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拟南芥Pri-miR156a基因对烟草开花时间的影响



全 文 :研究报告
Research Report
拟南芥 Pri-miR156a基因对烟草开花时间的影响
韩瑶瑶 马燕勤 李典珍 徐子勤 *
西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西省生物技术重点实验室,西北大学生命科学学院,西安, 710069
*通讯作者, ziqinxu@nwu.edu.cn
摘 要 本研究利用转基因烟草分析了 miR156对 SPL3基因的保守性调节作用。首先通过数据库搜索和
RT-PCR方法克隆了普通烟草 NtabSPL3基因的编码序列,并进行了测序验证。同时从拟南芥 Col-0生态型
基因组 DNA分离了 A tPri-miR156a基因序列,构建产生植物表达载体,采用农杆菌转化技术制备了转基因
烟草植株。RT-PCR分析发现,过量表达 AtmiR156a可以明显下调烟草 NtabSPL3基因。表型观察结果显示,
AtPri-miR156a转基因烟草个体矮小,开花时间明显延迟,叶片数量及生物量积累增多,说明组成性表达
AtmiR156a能够延长普通烟草的营养生长时间,推迟开花转变过程。本研究为培育适合不同生长环境的烟
草新品种提供了一条新的途径,对烟草改良具有重要意义。
关键词 烟草,秦烟 95, MicroRNA156,开花时间, NtabSPL3
The Influences of Arabidopsis Pri-miR156a on Flowering Time of Nicotiana
tabacum
Han Yaoyao Ma Yanqin Li Dianzhen Xu Ziqin *
KeyLaboratory of Resource Biology and Biotechnoiogy in Western China (Ministry of Education), Provincial Key Laboratory of Biotechnology, Institute
of Life Sciences, Northwest University, Xian, 710069
* Corresponding author, ziqinxu@nwu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.000350
Abstract The conserva tive regulation function of miR156 to SPL3 was investigated in the present work. The
coding sequence of tobacco NtabSPL3 was cloned by RT-PCR based on the results of homologous search to
databases, and was confirmed by sequencing. Simultaneously, the genomic DNA sequence of AtPri-miR156a
isolated from Arabidopsis ecotype Col-0 was used to construct a plant expression vector and transgenic tobacco
plants were prepared by Agrobacterium-mediated transformation method. RT-PCR analysis revealed that
NtabSPL3 could be downregulated obviously by overexpression of AtmiR156a. Compared to wide-type tobacco
plants, the transgenic tobacco plants harbouring the Arabidopsis Pri-miR156a showed a number of changed
phenotypic characteristics, including dwarfism in size, delay in floral transition and increases in leaf number and
biomass accumulation, indicating constitutive expression of AtmiR156a could extend the time of vegetative growth
and postpone the floral transition in tobacco. This work provides a novel approach for breeding of new tobacco
cultivars adaptable to different circumstances, and is valuable in tobacco improvement.
Keywords Tobacco, Nicotiana tabacum qinyan 95, microRNA156, Flowering time, NtabSPL3
基金项目:本研究由西北大学生命科学学院生物技术重点实验室、国家自然科学基金 (30870194 和 J1210063)、陕西省重点
实验室科研计划(12JS103和 2010JS090)、西北大学研究生创新计划(YZZ13068)和西部资源生物与现代生物技术教育部重点
实验室开放研究基金共同资助
基因组学与应用生物学,2015年,第 34卷,第 2期,第 350-356页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.2, 350-356
植物在生长过程中需要经历幼年期向成年期和
成年期向生殖期两次转变。幼年期进入成年期的标
志是生殖能力的获得以及叶片形态的变化,成年期进
入生殖期的标志是顶端分生组织转变为花序分生组
织、花分生组织的产生和花器官的形成 (Yu et al.,
2013)。生长阶段转变对植物生长发育至关重要,转变
过程受环境因素及内源信号调控(Yang et al., 2013)。
microRNA (miRNA)是一类大约 22 nt的非编码
RNA,在发育过程中发挥着关键作用。最早发现的
miRNA是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans )的
lin-4和 let-7,它们能够和靶 mRNA的 3-UTR互补
配对,通过抑制翻译控制幼虫的发育过程(Reinhart et
al., 2002; Yu et al., 2013)。植物 miRNA在调控开花、
发育转变及环境胁迫应答等方面具有重要作用(Kim
et al., 2012)。从苔藓植物到开花植物,miRNA在进化
上高度保守(Frazier et al., 2010; Bari et al., 2013)。其
中,miR156在芽形成阶段高度表达,但随植物生长
过程的持续,它的转录水平逐渐降低。过表达
miR156能够使植物幼年期延长,开花时间推迟(Li et
al., 2012)。miR156通过调节不同的 SPL(SQUAMOSA
promoter-binding protein-like)基因表现出多种功能。
例如,水稻 OsSPL14基因控制营养生长阶段芽的分
化,玉米 SPL 基因 liguleless1与叶舌和叶耳的形成有
关(Li and Lu, 2014)。
迄今已经在多种绿色植物中发现了 SPL 家族成
员,它们构成了一个植物中特有的基因家族,拟南
芥、水稻、小立碗藓、玉米和番茄分别有 16个、19个、
13个、31个和 15个该家族成员(Hou et al., 2013)。烟
草(Nicotiana tabacum)是一种重要的经济作物,但目
前有关其 SPL 基因的研究甚少。本工作在烟草中组
成性表达了拟南芥 Pri-miRNA156a基因,发现它可
以改变转基因植株的开花时间。同时克隆了烟草
NtabSPL3 基因的 cDNA 序列,分析了过量表达
miR156 对该基因转录水平的影响,为深入了解
miR156和 NtabSPL3基因在烟草中的功能及其作用
机制提供了理论依据。
1结果与分析
1.1 Pri-miR156a过表达载体的构建
根据拟南芥 Pri-miR156a基因设计引物,以基因
组 DNA 为模板通过高保真 DNA 聚合酶扩增
miR156a前体序列。本实验在使用 pRI-101-AN构建
植物表达载体时选用了 Xba玉和 EcoR玉两个酶切位
点。采用 Xba玉和 EcoR玉对目的 DNA 片段以及
pRI-101-AN质粒 DNA分别进行双酶切,随后通过
T4 DNA连接酶对目的片段和载体片段在 16℃进行
连接。然后连接产物转化至 DH5琢感受态细胞后在
附加 50 mg/L卡那霉素(Kan)的 LB固体培养基上进
行选择培养。挑取阳性具 Kan 抗性克隆进行菌落
PCR鉴定,鉴定结果表明可扩增出 626bp的条带(图 1),
与预期大小相符。测序结果显示,本实验克隆的
Pri-miR156a基因与拟南芥数据库中的基因序列完
全一致。
图 1 Pri-miR156a表达载体转化大肠杆菌 DH5琢 后抗性菌落
的 PCR鉴定
注: M: DL2000 DNA Marker; 1~6:不同的抗性克隆; CK:空白
对照
Figure 1 PCR identification of the resistant colonies of Escherichia
coliDH5琢 transformed byPri-miR156a expression vector
Note: M: DL2000 DNA Marker; 1~6: Different colonies trans-
formed by ligation product; CK: Blank control
1.2农杆菌抗性克隆的菌落 PCR鉴定
采用液氮冻融法将 Pri-miR156a植物表达载体
转入农杆菌 LBA4404感受态细胞中。挑取抗性克隆
进行菌落 PCR鉴定,采用 1%琼脂糖凝胶电泳分离
菌液 PCR产物,结果产生符合预期大小的目的条带
(图 2)。携带 Pri-miR156a表达载体的农杆菌菌株被
用于随后的烟草转化实验。
1.3普通烟草 NtabSPL3基因的克隆和序列分析
利用拟南芥和番茄同源基因对茄科植物数据库
(http://solgenomics.net/)进行 TBLASTN分析,对得到
的普通烟草 SPL3 基因片段进行计算机组装和开放
图 2 Pri-miR156a植物表达载体转化农杆菌 LBA4404后抗性
克隆的菌落 PCR鉴定
注: M: DL2000 DNA Marker; 1~4:不同的抗性克隆; CK:空白
对照
Figure 2 PCR identification of the resistant colonies of Agrobac-
terium tumefaciens LBA4404 transformed by Pri-miR156a ex-
pression vector
Note: M: DL2000 DNA Marker; 1~4: Different colonies trans-
formed by Pri-miR156a expression vector; CK: Blank control
拟南芥 Pri-miR156a基因对烟草开花时间的影响
The Influences of Arabidopsis Pri-miR156a on Flowering Time of Nicotiana tabacum 351
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
阅读框分析,然后依照拼接得到的序列设计上下游
引物,通过 PCR技术验证计算机分析结果。以野生
型秦烟 95 cDNA为模板采用高保真 DNA聚合酶扩
增目的基因序列,经双酶切后通过 T4 DNA连接酶
的作用连接至 pRI101-AN载体中,转化 DH5琢感受
态细胞后在附加 50 mg/L Kan的 LB培养基上进行
选择培养。对获得的阳性具 Kan抗性菌落进行菌落
PCR,出现预期大小的条带(图 3)。对鉴定正确的克隆
进行测序,得到普通烟草 SPL3 基因序列,命名为
NtabSPL3 (图 4),编码产物具有典型的 SBP结构域,
miR156靶位点位于 3-UTR。
1.4 Pri-miR156转基因烟草的再生和鉴定
采用叶圆盘法对烟草无菌苗叶片外植体进行转
化。将经过携带 Pri-miR156 过表达载体农杆菌
图 4经过 RT-PCR验证的 NtabSPL3基因序列
注:下划线表示 SBP结构域和 miR156结合位点
Figure 4 The sequences of NtabSPL3 confirmed by RT-PCR
Note: SBP domain and the target sequence of miR156 are underlined
图 3 NtabSPL3基因的菌落 PCR鉴定
注: M: DL2000 DNA Marker; 1~11:不同的抗性克隆; CK: 空
白对照
Figure 3 Identification of NtabSPL3 by colony PCR
Note: M: DL2000 DNA Marker; 1~11: Different colonies trans-
formed by ligation product; CK: Blank control
LBA4404侵染的叶片切块转接到含有 1 mg/L 6-BA
和 0.2 mg/L NAA的固体MS培养基中暗培养 3 d,再
将经过暗培养的叶片切块转移到附加 50 mg/L Kan、
500 mg/L头孢霉素(Cef)、1 mg/L 6-BA和 0.2 mg/L
NAA的固体 MS培养基上,进行选择培养(图 5A)。
大约 1个月后将长出的愈伤组织(图 5B)转接至附加
0.1 mg/L NAA的生根培养基上生根(图 5C)。将完整
的再生小植株移栽到土壤基质中(图 5D)生长。
采用 CTAB法从具有卡那霉素抗性的烟草再生
植株中提取DNA,进行 PCR鉴定。结果显示,从 3号、
图 5 Pri-miR156转基因烟草植株的再生
Figure 5 Regeneration of Pri-miR156 transgenic tobacco plants
352
拟南芥 Pri-miR156a基因对烟草开花时间的影响
The Influences of Arabidopsis Pri-miR156a on Flowering Time of Nicotiana tabacum
7号和 13号再生植株的基因组 DNA可以扩增产生
目的条带(图 6),说明 Pri-miR156a基因已经整合到
这几个再生植株的基因组中,它们是真正的转基因
个体,分别将命名为 T3、T7和 T13。
1.5转基因烟草的表型特征和表达分析
将获得的转基因烟草和同样大小的野生型烟草
再生植株同时移栽至人工气候室中,在 16 h光照 /8 h
黑暗、22℃和 65%湿度条件下培养。经过观察发现,
相比于野生型秦烟 95 (图 7右),过表达 miR156a的
转基因烟草(图 7左)个体矮小、叶片数量较多、开花
时间延迟。
同时,通过 RT-PCR对野生型和转基因烟草植
株中 NtabSPL3基因的表达水平进行分析,结果表明
虽然 3株转基因烟草表现出一定的差异(图 8,泳道
3~5),但是与野生型烟草(图 8,泳道 1,泳道 2)相比,
NtabSPL3基因的表达水平都明显下降。这说明过表
达 miR156a基因可以抑制其靶基因 NtabSPL3 的表
达,进而延迟营养生长阶段向生殖生长阶段的转变
图 6 Pri-miR156a转基因烟草的 PCR鉴定
注: M: DL2000 DNA Marker; 1~13:具有卡那霉素抗性的再生
植株; CK:野生型烟草
Figure 6 PCR identification of transgenic tobacco plants contain-
ing Pri-miR156a
Note: M: DL2000 DNA Marker; 1~13: Putative transgenic plants
with kanamycin resistance; CK: Wild-type tobacco plant
图 7 Pri-miR156a转基因和野生型烟草开花时间对比
注:左:转基因烟草;右:野生型秦烟 95
Figure 7 Comparison of the flowering time of Pri-miR156 trans-
genic and wild-type tobacco plants
Note: Left: Transgenic plant; Right: Wild-type tobacco plant
过程,使开花时间推迟,植株矮小,叶片数量增多,进
一步证实 miR156a和 SPL3对植物成花转变具有重
要的调控作用。
2讨论
植物在生命周期中经历着许多发育阶段,这些
阶段的划分以明显的形态学特征及新器官的形成为
依据(Stief et al., 2014)。在被子植物中,生长转变主要
指营养生长阶段到生殖生长阶段的转变,花的形成
是生殖生长阶段最为显著的特征。选择正确的开花
转变时间对植物种群的繁衍至关重要,通过对不同
模式植物的研究目前已经发现了多条调控成花转变
的信号通路,构成了一个极其精细和复杂的网络(Lee
et al., 2012)。MiRNA是一类大约 22 nt的非编码单链
核糖核酸分子,它们是植物基因表达的核心调控因
子。MiRNA来自 RNA聚合酶域转录形成的初级转
录物,这些前体可以折叠成发卡结构,通过 DCL1裂
解释放出具有活性的 miRNA。miRNA在植物生长、
发育转变、生物和非生物胁迫应答等方面发挥着十
分重要的作用,其中 miR156家族能够维持营养生
长,而 miR172家族能够促进开花过程。miR156在芽
形成阶段高度表达,随着植物生长的持续,其表达量
逐渐降低,该家族成员转录本的减少预示着个体将
进入生殖生长阶段。相反,miR172在营养生长阶段
表达水平很低,随着个体进入生殖生长阶段,其表达
水平会逐渐上升(Spanudakis and Jackson, 2014)。
MiR156 和它的靶基因 SPL 共同形成了一个开
花转变的调控途径,被称为影响植物生长和发育的
年龄途径(age pathway) (Kim et al., 2012)。SPL 家族基
因编码植物特有的转录因子,包含有一个保守的、
由大约 76 个氨基酸构成的 SBP 结构域(Ling and
Zhang, 2012)。SPL 基因在胚胎发育、叶片形态发生、
图 8 Pri-miR156 转基因和野生型烟草中 NtabSPL3 基因的
RT-PCR分析
注: 1~2:野生型烟草植株; 3~5: Pri-miR156转基因烟草植株。
Figure 8 RT-PCR analysis of NtabSPL3 in Pri-miR156 transgenic
and wild-type tobacco plants
Note: 1~2:Wild-type tobaccoplants; 3~5: Transgenic tobacco lines
353
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
叶原基间隔期、营养阶段到生殖生长阶段的转变、
激素应答等方面都发挥着关键作用。在植物中,
miR156 和 SPL 基因的相互作用在进化上是非常保
守的,它们是营养阶段到生殖阶段的内源调控因
子。在金鱼草开花的早期阶段,SPL 转录因子可以直
接控制 MADS box基因的表达。在拟南芥中,miR156
的靶基因 SPL3 能够直接和正向调控 MADS box 基
因 APETALA1 (AP1)和 FRUTTFULL (FUL),并且是开
花基因 LEAFY 的核心调控因子(Ferreirae Silva et al.,
2014)。过表达 miR156可以抑制拟南芥相关 SPL 基
因的转录,降低顶端优势,延迟开花,导致植株矮小
以及叶片数量和生物量增多(Fu et al., 2012)。
miRNA分子可以结合到它们的靶位点上,通过
不完全互补配对抑制翻译过程,或者引起靶mRNA降
解,从而下调靶基因的表达水平(Salinas et al., 2012)。
在植物发育的各个阶段,一些 SPL 基因所发挥的作
用大多与 miR156和 miR157紧密相关,这些 SPL 基
因的转录本具有高度保守的 miRNA结合位点。在
拟南芥中,AtSPL3、AtSPL4和 AtSPL5可以促进营养
生长阶段的转变和开花过程,它们和 miR156 的互
补配对区位于 3-UTR 中(Wu and Poethig, 2006)。
AtSPL2、AtSPL10和 A tSPL11能够调节茎生叶和花器
官的形态,过表达miR156b可以降低 A tSPL2、AtSPL10
和 AtSPL11的 mRNA积累水平(Shikata et al., 2009)。
AtSPL9和 AtSPL15可以控制从幼年向成年阶段的生
长转变过程,以及叶生长量 (Schwarz et al., 2008)。
此外,AtSPL1、AtSPL7、AtSPL8、AtSPL12、AtSPL14 和
AtSPL16六个 SPL 基因不能和 miR156相互作用。其
中,AtSPL7可以直接与一个包含 GTAC核心序列的
Cu- 应答元件相结合,调控拟南芥体内的铜离子平
衡状态(Bernal et al., 2012)。AtSPL8可以调控花粉囊
的形成、雄性育性以及 GA生物合成和信号传递过
程(Unte et al., 2003)。AtSPL14与植物发育以及对伏
马菌素 B1的抗性有关(Stone et al., 2005)。
本研究在秦烟 95 中组成性表达了拟南芥
Pri-miR156基因,结果表明与野生型烟草植株相比,
转基因烟草植株营养生长阶段向生殖生长阶段转变
的时间延迟,开花时间较野生型烟草晚。对于烟草这
一重要的经济作物来说,营养阶段的延长,叶片及生
物量积累的增多,能够提高其经济价值。烟草的开花
过程由复杂的调节网络控制,过表达 Pri-miR156基
因可以降低靶基因 NtabSPL3的表达活性,进而影响
烟草的表型特征,这为培育新的烟草种质提供了一
条可行的途径。
3材料与方法
3.1植物材料、菌株和主要试剂
植物材料包括拟南芥(Arabidopsis thalianaL.) Co-
lumbia生态型(Col-0)和普通烟草(Nicotiana tabacum)
品种秦烟 95。种子先用 75%乙醇消毒 1 min,无菌水
冲洗 1次,然后用 0.1% HgCl2消毒 5~7 min,无菌水
冲洗 5~7次,播种于 MS培养基表面,在光照培养箱
萌发。大约 2周之后将种子苗移栽到营养土中,于
人工气候室中在 16 h 光照 /8 h 黑暗、22℃、65%湿
度条件下生长。
克隆实验采用的宿主细胞为大肠杆菌(Escheri-
chia coli) DH5琢 菌株。植物遗传转化实验采用根癌
农杆菌 LBA4404菌株。植物双元表达载体为 pRI-
101-AN (TaKaRa)。
高保真酶 DNA聚合酶 Prime STAR GXL DNA
Polymerase、T4 DNA连接酶、反转录试剂盒 Prime-
Script誖 1st Strand cDNA Synthesis Kit 购自 TaKaRa
公司;限制性内切酶 Xba玉、EcoR玉、Sal玉、BamH玉
购自 Thermo公司;普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂
盒 TIANgel Midi Purification Kit、质粒提取试剂盒
TIANprep Mini Plasmid Kit 购自天根生物公司;Tri-
zol试剂购自 Invitrogen公司。
3.2 Pri-miR156a基因的克隆
剪取 0.2 g Col-0野生型拟南芥叶片,采用 CTAB
法提取全基因组 DNA (Stewart and Via, 1993)。根据
已报道的拟南芥 Pri-miR156a基因设计引物,上游引
物 XbaImiR156S为CGTCTAGACTCAAGTTCATGC
CATTT,下游引物 EcoRImiR156AS为 CGGAATTCG
AGAGATTGAGACATAGAG。利用高保真 DNA聚合
酶从野生型拟南芥 Col-0基因组中扩增 Pri-miR156a
基因。PCR反应程序为:94℃变性 10 min;94℃变性
1 min,55℃退火 1 min,72℃延伸 1 min,36个循环;
72℃延伸 10 min。然后使用琼脂糖凝胶 DNA回收试
剂盒回收目的片段,并采用质粒小提试剂盒提取
pRI-101-AN 载体 DNA。将 PCR 产物和提取的
pRI-101-AN质粒载体分别用 Xba玉和 EcoR玉进行
双酶切。通过 T4 DNA连接酶连接目的片段和载体
大片段,转化 DH5琢 感受态细胞后在附加 50 mg/L
Kan的 LB固体培养基上进行选择培养。对获得的阳
性具有 Kan抗性的克隆进行菌落 PCR鉴定,将鉴定
正确的菌液送往上海生工生物技术公司进行测序。
3.3普通烟草 NtabSPL3基因的克隆
采用拟南芥 A tSPL3 基因和番茄 SlySBP3 基因
354
序列对茄科植物数据库(http://solgenomics.net/)进行
BLAST 搜索,根据分析结果设计引物克隆烟草
NtabSPL3基因序列。在克隆编码序列时,首先通过
DNAStar 中的 MapDraw 软件进行限制性作图,同
时参照载体多克隆位点设计引物,上游引物 Hind芋-
NtabSPL3-S为 CGAAGCTTATGGAAGATAACAAA
TGGG,下游引物 EcoRI-NtabSPL3-AS为 CGGAATT
CTCAGCTTGAACTTTCTCCAT。取 0.2 g野生型秦
烟 95叶片,采用 Trizol法提取总 RNA。通过紫外定
量法将 RNA稀释至合适浓度,通过 PrimeScript誖 1st
Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA 第一链。以
cDNA为模板,采用高保真 DNA聚合酶进行 PCR扩
增。PCR程序为:94℃预变性 10 min;94℃变性 1min,
63℃退火 1 min,72℃延伸 1 min,36个循环;72℃再
延伸 10 min。扩增产物经双酶切后,连接到
pRI-101-AN载体中。转化大肠杆菌后对获得具 Kan
抗性的菌落进行 PCR鉴定,经鉴定正确的菌落送往
上海生工生物公司进行测序。
3.4农杆菌介导的烟草遗传转化
采用叶圆盘法对秦烟 95进行转化(柴秋霞等 ,
2014)。在无菌条件下剪取烟草无菌苗叶片,放入已
灭菌的带有滤纸的培养皿中。用无菌剪刀和镊子将
叶片剪成约 1 cm伊1 cm 大小的切块,放入携带
miR156表达载体的农杆菌菌液中浸染 5 min。将叶
片切块取出,放入装有灭菌滤纸的培养皿中,将菌液
吸干。将吸干菌液的叶片切块接种到不加任何抗生
素的转化培养基中,在黑暗条件下共培养 3~5 d。将
经过暗培养的叶片切块转入含有卡那霉素(Kan)和头
孢霉素的选择培养基中,诱导愈伤组织和芽。待再生
植株长出 2~3个叶片后,转入生根培养基中诱导生
根。将完整的再生植株移栽到蛭石:珍珠岩:营养土
(1:1:2)基质中。为了使再生个体能够适应外部生长
环境,移栽后应在 21℃、65%湿度、16 h光照 /8 h黑
暗条件下培养。
3.5转 Pri-miR156基因烟草的 PCR鉴定
采用 CTAB法提取具有 Kan抗性的完整再生植
株的基因组 DNA,作为模板进行 PCR扩增,确定所
得再生植株是否为转基因植株。PCR程序为 94℃变
性 10 min;94℃变性 1 min,55℃退火 1 min,72℃延
伸 1 min,36个循环;72℃延伸 10 min。
3.6转基因烟草的表型观察
将获得的转基因烟草植株与同样大小的野生型
烟草再生植株同时移栽到人工气候室中,在 16 h光照 /
8 h黑暗、22℃、65%湿度条件下生长,随时对野生型和
转基因烟草的生长情况进行观察和拍照记录。
3.7转基因烟草中 NtabSPL3基因的表达分析
分别称取转基因烟草和野生型秦烟 95叶片各
0.2 g,用 Trizol法提取总 RNA,通过 PrimeScript誖 1st
Strand cDNA Synthesis Kit 进行 cDNA 第一链的合
成。将 cDNA稀释到 200 ng/滋L,作为 RT-PCR反应
的模板。根据测序获得的 NtabSPL3基因序列设计引
物,检测野生型与转基因烟草植株中该基因的表达
水平。NtabSPL3基因上游引物 SPL3S为 GGAATCT
ATCTGGTGGTGGG,下游引物 SPL3AS为 CTTCAT
CAAACTCTGGCAAC。RT-PCR 以烟草 Actin 基因
为内部参照,上游引物 Tabacco actinS为GATCAGTC
AAGTCACGACCAG,下游引物 Tabacco actinAS为
GGCATCATACATTTTACAACG。
作者贡献
韩瑶瑶主要负责克隆载体的构建、转基因植株
的获得、基因表达分析以及文章的撰写以及修改;马
燕勤负责烟草的培养以及表型观察、拍照记录、图片
的整理工作;李典珍主要负责收集和整理资料;徐子
勤是项目的支持人和研究的构思者,负责对论文的
结构修整并提供文章的修改意见。
致谢
感谢西北大学生命科学学院生物技术重点实验
室、国家自然科学基金(30870194和 J1210063)、陕西
省重点实验室科研计划(12JS103和 2010JS090)和西
北大学研究生创新计划(YZZ13068)对本工作的资助,
以及西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验
室开放研究基金的资助。
参考文献
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