄ　ｂａｓｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｌ．ｎｕｄａｉｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ／ｂｐ
Ｃ／％ Ｇ／％ Ａ／％ Ｔ／％ Ｇ＋Ｃ／％
ＩＴＳ　 ６６６～６７１　２０．０～２０．３　２１．５～２２．１　２４．８～２５．７　３２．５～３３．０　４１．５～４２．４
ＩＴＳ１　 ２４１～２４４　１８．８～１９．３　２０．３～２１．０　２４．５～２５．２　３４．９～３６．０　３９．１～４０．３
５．８Ｓ １５５　 ２１．９　 ２３．２　 ２７．１　 ２７．７　 ４５．１
ＩＴＳ２　 ２６７～２７５　１９．８～２０．２　２１．３～２２．９　２３．５～２５．３　３３．６～３４．０　４１．１～４３．１
２．３　ＩＴＳ序列单核苷酸多态性（ＳＮＰ）分析
试验中ＨｉＦｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ的保真性能约为
普通Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ的３～４倍，错配率可降到
１０－６碱基／循环数，大大降低了ＰＣＲ扩增出错的可能性。
通过序列比对，共筛选出７个ＳＮＰ位点，３个为单突变
位点，４个为简约信息位点。
表２　紫丁香蘑ＩＴＳ序列变异位点与碱基替换
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　ｂａｓｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｌ．ｎｕｄａｉｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
保守位点
Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ
ｓｉｔｅｓ
变异位点
Ｖａｒｉａｂｌｅ
ｓｉｔｅｓ
简约信息位点
Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ
单突变位点
Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ
ｓｉｔｅｓ
转换碱基对
Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ
颠换碱基对
Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ
ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ
ＩＴＳ　 ６６１　 ７　 ４　 ３　 ２　 ５
ＩＴＳ１　 ２３７　 ４　 ２　 ２　 ０　 ４
５．８Ｓ １５５　 ０　 ０　 ０　 ０　 ０
ＩＴＳ２　 ２６４　 ３　 ２　 １　 ２　 １
　　由表２可以看出，ＳＮＰ位点均在ＩＴＳ１、ＩＴＳ２区段，
５．８Ｓ为保守序列，未发生单核苷酸突变现象。ＳＮＰ位点
中２个Ｃ／Ｇ颠换的位置分别在ＩＴＳ１区，ＩＴＳ２区，１个
Ａ／Ｃ颠换位点在ＩＴＳ１区，２个Ｇ／Ｔ颠换位点在ＩＴＳ１
区，２个Ｇ／Ａ转换位点在ＩＴＳ２区，ＩＴＳ序列中发生转换
与颠换的比值Ｒ为０．６７２。该群体的核酸多态性指数
Ｐｉ为０．００２　９１，每位点核苷酸多态性指数Ｔｈｅｔａ（ｐｅｒ　ｓｉｔｅ
ｆｒｏｍ　Ｅｔａ）为０．００２　３６，说明该群体的ＤＮＡ遗传多样性
的丰度较低。
　　注：树节点处数字标注为支持率，由１　０００次ｂｏｏｔｓｔｒａｐ估算，端点处
数字标注为菌株编号。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｄｉｇｉｔａｌ　ｍａｒｋ　ａｔ　ｎｏｄｅ　ｉｓ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｒａｔｅ，ｂｙ　１　０００ｂｏｏｔｓｔｒａｐ
ｅｓｔｉｍａｔｅｓ，ｅｎｄｐｏｉｎｔ　ｎｕｍｅｒａｌｓ　ｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ｎｏ．
图４　基于ＩＴＳ序列构建的ＮＪ系统发育树
Ｆｉｇ．４　ＮＪ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
２．４　聚类和遗传多样性分析
由图４可知，该群体各样本在系统树上基本可分为
Ａ、Ｂ两大分支，但支持率仅为３９．２％；Ａ又分为Ａ１、Ａ２
两支，但支持率也仅为３３．２％；以上几大支之内的分支
支持率更是偏低，有的甚至低至０．２％。支持率低说明
置信度低，也说明群体内各菌株的进化关系并不明显，
群体内各菌株之间遗传距离太小，进化树不能很好地反
４３１
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映该群体各菌株间的进化关系。结合以上对核苷酸多
态性的分析，进一步说明该群体内遗传多样性丰度低。
３　结论与讨论
紫丁香蘑作为珍稀的食药用真菌，国内外对紫丁香
蘑的研究主要集中在菌丝生物学特性［１７］、化学成分［１８］、
食药用价值［１９］、驯化栽培［２０］等方面的研究。分子研究
比较缓慢，国内外相关的研究较少，李萌伟等［２１］获得了
紫丁香蘑的最佳ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 反应体系（２５μＬ），包括
１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰ、０．１５μｍｏｌ／Ｌ引物、１６０ｎｇ模板ＤＮＡ，最佳反应
循环数为３７。其研究结果为进一步采用ＩＳＳＲ分子标记
方法研究紫丁香蘑的遗传多样性提供了研究基础。
ＬＥＥ等［２２］通过ＲＡＰＤ和ＩＴＳ序列分析了紫丁香蘑、肉
色香蘑和花脸香蘑的遗传变异。用ＲＡＰＤ分析分别计
算了１０株紫丁香蘑的种内遗传差异范围为０％～
２１．６％，１０株花脸香蘑种内遗传差异范围为１６．９３％～
２４．８２％，１０株肉色香蘑为２０．６２％～２５．５４％，花脸香蘑
和肉色香蘑的种间遗传差异为２３．４９％；基于ＩＴＳ１和
ＩＴＳ２区域测序分析了６株紫丁香蘑的种内遗传差异范围
为１．５８％～１１．４７％，紫丁香蘑和花脸香蘑种间遗传差异
为３．８３％～１２．８８％，紫丁香蘑和肉色香蘑７．１１％～
１５．６１％，花脸香蘑和肉色香蘑为４．７９％。研究结果显示，
ＲＡＰＤ和ＩＴＳ测序可以用于开发分子遗传标记和不明香
蘑属物种的筛选。
该研究中紫丁香蘑群体内平均遗传距离为０．００３　０，
遗传距离变化范围为０～０．００９　７，遗传距离较近。由于
采样地点较为集中，群体样本内的遗传多样性丰度也较
低，因此该地区紫丁香蘑在采集过程中应关注种质保护
问题，切勿过度滥采，否则极易造成资源的枯竭。紫丁
香蘑群体间遗传多样性的研究目前尚鲜见报道。因而
对紫丁香蘑群体遗传多样性，不同居群间的遗传多样性
更深入的研究，对这一珍稀食药用菌的进一步开发利
用，种质资源的保护具有重要意义。
参考文献
［１］　陈士俞．食用菌生产大全［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９８８．
［２］　谢支锡，王云，王柏，等．长白山伞菌图志［Ｍ］．长春：吉林科学技术出
版社，１９８６．
［３］　陈士瑜，陈惠．菇菌栽培手册［Ｍ］．北京：科学技术文献出版社，２００３．
［４］　ＹＡＮＧ　Ｓ，ＨＡＮ　Ｊ　Ｙ，ＪＯＯ　Ｅ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ
ｅｘｔｍｃｔｓ　ｆｒｏｍＬｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｋｏｒｅａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ
Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏ，２００５，３（３４）：３１７－３２２．
［５］　ＫＩＭ　Ｓ　Ｄ，ＫＩＭ　Ｊ　Ｈ，ＫＩＭ　Ｊ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｌｅｐｉ－
ｓｔａ　ｎｕｄａａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｋｏｒｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ－
ｏｇｙ，２００５，３（６）：４２．
［６］　史全良，赵卫国．桑树ＩＴＳ序列测定及特点的初步分析［Ｊ］．蚕业科
学，２００１，２７（２）：１４０－１４１．
［７］　ＦＲＵＤＡＫＩＳ　Ｔ，ＶＥＮＫＡＴＥ　Ｓ　Ｋ．Ａ　ｃｌａｓｓｉｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ＳＮＰ－ｂａｓｅｄ　ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ
ａｎｃｅｓｔｒｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，４８（４）：７７１－７８２．
［８］　ＧＡＯ　Ｚ　Ｘ，ＹＡＮ　Ｌ，ＷＡＮＧ　Ｘ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｏｄｉｕｍ　ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ（ＳＮＰ）ａｌｅｖｉ－
ａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＮａＨＣＯ３ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｆｒｏｍ
ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ［Ｊ］．Ａｆｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，１１（２７）：６９７４－
６９８２．
［９］　吴发红，黄东益，黄小龙，等．几种真菌ＤＮＡ提取方法的比较［Ｊ］．中
国农学通报，２００９，２５（８）：６２－６４．
［１０］ＨＡＬＬ　Ｔ　Ａ．ＢｉｏＥｄｉｔ：ａ　ｕｓｅｒ　ｆｒｉｅｎｄｌｙ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｅｄｉｔｏｒ
ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｗｉｎｄｏｗｓ　９５／９８／ＮＴ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
Ｓｅｒｉｅｓ，１９９９，４１：９５－９８．
［１１］ＷＡＮＧ　Ｌ，ＲＯＯＳＩＮＣＫ　Ｍ　Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｒｅｖｅａｌｓ　ａ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｐａｔｅｒｎ　ｏｆ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，６１（４－５）：６９９－７１０．
［１２］ＬＡＲＫＩＮ　Ｍ　Ａ，ＢＬＡＣＫＳＨＩＥＬＤＳ　Ｇ，ＢＲＯＮＷ　Ｎ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ
ａｎｄ　ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００７，２３（２１）：２９４７－２９４８．
［１３］ＫＵＭＡＲ　Ｓ，ＮＥＩ　Ｍ，ＤＵＤＬＥＹ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．ＭＥＧＡ：ａ　ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ－ｃｅｎｔｒｉｃ　ｓｏｆｔ－
ｗａｒｅ　ｆｏｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｂｒｉｅｆｂｉｏｉｎ－
ｆｏｒｍ，２００８，９（４）：２９９－３０６．
［１４］ＬＩＢＲＡＤＡ　Ｐ，ＲＯＺＡＳ　Ｊ．ＤｎａＳＰ　ｖ５：Ａ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ａｎａｌ－
ｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｄａｔａ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５（１１）：１４５１－１４５２．
［１５］ＰＬＯＴＲＥＥ　Ｄ，ＰＩＯＴＧＲＡＭ　Ｄ．Ｐｈｙｌｉｐ－ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｐａｃｋａｇｅ
（ｖｅｒｓｉｏｎ　３．２）［Ｊ］．Ｊ　Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ　Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ，１９８９，５（１）：１６４－１６６．
［１６］ＬＡＮＤＥＷＥＥＲＴ　Ｒ，ＬＥＥＦＬＡＮＧ　Ｐ，ＫＵＹＰＥＲ　Ｔ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉ－
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｃｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｍ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｈｏｒｉｚｏｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（１）：３２７－３３３．
［１７］谢富刚，刘雁英，邱慧兰．紫丁香蘑菌丝体生物学特性研究初报［Ｊ］．
现代农业科技，２０１０（２）：７２－７６．
［１８］高锦明，董泽军．紫丁香蘑的化学成分［Ｊ］．中草药，２００２，３３（５）：３９８－
４０１．　
［１９］周峰，王瑞娟，李玉，等．珍稀食药用菌紫丁香蘑的研究进展［Ｊ］．食用
菌学报，２０１０，１７（４）：７９－８３．
［２０］赵婷．紫丁香蘑菌丝体培养特性及人工驯化栽培研究［Ｄ］．延边：延
边大学，２０１０．
［２１］李萌伟，李芳菲，樊志宏，等．紫丁香蘑ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的正交优
化与建立［Ｊ］．生物技术，２０１３，２３（６）：５５－５９．
［２２］ＬＥＥ　Ｙ　Ｓ，ＫＩＭ　Ｎ　Ｗ，ＫＩＭ　Ｊ　Ｂ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｒｅ－
ｇｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｌｅｐｉｓｔａｎｕｄａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｋｏｒｅａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１２，２２（１１）：１４７０－１４７６．
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｌｄ　Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　Ｆｒｏｍ　Ｚｈａｏｔｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ
ＷＥＩ　Ｈａｉｌｉａｎ，ＬＩＵ　Ｚｈｉｘｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｗａｎｊｉｅ，ＨＥ　Ｄｅ，ＬＩ　Ｃｕｉｘｉｎ，ＭＡ　Ｊｉａｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５００００）
５３１
·中草药· 北方园艺２０１５（１７）：１３６～１４０
第一作者简介：闫芳（１９８０－），女，陕西宝鸡人，硕士，副教授，现主
要从事药用植物栽培等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｇｏｄ＿ｆｏｒｅｖｅｒ＠１６３．
ｃｏｍ．　
责任作者：王勤礼（１９６６－），男，甘肃永昌人，硕士，教授，现主要从
事蔬菜育种及中草药栽培教学与科研工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｑｉｎｌｉ６６
＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：甘肃省自然科学基金资助项目（１３０８ＲＪＺＧ１５６）；河西学
院２０１３年度河西学院科研创新与应用校长基金资助项目。
收稿日期：２０１５－０５－２５
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５１７０３６
不同处理对祖师麻基源植物黄瑞香
种子萌发特性的影响
闫 　 芳１，王 勤 礼１，毛 著 鸿２，张 亚 娟１
（１．河西学院 河西生态与绿洲农业研究院，甘肃 张掖７３４０００；２．甘肃泰康制药有限责任公司，甘肃 武威７３３０００）
　　摘　要：以黄瑞香种子为试材，通过对黄瑞香种子形态和萌发特性的研究，寻找打破种子休
眠、提高种子萌发率的适宜条件。观察种子外部形态，对黄瑞香种子千粒质量、饱满度、含水量、
生活力和吸水率等多项指标进行测定，对黄瑞香种子分别进行化学物质处理、低温层积和热水处
理，分析不同层积时间、不同质量浓度化学物质、不同萌发介质处理对种子萌发率的影响。结果
表明：黄瑞香种子含水量为７．１２％，带外种皮的种子吸水率为３３．４％，去除外种皮的种子吸水率
为６０．３％；化学物质处理和热水处理不能完全打破黄瑞香种子休眠；化学物质结合低温层积处理
７０ｄ种子萌发率为６４．９３％；平纸床和皱纸床介质上的发芽率分别为６５．８％和５３．２％。种皮不是
限制种子萌发的主要因素，用２００ｍｇ／Ｌ　ＧＡ３和２５ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ混合溶液浸种１０ｈ后结合７０ｄ低
温层积处理可显著提高种子萌发率，种子萌发最佳发芽介质为平纸床。
关键词：祖师麻；种皮；吸水率；萌发率
中图分类号：Ｓ　６８５．９９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１５）１７－０１３６－０５
　　黄瑞香（Ｄａｐｈｎｅ　ｇｉｒａｌｄｉ　Ｎｉｔｓｃｈｅ．）属瑞香科瑞香属
灌木，其根皮和茎皮为民间治疗风湿和止痛的常用中药
　　　　
祖师麻。经科学验证与临床试验，其味辛、苦，性温，具
有止痛散瘀、风湿痹痛之功效，主用于治疗抗肿瘤活性、
抗溶血活性、牙痛、跌打损伤、风湿关节痛、肝区痛等诸
多痛症［１－２］。黄瑞香主要分布在甘肃、陕西、青海、宁夏、
四川等海拔２　０００ｍ的山坡灌丛、林缘、沟谷地带［３］。黄
瑞香的野生资源较少，人工栽培技术尚未成熟。目前对
黄瑞香的研究多集中在其茎皮的化学成分和活性成
分［４－７］等方面研究，但有关黄瑞香生物学特性及萌发条
件的研究和报道极少。黄瑞香种子的外种皮木质化，种
皮的透水性和透气性较差，故其种子休眠时间长、发芽
率低，很难满足大面积人工栽培种苗的需求。该试验以
　　
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ　ｆｒｏｍ　Ｚｈａｏｔｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｂｊｅｃｔ，ｉｔｓ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ：ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｗｉｌｄ　ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ａｓ　Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ；６６ｓｔｒａｉｎｓ　Ｌ．ｎｕｄａ’ｓ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｅｎｇｔｈ
ｗａｓ　６６６－６７１ｂｐ，ＩＴＳ１：２４１－２４４ｂｐ，５．８Ｓ：１５５ｂｐ，ＩＴＳ２：２６７－２７５ｂｐ；Ｇ＋Ｃ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　４１．５％－４２．４％；ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗａｓ　０．００３　０．Ｂｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，ｓｅｖｅｎ　ＳＮＰｓ　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ：ｔｈｒｅｅ　ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ
ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｔｅｓ，ｆｏｕｒ　ｐａｒｓｉｍｏｎｙ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ；ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　０．６７２．Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎｄｅｘ　Ｐｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　０．００２　９１．Ｅａｃｈ　ｓｉｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎｄｅｘ　Ｅｔａ　ｗａｓ　０．００２　３６．
Ｎｅｉｇｈｂｏｒ（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｌｏｗ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｃｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｌｏｗ．Ｉｎ　ｓｕｍｍａｒｙ，ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｚｈａｏｔｏｎｇ　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｌｏｗ　ｓｏ　ｔｈａｔ　ｉｔｓ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ
ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｅｐｉｓｔａ　ｎｕｄａ；ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒｓ（ＩＴＳ）；ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰｓ）；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
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