全 文 ：　 　第 37卷　第 3期
1998年　 5月
中山大学学报 (自然科学版 )
ACTA　 SCIEN TIARUM　 N ATURALIUM
UNIVE RSITATIS　 SUNYATSENI
　
Vo l. 37　 No . 3
May　 1998
　
金鱼草 Del基因影响烟草花色素苷的研究
沈亚楠　余迪求* * 　岑　川　李宝健
(中山大学生物工程研究中心 , 广州 510275)
摘　要　采用根癌农杆菌介导法 , 获得转 Del基因的转基因烟草植株 . 对 9株可能的转基因
植株 ( T0代 ) DN A进行 N P TⅡ基因的 PCR-Southern blo t杂交分析 , 其中 8株显示 N PTⅡ基
因阳性 . 对其中 5株开花的阳性植株进行 Del DNA的 PCR-Southern blo t杂交分析 , 全部显示
Del DNA阳性 . Km抗性 T1代转基因植株 DN A进行 Del DN A的 PCR-Southe rn blo t杂交分
析 ,结果显示全部含有 Del DNA. 在 530 nm处测量 T0代转基因植株中花色素苷含量和分布情
况 , 3株转基因烟草的花萼、 花冠和雄蕊部位花色素苷含量增加 , 而在雌蕊和叶中减少 . 在一
定程度上验证了 Del基因的生物学功能 , 证实并补充了 Goodrich等关于色素沉积模式的论述 .
关键词　Del基因 , 烟草 , 花色素苷
分类号　 Q 75
高等植物花色素苷生物合成的调控基因可分为 2种类型 [1 ]: Myc型转录因子 ,如玉米的
R基因家簇和金鱼草 Del基因 [ 2, 3] ; 另一类为 myb型转录因子 , 如玉米的 C1、 Pl和 P基
因 [1 ] . Go ff等 [4 ]认为这 2类转录因子相互作用激活结构基因的转录 . Lio yd已将这 2类来源
于玉米的转录因子导入烟草和拟南芥菜 , 并证实 R基因家簇成员 Lc基因能增强烟草和拟
南芥的色素沉积 [5 ] .
金鱼草 Del基因能调控金鱼草红色花色素苷生物合成基因表达 [3 ] .现已证实: Del基因
在花瓣和雄蕊等部位有强烈表达 , 而在花萼和子房等部位表达微弱 , 在叶、 茎、 苞片等部
位未见表达 . Del基因的转录表达与花色素苷的沉积密切相关 . Del基因和 R基因产物具
有类似的转录因子螺旋 -环 -螺旋的保守区域 [3 ] . 因此 , 有学者推测: Del基因影响花色素苷
生物合成途径 ,改变基因表达 ,可能在色素模式的发育方面起着重要作用 [3 ] . 然而 ,金鱼草
Del基因在调控其他植物花色素苷生物合成基因表达和色素沉积等方面是否具有一定作
用 ,目前尚不知晓 .本文报道将金鱼草 Del基因转入烟草细胞 ,观察到转基因植株花色素苷
沉积模式发生改变 .
1　方　法
1. 1　转基因烟草的获得
参照常规叶盘共培养法 [6 ]进行 . 获得抗性转基因小苗后 , 经生根 , 移栽到土壤中 .
中山大学基础性前沿 ( 211工程 ) 资助项目　　* * 通讯联系人
收稿日期: 1997-08-28　　沈亚楠 , 男 , 27岁 , 硕士研究生
1. 2　转基因烟草的 PCR- So rthern blot分子杂交检测
参照 Doyle等 [7 ]的 CT AB法提取烟草叶片 DNA. 设计下列 PCR引物: ① N PT Ⅱ基因:
5’ -G AGGCTAT TCGGCT ATGACTG-3’和 5’ -ATCGGGAGCGGCGAT ACCGT A-3’ ; ②
Del基因: 5’ -AGT TCCCATCAGT TGGT TCT TG-3’和 5’ -TCGGAATCCAAACTT AGT-
CGTC-3’ . PCR扩增系统按下列程序进行: 反应体系在 72℃反应 2 min后 , 即开始循环 ,
93℃变性反应 1 min, 50℃退火反应 1 min, 72℃延伸反应 3 min. 经过 35个循环后 , 在
进行最后 1个循环时 , 72℃延伸反应增加至 5 min. 反应结束后 , 于 4℃保存 . 电泳检测
后 , 采用真空转移系统 , 将 DNA转移至尼龙膜上 . 杂交程序及其洗膜 , 曝光等步骤按常规
方法 [8 ]进行 .
1. 3　转基因烟草生长发育和花色素苷的抽提及测定
观察转基因烟草在生长期和开花期的形态变化 ,对花的各部位即花萼、花冠和冠筒、雄
蕊、 雌蕊以及靠近花的叶片抽提花色素苷 . 抽提方法如下: 将剪下的各个样品分别浸泡于
酸性甲醇 (d( HCl)= 1% ) , 4℃振荡 48 h. 离心 , 取上清液 , 在日本 SHIM ADZU公司 UV
- 2201型分光光度计上进行扫描分析 , 并且分别在 530 nm和 657 nm处测量光密度 ( A ) .
测量 A时 , 在每个 4 mL容积的待测玻璃比色杯中分别倒入 100 mg叶块、花萼、 花冠和冠
筒、 雄蕊和雌蕊抽提液 . 然后用公式 A530 - 0. 25 A657计算花色素苷在 530 nm处的实际 A
值 [9 ] .
2　结　果
2. 1　 T0代抗性转基因植株的获得
经根癌农杆菌 LBA 4404 ( pAL 4404: pJAM 175) 与烟草叶片共培养 3 d后 , 将烟草
叶片转移至筛选培养基上 . 筛选 2～ 3周后 , 叶片切口处可见愈伤组织形成和芽的分化 . 2
个月后小芽长至 2～ 3 cm高 , 切下小芽并转入生根培养基 , 3周后开始生根 , 6周以后形成
发达根系 . 移栽 4个月后 , 陆续开花并结实 .
图 1　 PCR(N P TⅡ )扩增呈
阳性的样品电泳分析
Fig. 1　 Electropho resis o f samples of
positiv e PCR (N P TⅡ ) am plifica tion
a从 p JAM 175中扩增出来的 N P TⅡ基因片段 ;
b～ i依次为 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8号转基因植株
图 2　转基因植株的 PCR(N P TⅡ )
-Southern blo t杂交分析
Fig. 2　 PCR(N P TⅡ ) -Southern
blo t analysis of transgenic plants
a从 pJAM175中扩增出来的 N P TⅡ基因片段 ;
b～ i依次为 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8号转基因植株
18 中山大学学报 (自然科学版 ) 　　　　　　　　　　　　　第 37卷
2. 2　 T0代抗性转基因植株 PCR- Southern blot分子杂交检测
2. 2. 1 N PT Ⅱ基因的 PCR- Southern blo t分子杂交检测　在 9株可能的转基因植物中 ,
有 8株可以扩增出 700 bp左右的 DNA片段 . 用 N PT Ⅱ基因作探针杂交 , 显示阳性杂交
带 . 个别非特异性片段不能与 N PTⅡ基因探针杂交 (图 2) .
2. 2. 2　Del基因的 PCR-Southern blo t分子杂交检测　在 5株转基因抗性植株 ( 3, 5, 6, 7,
8号 )的基因组 DNA中 ,可全部扩增出 720 bp左右的 DNA片段 .经 Del基因的探针杂交 ,
全部显示阳性杂交带 (图 3) .
图 3　 T0代转基因植株 DNA的
PCR(Del ) -Southern blo t杂交检测
Fig. 3　 PCR(Del ) -Southern blo t analysis
of t ransgenic plants T0
a从 p JAM 175中扩增出来的 del基因片段 ; b
pJAM 175; c未转化植株 DN A的 PCR扩增 ,作
为负对照 ; d～ h依次是 3, 5, 6, 7, 8号转基因植株
2. 3　 T0代转基因烟草的形态变化
和对照烟草比较 , 多数转基因烟草生长缓
慢 . 移栽 1个月以后 ,非转化烟草生长旺盛 ,而
许多转基因烟草在抽出几片新叶之后逐渐枯
黄 , 茎部粗化 , 在开花之前死亡 . 最后仅获得 5
株开花的转基因植株 ,分别编号为: 3, 5, 6, 7,
8号 .
开花期间 , 5株转基因烟草花冠颜色与对
照植株相比呈多样性 ,其中 2株植株颜色相近 ,
3株植株颜色加深 .特别是 7号转基因植株 ,在
其花冠表面的裂片区域 , 色素沿脉络走向明显
加深 .
2. 4　 T0代转基因烟草花器官和叶的花色素苷
　　　含量
从表 1可以看到各个测量结果 . A校可以真
实反映花色素苷的 A530 , 出现负值的测试项目
可以认为该部位不含花色素苷 .在烟草叶片中 ,
转基因植株的花色素苷含量比对照植株分别低 2～ 4倍 . 在花萼部位 , 转基因植株 5, 6, 7
和 8号植株中都出现花色素苷 , 而对照和 3号植株的花萼中不含有花色素苷 . 在花冠和冠
筒部位 ,转基因植株 5, 6和 7号 的花色素苷含量是对照的 2倍或 2. 5倍 , 3号和 8号略低 .
在雄蕊部位 , 转基因植株花色素苷含量是对照 2～ 3倍 . 而在雌蕊部位 , 转基因植株的花色
素苷含量极低甚至没有 .
3　讨　论
高等植物叶绿体内主要存在叶绿素和类胡萝卜素 . 叶绿素吸收光谱的最强吸收区有 2
个: 一个波长为 640～ 660 nm的红光部分 , 另一个在波长为 430～ 450 nm的蓝紫光部分 .
公式 A校 = A530 - 0. 25 A657可以排除它们及其降解产物在 530 nm处的影响 [9 ] . 类胡萝卜素
只吸收蓝紫色光 , 其吸收高峰在 420～ 480 nm处 , 对 530 nm的光照吸收基本上没有干
扰 [9 ] . 另外 , 光吸收强度、 光照时间、 温度和生理状态都对花色素苷含量有一定影响 [ 9] . 但
在开花期间 , 所有植株均放置在同一个温室中 , 光照和温度等因素对花色素苷含量的影响
基本上一致 .
19第 3期　　　　　　　　　沈亚楠等: 金鱼草 Del基因影响烟草花色素苷的研究
表 1　转 Del基因烟草的植株花器官和叶的 A值1)
Tab. 1　 Th e A va lue o f th e flowe r and leave from the transgenic Del gene tobacco plants
植株部位 吸光值 对　照 3　号 5　号 6　号 7　号 8　号
叶
A530 0. 213 0. 227 0. 257 0. 286 0. 321 0. 285
A657 0. 531 0. 728 1. 046 0. 909 1. 197 0. 973
A校 0. 080 0. 045 - 0. 005 0. 059 0. 022 0. 042
平均偏差 0. 003 0. 004 0. 002 0. 004 0. 003 0. 004
花　萼
A530 0. 036 0. 082 0. 071 0. 114 0. 100 0. 114
A657 0. 214 0. 358 0. 216 0. 398 0. 373 0. 417
A校 - 0. 018 - 0. 008 0. 017 0. 015 0. 007 0. 010
平均偏差 0. 004 0. 003 0. 005 0. 004 0. 003 0. 002
花冠和
冠　筒
A530 0. 241 0. 178 0. 427 0. 524 0. 589 0. 194
A657 0. 016 0. 034 0. 009 0. 038 0. 035 0. 037
A校 0. 237 0. 170 0. 425 0. 515 0. 580 0. 185
平均偏差 0. 004 0. 005 0. 003 0. 004 0. 003 0. 011
雄　蕊
A530 0. 057 0. 153 0. 110 0. 162 0. 165 0. 114
A657 0. 062 0. 149 0. 109 0. 151 0. 150 0. 114
A校 0. 042 0. 116 0. 083 0. 124 0. 128 0. 086
平均偏差 0. 002 0. 004 0. 004 0. 003 0. 002 0. 004
雌　蕊
A530 0. 056 0. 019 0. 011 0. 026 0. 032 0. 017
A657 0. 100 0. 065 0. 064 0. 084 0. 098 0. 055
A校 0. 031 0. 003 - 0. 005 0. 005 0. 008 0. 003
平均偏差 0. 005 0. 003 0. 004 0. 003 0. 005 0. 002
1) A校= A530- 0. 25A657
实验结果表明: 转基因烟草 5, 6和 7号植株在花萼、 花冠和雄蕊等部位的花色素苷沉
积增加 ,在叶和雌蕊部位却明显降低 ,由此说明 ,金鱼草 Del基因影响着烟草花色素苷生物
合成基因的表达调控和花色素苷沉积模式 . 这些结果与 Goodrich等 [3 ]的工作基本相吻合 .
Goodrich等 [3 ]曾证实 , 金鱼草花器官的花萼、 花瓣、 雄蕊、 子房、 花柱等部位均有 Del基
因表达 ,而在叶和苞片中不表达 . Lio yd等 [ 5]曾把单子叶植物玉米的 2个花色素苷调控基因
R家簇的 Lc和 C1分别导入烟草和拟南芥菜中 , C1基因没有引起任何表型变化 , 而 Lc基
因却导致两种植物的花冠、冠筒和雄蕊中红色花色素沉积加深 . R基因产物和 Del基因产物
都属于 myc型转录因子 [1 ] ,彼此具一定的同源性 , Lc( R )基因产物和 Del基因蛋白质同源程
度达 38% [3 ] . 因此 , 花色素苷生物合成调控基因不仅影响花色素苷生物合成途径中结构基
因表达 , 而且在空间 (不同部位 ) 上也有其限定因素 .
英国 John Innes研究所 Carpenter R博士和罗达博士赠送金鱼草 Del基因 , 谨此致谢 .
参 考 文 献
1　余迪求 , 李宝健 . 花色素苷生物合成和发育调控 . 植物生理学通讯 , 1997 ( 1): 71
2　 Ludwig S R, Haera L F, Dellapo r ta S L , et a l. A member o f the maize R gene family r esponsible
fo r tissue-specific anthocyanin production, encodes a pr otein similar to transcriptional activa to rs
and contains the myc-homo lo gy reg ion. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 7092～ 7096
20 中山大学学报 (自然科学版 ) 　　　　　　　　　　　　　第 37卷
3　 Goodrich J, Ca rpenter R, Coen E S. A common regula tes pigmenta tion pa ttern in div erse plant
species. Cell, 1992, 68: 955～ 964
4　 Go ff S A , Cone K C, Chandle r V L. Functional ana ly sis o f the tr ansriptional activ ato r encoded by
th e maize B gene: evidence fo r a direct functional inte raction betw een tw o classes o f regulato ry
pr oteins. Genes Dev , 1992, 6: 6964～ 875
5　 Lloyd A M , Walbo t V , Davis R W . Arabidopsis and nico tiana anthocyanin production activ ated by
maize regula to r s R and C1. Science, 1992, 258, 1773～ 1775
6　赵荣敏 , 范云六 , 石西平 , 等 . 获得高抗虫转双基因烟草 . 生物工程学报 , 1995, 11 ( 1): 1～ 5
7　 Doy le J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA f resh tissue. Focus, 1988, 12: 13～ 15
8　 Sambrood J, F ritsch E F, Mania tis T. Mo lecula r cloning , a labora to ry manual. 2nd ed. New
Yo rk: Co ld Spring Harbour Labor ato ry Press, 1989
9　 Gerates A G M, Bussard J, Coe E H J, et al. Influence o f B and pl on UDPG: flavonoid 3-o-Glu-
co sy ltransfera se in Zea mays L. Biochem Genet, 1984, 22: 1161～ 1169
Study on the Effect of Del Regulatory Gene of
Antirrhinum majus on Anthocyanin of Tobacco
Shen Yanan 　Yu Diqiu　Cen Chuan　Li Baojian
Abstract　 The transgenic Del gene tobacco plants w ere obtained by co-cul tiva tion wi th
Agribacterium tumefacience LBA4404 ( p JAM 175) . Successful t ransfo rmation of N PTⅡ
gene to tobacco plants o f T0 generation w as demonst rated by PCR-Southern blo t hybridiza-
tion in 8 o f 9 putativ e transgenic plants. And then, successful t ransfo rmation of Del cDN A
to tobacco plants o f T0 generation was also demonst ra ted by PCR-Southern blo t hybridiza-
tion in all of 5 f low ering plants ca rrying N PTⅡ gene. Fur thermore, the assay o f PCR-
Southern blot hybridization demonst ra ted the integ ration of Del gene in the genome o f
kanamycin-resistant plants o f T1 genera tion. The abso rbance o f the ex t racts f rom the
t ransgenic plants of T0 generation w as measured at 530 nm. In 3 transgenic plants, pig-
ment ex t ractions f rom sepals, petals and stamens all accumula ted mo re anthocyanin than
the control plants. But carpels and leaves did less. To some ex tent, the resul ts show ed the
biological functions of Del gene and demonst ra ted and supplemented the conclusion on pig-
menta tion pat tern mode by Goodrich et al.
Keywords　Del cDN A, tobacco, anthocyanin
21第 3期　　　　　　　　　沈亚楠等: 金鱼草 Del基因影响烟草花色素苷的研究
Bio tech no lo gy Research Center , Zhong shan Univ er sity , Guang zhou 510275, China