全 文 ：农业生物技术学报 !#$%&’()(*+$,-#’.#$&’(/,.0-1%’+2((((34456789(((:8;<((((8==>8=?9
彭世清 !男 7?@A年生博士副研究员# BCD&,’<9EF1GCH0%+I7@8J-DKJ
L通讯作者# M#.1$9)$9-$$0FH%N0%-0J((BCD&,’!E&%-&,IH#O’,-J1PJ1,J-%JKJ
收稿日期!344AC48C4Q((((接受日期!344AC4@C37
$研究简报$
在烟草中表达拟南芥 RMS基因获得矮化的烟草植株
!# 7(((($%& 763L
:7J(中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作物生物技术国家重点实验室6(海口 5Q7747T
3J(中国热带农业科学院橡胶研究所热带作物栽培生理农业部重点开放实验室6(儋州 5Q7Q8Q;
’()*RMS 基因T((转化T((烟草T((矮化
UO.&,%,%+(VW&$)(X’&%.F(O2(BYH$0FF,%()(M%(M$&O,NHF,F RMS(R0%0(,%(ZO&--
XB[R(\1,C],%+7((((^_B[9\1#C^&,763L
:7J \.&.0 ‘02 a&O$&.$2 )$ Z$H,-&’ ^$H /,.0-1%’+26 S%F.,.#.0 )$ Z$H,-&’ /,.0-1%’+26 ^1,%0F0 M-&N0D2 ) Z$H,-&’ M+$,-#’.#$&’ \-,0%-0F6
_&,P# 5Q77476^1,%&T 3J ‘02 a&O$&.$2 )$ Z$H,-&’ ^$HF X12F,’+26 b,%,F.$2 ) M+$,-#’.#$06 S%F.,.#.0 )$ c#OO0$6 ^1,%0F0 M-&N0D2 ) Z$H,-&’
M+$,-#’.#$&’ \-,0%-0F6 V&%d1# 5Q7Q8Q6^1,%&9;9
RMS 9+0%0T9.$&%F)$D&.,%T9.O&--T9NW&$),FD
赤霉素:RM;能控制植物茎的伸长从而决定植物的高度
:\-1DO#$+ 0. &’J3448;% 一些植物的矮化突变体是由于体内
RM 缺陷&RM 不敏感引起的:cFF90. &’J7??Q;# 因此改变植
物体内 RM 的浓度和对 RM 的敏感性都可能改变植物的高
度获得矮化植株# RMS 是一个在拟南芥中发现的 RM 应答
的负调控因子过量表达引起植株矮化’ X0%+90. &’J7??Qe#
0. &’J3447( % 本研究克隆了拟南芥 RMS 基因在烟草中表达
获得了矮化的烟草植株%
!9999材料和方法
!!####+,
拟南芥:M$&O,NHF,F .1&’,&%&;种子&烟草:[,-.,&%& .&O-#D9
-fJ9‘83@( 种子大肠杆菌:BF-10$,-1,& -’, ;V_5!&根癌农杆
菌 :M+$O&-.0$,#D .#D0)&-,0%F ;9B_M745 和载体 H/S737 由本
实验室保存%
!$####-./ % & ’ 012
参照傅荣昭等:7??A;的方法进行%
!(####-./ ) ’ *340 + , - 56
根据拟南芥 RMS 基因的 Dc[M 序列设计 7 对引物!
X7<95g(CM^Z^ZMRMMZRMMRMRMRMZ^MZ^MZ^MZC(8h)
X3<(5hCM^RRMZ^^MZRM^MZRMZZM^RMZZ^RMRC(8h%
为了构建载体的方便分别在 3 个引物前设计了 iO&
和 /&D_酶切位点%以拟南芥 V[M 为模板?A(j预变性 8(
D,% 后加入 Z&G(V[M 聚合酶 进行 X^c 反应% 反应条件为
?A(k 84(F55(l 84(FQ3(m 7J5(D,%85 个循环后在 Q3(n继
续延伸 749D,%% 于 A9o保存%
!.####567809:;<=
X^c 产物的克隆按 \&DO$P 等 :7?=?;的方法进行序
列由上海生物工程公司测定%
!/####>8?@AB0CD
用 iO&和 /&D_从分别克隆载体和 H/S737 进行酶
切回收目的片段和载体然后进行连接% 鉴定按 \&DO$P
等:7?=?;的方法进行% 通过三亲交配法将构建好的植物表达
载体导入根癌农杆菌 B_M745%
!0####EF0GHIJ
采用叶盘法转化烟草最后将转基因烟草的组培苗移入
营养钵中置于温室中培养%
!1####I34>K0 - 2 C+ , - L<
烟草 c[M 的提取参照傅荣昭等’ 7??A( 的方法进行%反
转录与 X^c 反应按大连宝生物工程有限公司产品’ Z&‘&c&9
c[M9X^c9‘,.9p0$3J7( 说明书进行%
$9999结果
$!####-./ ) ’ *3409:
第 !期 彭世清等#在烟草中表达拟南芥 $%& 基因获得矮化的烟草植株
’()扩增产物经 *+琼脂糖凝胶电泳分析为一长约 ,-./
01 的片段 ! 图 , #’() 产物经琼脂糖电泳后回收 # 插入
234,567 载体$ 对重组质粒进行测序结果表明#该片段长为
,/.88/12$ 编码区核苷酸序列与推导的氨基酸序列与报道的
同源性为 ,88+$ 表明克隆的片段为拟南芥 $%& 基因$
图 ,-//拟南芥 $%& 基因的 ’()扩增
9:;-/,-/’()/<=2>:?:@//////*E/’()标准分子量F//GE/’()产物$ *E/’()/
=!!####!#$%&’() $ % & *+
烟草叶盘经预培养% 与农杆菌共培养后E 转入筛选培基
L3M/N/(D?/O88/=;PQ/NR左右在叶盘上开始出现抗性芽E 而未转化的叶盘在筛选培养
基上逐渐褪绿E最后白化死亡$ 待芽长到 GU!/@=左右时E切下
并置于生根培养基 L3MN/R根E待根系发育良好以后E移栽于温室中进行常规管理$ 经卡
那抗性筛选共获得 .5 株 78 代烟草植株$ 从移栽成活的抗
R果抗 R一致的片段E 未转化的烟草再生植株无此扩增带 L图 GT$ 从
’() 的检测结果可以初步证明拟南芥 $%& 基因已整合到烟
草基因组中$
图 G-部分转基因烟草植株的 ’()检测
9:;-/G-//4DAD@A:BC/B?/AH,E/4W%标准分子量& GE/对照& !UZE/转基因植株$
,E/=TF/!UZE/AH!’####!,-$.& & ( 6$ % & /0
在移栽成活的 .5 株抗 R显的矮化性状L图 !-/%T$ 对 ! 株矮化植株进行 )76’() 检测
结果表明E/$%& 的表达量高的#植株的高度相对较矮#呈一定
的负相关性L图 !-/ST$
’#///讨论
基因工程为定向改变植物的高度提供了可能$ $%& 是一
个 $% 应答的负调控因子#过量表达引起植株矮化#且表达
量的高低与植株的高度呈负相关$ 如果利用一个合适的启动
子来控制 $%& 的表达量#就可能得到理想性的矮化植物$ 目
前我们正在对已获得的矮化植物的后代进行筛选和遗传稳
定性分析$
1 2 3 4
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;:11DHD>>:C/HDX2BCXDXK/’>>E/G88,E/,!#/,aZ,U,58G
9J/)/b/L傅荣昭TE/MJC/c/)L孙勇如 T//
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图 !K///矮化的转基因烟草及 )76’()检测
9:;K/!K/7H2>%/K/转基因烟草 ,E/对照F/GUe/转基因植株F/SE//转基因烟草的 )76’()分析
3# 4W%标准分子量& ,E/对照F/GUeE/转基因植株$
%K/7HSK//)76’()/YX:X/JX:C;/ABA<>/)W%/?HB=/I:??DHDC@D/AH/2>!5Z