全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 3期，第 451-455页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.3, 451-455
研究报告
Research Report
蜻蜓凤梨 FT1基因克隆与植物表达载体构建研究
雍伟 1 徐立 2 胡珊娜 1 张学全 1 李志英 2*
1海南大学园艺园林学院,海口, 570228; 2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部华南热带作物基因资源与种质创制重点开放
实验室,儋州, 571737
*通讯作者, xllizhiying@vip.163.com
摘 要 为了研究凤梨科植物开花的机理，本研究利用 5RACE和 3RACE方法从蜻蜓凤梨中克隆得到响
应开花的主要调控基因 FT1。该基因 CDS序列全长为 625 bp。为了进一步研究其功能，本研究将其重组并
构建了以 CaMV35S为启动子、GUS为报告基因的植物表达载体 CaMV35S-GUS-FT1，并采用农杆菌介导
的方法转化云烟 K346烟草的幼嫩叶片，经 GUS组织化学染色观察转基因烟草体细胞中 GUS报告基因的
表达情况。研究结果验证了重组构建的 FT1基因载体的正确性，为进一步解析 FT1基因在蜻蜓凤梨开花过
程中的功能奠定了基础。
关键词 烟草, FT1基因,植物表达载体,蜻蜓凤梨
Construction of Plant Expression Vector of FT1 Gene from Aechmea
fasciata
Yong Wei 1 Xu Li 2 Hu Shanna 1 Zhang Xuequan 1 Li Zhiying 2*
1 College of Horticulture and Landscape, Hainan University, Haikou, 570228; 2 Tropical Crops Genetic Resources Institute, Ministry of Agriculture
Key Laboratory of Tropical Crops Genetic Research and Germplasm Enhancement in Southern China, Danzhou, 571737
* Corresponding author, xllizhiying@vip.163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000451
Abstract In order to investigate the mechanism of bromeliads, we cloned Flowering Locus 1 (FT1), a key gene
response to flowering using 5RACE and 3RACE methods from Aechmea fasciata. The full length of FT1 CDS is
625 bp. After that, we constructed CaMV35S-GUS-FT1 and transferred it into tobaccos by Agrobacterium-mediated
transformation method. Using GUS histochemical staining we found the FT1 gene was successfully expressed
in transgenic plants. Our results may lay foundation for the further studying of the function and application of
FT1 gene.
Keywords Tobacco, FT1 gene, Plant expression vector, Aechmea fasciata
收稿日期：2014-01-07 接受日期：2014-02-23 网络出版日期：2014-05-12
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/1979
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31372106)资助
蜻蜓凤梨有广阔的市场前景，然而蜻蜓凤梨无
论是自然开花还是人工催花都存在不同程度的花期
不一致的问题(信彩云和李志英, 2009)。解决这一实
际问题，提高催花质量，对于促进蜻蜓凤梨的产业发
展具有重要意义。目前已知的调控植物开花的途径
主要有四种，分别是光周期途径、春化途径、自主途
径和赤霉素途径(袁秀云等, 2010)。在模式植物拟南
芥(Arabidopsis thaliana)中发现一种重要的调控基因
FLOWER LOCUS T (FT)在诱导植物开花中起关键作
用(Shigeru and Koji, 2011)。FT 基因在叶片中转录
合成mRNA并翻译成蛋白质，通过韧皮部运输到茎
尖(Laurent et al., 2007)，从而引起 LFY、AP1 等下游
花分生组织决定基因的表达来促进开花基因的表
达，最终导致植物开花(Lin et al., 2007)。目前凤梨科
作物中的 FT基因尚未见报道。
本研究通过 RACE技术从蜻蜓凤梨中克隆到一
个拟南芥 FT的同源基因 FT1，通过转基因烟草愈伤
组织、叶片中 GUS基因的表达和转基因植株分子验
证来验证构建的 FT1基因植物表达载体的有效性，
为进一步研究该基因功能和深入应用奠定了基础。
1结果与分析
1.1蜻蜓凤梨总RNA的提取质量
本研究中提取的蜻蜓凤梨叶片总 RNA质量较
好，其凝胶电泳结果如图 1所示。
图 1蜻蜓凤梨叶片总 RNA电泳结果
注: M: DL2000 marker; 1:蜻蜓凤梨叶片 RNA
Figure 1 RNA of Aechmea fasciata leaf
Note: M: DL2000 marker; 1: RNA of Aechmea fasciata leaf
图 2蜻蜓凤梨 FT1基因全长
注: M: DL2000 marker; 1: FT1基因全长
Figure 2 Full length of Aechmea fasciata FT1 gene
Note: M: DL2000 marker; 1: Full length of FT1 gene
后用限制性内切酶 XbaⅠ和 SmaⅠ酶切重组质粒。检
测结果显示，重组质粒 PMD-18T-FT1酶切后形成 2
条带，其大小分别为 2 692 bp和 625 bp，和预期的结
果相吻合。利用胶回收试剂盒，分别将含有目的基因
625 bp和载体 14 050 bp的条带进行割胶回收，然后
利用 T4连接酶将 2个回收后的条带连接起来形成
表达载体 CaMV35S-GUS-FT1。用特异性引物进行菌
液 PCR检测，电泳结果显示：获得了 625 bp大小的
片段(图 3)。这同样和预期的结果相吻合，结果说明
蜻蜓凤梨 FT1基因的植物表达载体 CaMV35S-GUS-
FT1已经构建成功。
1.4烟草遗传转化效果的 GUS组织化学染色检测
分别剪去对照和转基因烟草的叶片，加入 GUS
染色液置于 37℃培养箱染色 6 h，染色后倒掉染色
液，用分析醇进行脱色，然后分别将其置于体视镜下
拍照，观察正常对照和转基因烟草叶片的 GUS组织
化学染色结果。结果显示正常对照烟草叶片没有颜
色的变化，转基因烟草的叶片出现了蓝色，这说明目
的基因已经转入烟草体细胞并进行表达(图 4)。
图 3 PMD-18T-FT1载体的酶解鉴定
注: M: DL2000 marker; 1: PMD-18T-FT1双酶切
Figure 3 Double enzyme digestion of PMD-18T-FT1
Note: M: DL2000 marker; 1: Double enzyme digestion of PMD-
18T-FT1
图 4非转基因烟草与转基因烟草叶片的 GUS检测分析
注: A:正常对照烟草叶片(CK); B: 转基因烟草叶片(Transge-
netics)
Figure 4 Detection and analysis of GUS of intransgenetic tobacco
and transgenetic tobacco leaves
Note: A: Normal comparison tobacco leaf (CK); B: Transgenetic
tobacco leaf (Transgenetics)
1.2蜻蜓凤梨 FT1基因全长克隆
利用 5RACE和 3RACE方法分别获得 2 条特
异性条带，分别连接 PMD-18T克隆载体，转化
DH5α，进行重组质粒的鉴定，测序后软件拼接得到
625 bp的基因全长。根据该基因开放阅读框设计该
基因全长引物 FT1-FS (5-CCTATTTGGGAGTTTCA
CTTATT-3)和 FT1-FA (5-TATATATCAGGATGA
CACGATGC-3)，以反转录的蜻蜓凤梨的cDNA为
模板扩增该基因全长，结果显示蜻蜓凤梨 FT1基因
全长 625 bp (图 2)，与拼接片段相吻合。
1.3蜻蜓凤梨 FT1基因表达载体构建分析
将得到的目的基因全长 PCR产物连接在克隆载
体 PMD-18T上，并提取重组质粒 PMD-18T-FT1，然
蜻蜓凤梨 FT1基因克隆与植物表达载体构建研究
Construction of Plant Expression Vector of FT1 Gene from Aechmea fasciata 452
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
1.5烟草转基因植株的分子验证
提取烟草叶片中总 DNA (图 5)，然后利用 PCR
技术进行检测。在检测过程中所用的引物为目的基
因 FT1的一对特异性引物：FT1-FS和 FT1-FA，阴性
对照 CK为非转基因烟草植株。PCR检测结果表明：
转基因烟草植株可以扩增出 1条与目的基因 FT1大
小一致的单一片段(图 6)，而阴性对照植株中却不能
扩增出该条带，这说明目的基因已经转入烟草基因
组 DNA中。
图 5烟草叶片基因组 DNA
注: M: DL2000 marker; 1~9:基因组 DNA
Figure 5 Genomic DNA of tobacco
Note: M: DL2000 marker; 1~9: Genomic DNA
图 6烟草转基因植株和阴性对照植株的 PCR检测
注: M: DL2000 marker; 1~13,17:转基因烟草植株; 14~16:对照
烟草植株
Figure 6 PCR test for transgenetic tobacco plants and comparison
tobacco plants
Note: M: DL2000 marker; 1~13,17: Transgenetic tobacco plants;
14~16: Comparison tobacco plants
2讨论
本研究从蜻蜓凤梨中克隆得到与植物开花有关
的 FT1基因，该基因的全长为 625 bp。将其重组构建
到以 CaMV35S 为强启动子、GUS 为报告基因的植
物表达载体 CaMV35S-GUS-FT1，酶切鉴定含有 FT1
目的基因的植物表达载体构建正确。
对转基因烟草进行 GUS组织化学染色，以及利
用 PCR扩增基因片段的方法来进一步验证构建的
FT1基因植物表达载体的有效性。通过转基因植株的
GUS组织化学染色和在 DNA水平上的 PCR检测，结
果表明目的基因 FT1的植物表达载体构建成功。
FT1基因是从蜻蜓凤梨中克隆得到的诱导植物
开花的相关基因，在光周期调控下促进植物由营养
生长向生殖生长转变(李玉婷等, 2013)。而 FT基因诱
导植物开花的例子，已经在水稻、番茄、柑橘等多种
植物中有成功报道(Kojima et al., 2002; Mitsutomo et
al., 2005)。本研究利用植物 FT基因表达特点，克隆了
蜻蜓凤梨中 FT1基因片段，重组构建植物表达载体，
通过转基因烟草叶片中的 GUS报告基因的表达情况
验证了构建载体的有效性，结果显示外源基因已经整
合到烟草植株基因组中，为进一步研究 FT类基因在
蜻蜓凤梨和其它植物中的功能和应用奠定基础。
3材料与方法
3.1材料
3.1.1植物材料
蜻蜓凤梨 (Aechmea fasciata)及烟草 (Nicotiana
tabacum)无菌苗由中国热带农业科学院热带作物品
种资源研究所种质资源繁育与保存实验室提供。
3.1.2试剂与药品
PMD-18T克隆载体、DL2000 DNA Marker、rTaq
酶、10×PCR Buffer、T4连接酶、限制性内切酶和质粒
提取试剂盒全部购于 TaKaRa公司；在上海生工公司
购买 EDTA、Tris、CTAB、巯基乙醇、氯化锂等 DNA
和 RNA提取药品；反转录试剂盒购于 Promega公
司，引物合成由上海英俊生物技术有限公司完成。
3.1.3菌种和质粒
大肠杆菌 (Escherichia coli.) DH5α、农杆菌 E-
HA105 菌株、由本实验室保存，植物表达载体
CaMV35S-GUS由中国热带农业科学院品种资源研
究所农业部华南作物基因资源与种质创新重点实
验室提供。
3.2方法
3.2.1蜻蜓凤梨总 RNA的提取
蜻蜓凤梨总 RNA的提取采用 CTAB大量法(王玉
成等, 2006)。然后测定 RNA的吸光度 OD，检测结果
为RNA的OD260/OD280比值为 1.80，浓度为 183 ng/μL。
该检测结果表明，提取的总 RNA质量较好，满足后
续实验要求。
3.2.2 5RACE cDNA单链的合成
利用 RACE试剂盒标明的反应体系进行第一链
的合成，具体操作步骤如下：取 RNA样品 2 μL，
5CDS Primer A 1.5 μL，SMARTⅡA oligo 1.5 μL于
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蜻蜓凤梨 FT1基因克隆与植物表达载体构建研究
Construction of Plant Expression Vector of FT1 Gene from Aechmea fasciata
离心管中，混匀并离心；70℃，2 min；冰上冷却 2 min；
加入 10×Buffer 1 μL，DTT (10 mmol/L) 2.5 μL，dNTP
Mix (2.5 mmol/L) 3.5 μL，逆转录酶 0.6 μL；混匀，将
以上混合均匀的试剂放于 42℃ PCR 仪中 1.5 h，然
后将其取出后再加入 EDTA Buffer 20 μL；在 72℃
PCR仪中 7 min，将其保存于-20℃下用于后续实验。
3.2.3 3RACE cDNA单链的合成
取 RNA 样品 2 μL，3CDS Primer A 1.5 μL，其
它步骤参照 5RACE cDNA单链合成方法。
3.3 蜻蜓凤梨 FT1 基因 5RACE 和 3RACE PCR
扩增
3.3.1 FT1基因 5RACE PCR扩增
以合成的 5RACE第一链 cDNA为模板，利用
5-GSP1 (5-AGAGCACGAACACAAAGCGG-3 )和
试剂盒自带的 UPM引物进行 PCR扩增，然后将其
扩增的 PCR产物稀释 50倍，以稀释后的 PCR产物
为模版，以试剂盒自带引物 NUP 以及 5-GSP2
(5-TGGACTTGGAGCATCTGGGT-3)为引物进行
第 2次 PCR扩增，以 RACE试剂盒上标明的反应条
件进行扩增。
3.3.2 PCR扩增 FT1基因 3RACE
模板用 3RACE合成的单链 cDNA，用 UPM(通
用引物)和 3-GSP1 (5-CACTCGCCCCTCCCACTA
T-3)为引物进行 PCR扩增，然后将扩增的 PCR产物
稀释成 50倍为模板，用 NUP(通用引物)和 3-GSP2
(5-GGAGAGGCAACTCATCGTGG-3)为引物进行
3RACE内侧 PCR扩增，以 RACE试剂盒上标明的
反应条件进行扩增。
3.3.3回收 FT1基因片段进行连接转化和测序实验
目的片段和 PMD-18T克隆载体进行连接，3端、
5端 PCR回收产物 3.8 μL，Solution反应液 5.0 μL，
PMD-18T克隆载体 1.2 μL，该反应体系为 10 μL，混
匀后离心，连接完后放在 16℃恒温水浴锅过夜。然后
将其导入大肠杆菌感受态细胞，离心完弃上清液后取
80 μL的该菌液均匀的涂于无菌 LB并含有氨苄青霉
素的固体板上进行培养，待长出菌斑。用无菌牙签挑
选白色菌斑并接种到 1 mL含有氨苄抗生素的 LB液
体培养基中，放入 37℃摇床中 200 r/min培养 8~12 h。
培养好的菌液用特异性引物进行 PCR检测，将获得
的阳性克隆菌液进一步提取质粒进行酶切鉴定，随后
寄送生物公司进行测序反应。
将 5端和 3端的测序结果拼接，并把重叠的核
苷酸碱基去掉后，得到完整的蜻蜓凤梨 FT1基因全
长序列。根据基因全长序列设计引物 FT1-FS (5-CC
TATTTGGGAGTTTCACTTATT-3)和FT1-FA (5-T
ATATATCAGGATGACACGATGC-3)，然后PCR
扩增该基因片段，将得到的基因片段连接到克隆载
体上，并做大肠杆菌的转化实验，将含有目的基因的
大肠杆菌菌液送去生物公司测序，将测序结果与原
序列碱基比对后序列一致即可，所得到的即为 FT1
基因的实际全长序列。
3.4 烟草的遗传转化
取保存在 -80℃的农杆菌 EHA105 (含有质粒
CaMV35S-GUS-FT1)的菌种，并活化菌体，用液体的
MS培养基重悬菌体，并稀释农杆菌菌液在 OD600时
为 0.8为宜，用于转化实验。
在烟草的遗传转化过程中不同时期的培养基配
方为：共培养：MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L IAA；抗性
培养基：MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L IAA+500 mg/L
Car+40 mg/L Hm；生根培养基：MS+0.5 mg/L IAA+
500 mg/LCar+40 mg/LHm。
将无菌的烟草叶片切成 0.5 cm 长和宽的正方
形，并置于以上准备好的农杆菌浸染液中，放于
28℃、200 r/min的摇床中浸染时间为 13 min，浸染后
将其放在无菌滤纸上置于超净工作台吹干后将其转
移到共培养基上，暗培养 2 d。
共培养后将转化的烟草放于抗性培养基上进行
筛选。待烟草长出抗性小芽后，切取小芽置于生根培
养基上，14 d后将生根的烟草小苗移栽到苗钵，在苗
钵中生长 14 d后，剪取转基因烟草叶片进行 GUS组
织化学染色和 DNA的提取进行 PCR检测转化情况。
作者贡献
雍伟是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成数据分析和论文初稿的写作；徐立、李志
英、胡珊娜和张学全参与实验设计，试验结果分析；
李志英是项目的构思者及负责人，指导实验设计，
数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同
意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31372106)资助。感
谢中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所、
农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验
室提供实验条件。
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
参考文献
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