全 文 ：中原牡丹花黄酮定量方法的研究
程源斌，*樊金玲，张鹏飞
（河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003）
摘要：借助于紫外扫描，通过对氯化铝显色法、硝酸铝—亚硝酸钠显色法和直接测定法3种比色方法与高效液相色
谱法测定结果的对比和方法评价的研究，确定了直接测定法（测定波长为350 nm） 是一种操作简单、结果较准确的
方法。以芦丁为标准品，可用于中原牡丹花黄酮含量的快速测定。
关键词：中原牡丹；黄酮；紫外扫描；直接测定法
中图分类号：Q946.91文献标志码：A doi：10.3969/jissn.1671-9646（X）.2011.10.026
DeterminationMethodsofFlavonoidsfromZhongyuanTreePeony
ChengYuanbin，*FanJinling，ZhangPengfei
（College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang，Henan 471003，China）
Abstract：Based on the UV-visible scanning spectra，several methods are selected to determine the content of flavonoids in
zhongyuan tree peony. Through the comparison of test methods and the evaluation of test method，the direct measuring method
(at 350 nm) is established for the quantitative analysis of total flavonoids in Zhongyuan tree peony. This method is thought to be
a simple，accurate and rapid one.
Keywords：zhongyuan tree peony；flavonids；UV-visible scanning spectra；direct measuring method
0 引言
常用于黄酮化合物的定量方法主要有分光光度
法、薄层扫描法和高效液相法。实验室中对于同一
类活性成分总含量的测定普遍采用分光光度法，测
定黄酮物质的分光光度法主要有硝酸铝—亚硝酸钠
显色法、氯化铝显色法和直接测定法。但不同方法
受到的干扰因素差别较大，且不同原料中黄酮物质
的种类也千差万别，对显色剂的反应表现出一定的
差异性，甚至一些黄酮物质不具备反应所要求的特
征结构。因此，需要建立一个适合中原牡丹花黄酮
总含量的简便测定方法。
本文以高效液相色谱法测定结果为标准，比较
直接测定法、氯化铝显色法和硝酸铝—亚硝酸钠显
色法，确定合适的中原牡丹花黄酮比色定量方法，
并进行方法评价。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与设备
试验试剂：乙醇、石油醚、甲醇、乙腈和磷酸，
均为分析纯；芦丁为标准品，蒸馏水自制。
试验仪器：101—2A 型电热鼓风干燥箱，天津
市泰斯特仪器有限公司提供；DZF—6050B型真空干
燥箱，巩义市予华仪器有限公司提供；SHZ—D—Ⅲ
型循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂产品；
SY3200—T型超声波清洗器，上海声源超声波仪器
设备有限公司提供；HH—S型数字显示恒温水浴锅，
江苏金坛市亿通电子有限公司提供；FA/JA型电子天
平，上海上平仪器公司提供；RE—52型旋转蒸发仪，
上海亚荣生化仪器厂产品；2800型紫外—可见分光光
度计，上海尤尼柯仪器有限公司提供；AGILENt—1100
型高效液相色谱仪，美国惠普公司提供。
试验材料：中原牡丹花（香玉、中秋月光、黄
金轮、银红巧对、洛阳红、春归华屋、墨剪绒和海
黄），洛阳市土桥花木种苗有限公司提供。
1.2 试验方法
1.2.1 中原牡丹花中黄酮的提取及处理
称取100 mg的牡丹干花瓣破碎后，放入15 mL
试管中。然后向试管中加入10 mL的体积分数1%盐
酸甲醇溶液[1]，室温下浸泡18 h，取出再进行超声波
收稿日期：2010-05-13
作者简介：程源斌（1986- ），男，安徽人，在读硕士，研究方向：天然产物开发利用。E-mail：bingo516@163.com。
*为通讯作者：樊金玲（1973- ），博士，副教授，研究方向：天然产物开发利用。
文章编号：1671-9646（2011） 10-0097-04
第10期（总第259期） 农产品加工·学刊 No.10
2011年10月 Academic Periodical of Farm Products Processing Oct.
农产品加工·学刊 2011年第10期
辅助提取2 h，置入离心机在转速3 500 r/min下离心
20 min，取其上清液备用。
1.2.2 牡丹花中黄酮测定波长的确定
将不同的测定方法的反应液进行紫外—可见扫描。
直接测定法全波长扫描见图1，氯化铝显色法全
波长扫描见图2，硝酸铝—亚硝酸钠显色法全波长扫
描见图3。
图1 直接测定法全波长扫描
图2 氯化铝显色法全波长扫描
图3 硝酸铝—亚硝酸钠显色法全波长扫描
1.2.3 牡丹花中黄酮的定量测定
（1） 比色法。氯化铝比色法[2]：取 1 mL黄酮物
质提取液置于15 mL的试管中，加入9 mL的体积分
数0.1 mol/L氯化铝溶液，摇匀后反应10 min，然后
在波长400 nm处测定。以芦丁作为标准品，制标准
曲线，回归方程：
Y400=0.027 4X+0.006 4，R2=0.999 3，
式中：X——芦丁质量浓度，μg/mL；
Y——对应的吸光度。
直接测定法[3]：取1 mL黄酮提取液置于试管中，
然后稀释100倍，摇匀，在波长350和270 nm下测
定。以芦丁做标准品，制标准曲线，回归方程：
Y350=0.0306X+ .0091，R2=0.9996；
Y270=0.0309X+0.011 6，R2=0.998 7，
式中：X——芦丁质量浓度，μg/mL；
Y——对应的吸光度。
（2） HPLC测定法。流动相：A 液，水；B 液，
0.1%磷酸；D液，乙腈。
HPLC测定法洗脱方案见表1。
表1 HPLC测定法洗脱方案
柱温：35℃，进样量10 uL，在波长350 nm处
测定。以芦丁做外标，计算牡丹花黄酮的总量。
Y=2.922 27X+1.141 58，R2=0.999 9，
式中：X——芦丁质量浓度，μg/mL；
Y——对应的峰面积。
（3） 直接测定法的方法评价。直接测定法的稳
定性试验。取1 mL“大棕紫”黄酮提取液（质量浓
度38.06 mg/mL），用甲醇精确稀释一定倍数，分别
在0，10，20，30，60，90，120，240 min时，测定
其 A350，二次重复。
直接测定法的加样回收试验。取已知含量的“大
棕紫”黄酮提取液 （质量浓度 0.658 3 mg/mL）
l mL，共 5 份，分别加入质量浓度 0.1 mg/L芦丁甲
醇溶液1，1，2，2，3，3 mL，摇匀后精确稀释一定
倍数，直接测定法测定其 A350nm。
直接测定法的重现性试验。取已知含量的牡丹
花黄酮提取液（质量浓度0.653 8 mg/mL），共6份，
用甲醇精确稀释一定倍数，直接测定法测其 A350nmm。
2 结果与讨论
2.1 测定波长的确定
分别对标样（芦丁） 和8种不同品种的牡丹花
瓣提取液，用不同的显色方法反应后，在波长
200~700 nm进行紫外—可见扫描。
氯化铝显色法标准曲线见图4，直接测定法标准
曲线（波长350 nm处） 见图5，直接测定法标准曲
线（波长270 nm处） 见图6。
时间 t/min A液/% B液/% D液/%
流速
/mL·min-1
0～5
6～10
11～25
26～40
75
65
60
45
20
20
20
20
5
15
20
25
1
1
1
1
98· ·
2011年第10期
从图4~图6的扫描结果可以发现，芦丁与多数
牡丹花黄酮的吸收峰位置有不同层次的差别：
（1） 直接测定法 （图 4）：本次试验在波长
350 nm和270 nm处芦丁与多数牡丹花黄酮都出现了
吸收峰，且扫描曲线的的趋势基本一致，故可选用
波长270，350 nm作为测定波长。
（2） 氯化铝显色法（图5）：芦丁与多数牡丹花
黄酮在波长270nm和400nm处也出现了吸收峰，但
有可能由于其他物质的影响，较多牡丹品种提取液在
270 nm左右出现了肩峰。而在 400 nm 左右芦丁和
8种牡丹花黄酮吸收峰吻合性很好，为了兼顾芦丁和
牡丹花黄酮的吸收峰，选择波长400 nm测定。
（3） 硝酸铝—亚硝酸钠显色法（图6）：目前该
方法较多用于食品和中草药测定黄酮物质。但试验
发现，牡丹花黄酮物质在波长390~700 nm内没有吸
收峰，这说明牡丹花中的黄酮物质可能不具有该显
色法所要求的化学基团[4]。
将各个品种的中原牡丹花提取液按1.2.3（1） 的
测定方法进行含量测定，并比较各个比色方法结果
与HPLC结果的相关性。
分光光度法、HPLC测定牡丹花黄酮的结果比较
见表2，直接测定法270 nm处与HPLC测定法的相
关性见图7，氯化铝显色法400 nm处与HPLC测定
法的相关性见图 8，直接测定法在 350 nm 处与
HPLC测定法的相关性见图9。
表2 分光光度法、HPLC测定牡丹花黄酮的结果比较
图7 直接测定法270 nm处与HPLC测定法的相关性
图8 氯化铝显色法400 nm处与HPLC测定法的相关性
图9 直接测定法在350 nm处与HPLC测定法的相关性
品种
AlCl3显色法 直接测定法
HPLC测定
A400nm A350nm A270nm
中秋月光
黄金盏
香玉
黄金轮
金玉交章
种生黄
黄花葵
池塘晓月
银红巧对
胭脂红
洛阳红
春归华屋
大棕紫
墨剪绒
8.73
8.14
10.97
9.02
7.47
9.16
8.62
6.50
6.81
6.94
7.03
7.23
7.21
13.98
9.57
8.95
13.79
10.29
7.84
10.73
8.93
7.24
8.53
9.02
8.28
8.40
8.92
16.57
22.12
23.15
25.97
22.96
23.35
25.68
27.04
22.12
22.73
27.91
35.39
30.95
22.15
39.82
14.74
13.07
20.88
15.51
11.48
14.17
12.44
11.44
11.58
13.28
12.99
12.86
12.18
23.06
注：表中数据单位均为mg/100 mg干花瓣。
程源斌，等：中原牡丹花黄酮定量方法的研究
图4 氯化铝显色法标准曲线
图5 直接测定法标准曲线（350 nm处）
图6 直接测定法标准曲线（270 nm处）
99· ·
农产品加工·学刊 2011年第10期
通过这 3 种比色法的测定结果与 HPLC 的定量
结果的相关性的比较，发现在波长270 nm处的测量
结果均远大于其他方法的测定结果，经分析有可能
是杂质影响较大。而直接测定法在波长350 nm处的
测定结果同HPLC测定结果相关性较好（R2=0.9508）。
因此，利用直接测定比色法在波长350 nm处的测定
结果再除以校正系数0.686，基本上能反映出中原牡
丹花总黄酮的真实含量。
2.3 直接测定法的方法评价
2.3.1 稳定性试验结果
4 h内A350变化见表3。
表3 4 h内A350 nm变化
由表 3 可知，直接测定法测定结果比较稳定，
4 h内吸光度基本不变。
2.3.2 加样回收试验结果
加样回收试验测定结果见表4。
从表4可以看出，回收率较高，平均回收率达
到98.23%，说明该放的准确性较高。
2.3.3 重现性试验结果
直接测定法 A350nm的重现性见表5。
由表5可知，直接测定法重现性较好，精密度
较高，RSD为0.5%。
3 结论
（1） 借助于紫外扫描，发现Al（NO3）3显色法不
适合中原牡丹花黄酮含量的测定。确定了直接测定法
测定牡丹花黄酮含量的较合适波长为270，350 nm，
AlCl3显色法的合适波长为400 nm。
（2） 通过对几种比色方法的紫外可见扫描结果
的对比分析，直接测定法在波长350 nm处测定结果
的稳定性好，重现性好，加样回收率也较高，并与
HPLC测定结果有较好的相关性（R2=0.950 7）。
（3） 直接测定法（测定波长为350 nm） 是一种
操作简单、结果较准确的方法，以芦丁为标准品，
可用于中原牡丹花黄酮含量的快速测定。其标准曲
线方程为：
Y350= 0.025 4X-0.004 7，R2=0.999 5，
式中：X——芦丁质量浓度，μg/mL；
Y——对应的吸光度。
通过比较分析，得到二者的校正系数为0.686。
参考文献：
Liang-sheng Wang，Fumio Hashimoto，Aya Shiraishi，et al.
Chemical taxonomy of the Xibei tree peony from China by
floral pigmentation [J] . J Plant Res，2004，117：47-
55.
谭仁祥. 植物成分分析 [M] . 北京:科学出版社，2002.
吴文珊，纪小苹，王扬飞，等. 荔枝叶及花序托中总黄
酮的提取工艺 [ J] . 植物资源与环境学报，2000，9
（2）：55-56.
任顺成. 玉米须黄酮类的分离、纯化、结构鉴定及生物
活性研究 [D] . 无锡：江南大学，2004.
试验号
取样量
对照品
加入量
实测值 回收率
平均
回收率
RSD
m/mg m/mg m/mg /% /% /%
1
2
3
4
5
6
0.6583
0.6583
0.6583
0.6583
0.6583
0.6583
0.1
0.1
0.2
0.2
0.3
0.3
0.7147
0.7425
0.8536
0.8536
0.9443
0.9443
97.48
97.58
99.29
99.29
97.87
97.87
98.23 8.36
时间
t/min
0 10 20 30 60 90 120 240
A350 0.379 0.379 0.38 0.379 0.382 0.382 0.382 0.381
时间
t/min
1 2 3 4 5 6
平均
值
RSD
/%
A350nm0.387 0.385 0.376 0.379 0.374 0.380 0.380 0.5
[1]
[2]
[3]
[4]
中国蚕业 （季刊）
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表5 直接测定法A350 nm的重现性
表4 加样回收试验测定结果
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