全 文 ：第 3 3卷 第 2期
中 阁 研 晕 ( c辑 )
SC IE N C E IN C N H I A( S
e ris eC ) 2() ) ( 3年 4) 1
低能 N +辐照拟南芥诱导基因组 N D A
碱基变异分析 *
常凤启 刘选明 李银心 贾庚祥 马晶晶 刘公社 *` 朱至清“
(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室 , 北京 100 0 9 3)
摘要 用低能 N 十离子束注入拟南荞后获得的稳定突变体 T 80 n 作为实验材料 , 对突
变体植株进行了 R A P D 标记 , 并将 T 80 l 和对照部分 R A PD 特异条带进行克隆测序和
D N A 序列分析 . 结果显 示 , 在可分辨的总计 3 9 7 个 R A PD 条带中, T 8 0 l 株系中有 5 2
个条带表现出差异 , 包括条带的缺失和增加 , 条带变异率为 13 . 1% ; 克隆的 T s o n 序列
中, 平均每 16 . 8 个碱基出现 1个碱基变异位点, 表现出较高频率的碱基突变 . 碱基突变
类型包括碱基的颠换 、 转换 、 缺失 、 插入等. 在检测到的 27 5 个碱基突变中, 主要是单
碱基置换 (97 , 09 % ) , 碱基缺失或者插入的比例较小 ( .2 91 % ) . 在碱基置换中 , 转换的频率
(6 6
.
5 5% )高于颠换的频率 (3 .0 5 5% ) . 此外 , 构成 D N A 的 4 种碱基均可以被离子束辐照诱
发变异 , 而且每一种碱基都可 以被其他 3 种碱基所替换 , 但是胸腺喀咤 ()T 的辐射敏感
性要高于其他 3 种碱基 . 通过分析突变碱基周边序列 , 对低能 N + 离子注入拟南芥突变
体引发的碱墓突变热点进行了讨论 .
关键词 离子束 诱变 拟南芥 R A P D 碱基变异 序列分析
拟南芥 (A ar b id oP 、 15 ht o il an 。 (L . ) H ey n h) 作为基因组分析的材料具有很多优点 , 如它的个
体小 、 生活周期短 、 容易获得大量的繁殖群体 、 基因组小 、 单拷贝序列的比例高等 , 此外 , 拟
南芥基因组全序列的测定在 2 0 0 年底已完成 ! ’ } .
近年来低能离子束作为植物新的诱变剂源越来越受到重视 , 并逐步发展成为一个新的诱
变育种手段 . 离子注人对生物体的诱变效应已被广泛证明 , 如较低的种子萌发率和存活率 以
及植物或微生物体的遗传性状的改变等阵 4 } . 低能离子注人的生物效应要 比其他的诱变源如 x
射线 、 入射线 、 激光等复杂的多 , 因为它在对生物体的作用过程中不仅有能量传递而且还有质
量沉积和电荷交换曰 . 低能离子注人不同的生物体后发现其可导致染色体畸变 l’ ,41 、 裸露的单
链和双链质粒 D N A 的断裂 ! 5 ,6] 以及 M 13 m p质粒 D N A碱基的突变 l7j 等 . 但是低能离子对于高等
生物活体基因组 D N A碱基序列的诱变损伤却没有报道 .
w il i a m s 等人 8[] 在 P c R 的基础 上用任意顺序的 10 碱基寡核昔酸片段作为引物 , 发展了一
种叫做随机扩增的 D N A 多态性分析 ( r a n d o m a m p l i f ie d p o ly m o r p h i e D N A , R A p D ) , 用作遗传多
样性的检测 . 他们认为 , R A P D 方法能够检测出基因组之间的许多差异 , 包括两个退火位点之
2 0 0 2
一
0 9
一。 9 收稿 , 2( ) ( )2 一 r Z 一 16 收修改稿
, 国家自然科学重大基金资助项 目 (批准号 : ! 9 60 5 〔)0 5)
” ` 联 系人 E 一 ,1飞: . , I c e e h L, @ n 、 . , b e ;, 、 . o C e , 1
1 1 8 中 国 科 学 ( C 辑 ) 第 3 3 卷
间插人了一个大片段致使原来的片段太大而不能扩增 , 或者在引物结合位点上碱基的突变等 .
本研究测定了离子注入引起的拟南芥矮生突变体基因组 R A P D 多态性片段 的碱基序列 ,
将这些序列与 G en B an k 中拟南芥全序列进行同源性 比较 , 以期揭示低能离子引起的高等活体
植物 D N A 的诱变效应及碱基突变的类型和特点 .
1 材料与方法
L l 实验材料
所有处理的种子均来源于同一株拟南芥 (A ; ab id op is : th al ian a) c ol u m ib a 生态型 ; 处理 的
种子种植在温室中 , 白天 25 ℃ , 夜间 12 ℃ , 光照 16 h . 在处理的拟南芥植株中发现的矮化变异
体经过 5 代 自交稳定后 , 取其中的一个矮生突变株系 T 80 n (见第 2 节 )和野生型对照拟南芥作
为 R A PD 分析和序列比较的实验材料 .
L Z 拟南芥的 N + 离子束辐照处理
将拟南芥种子放在灭菌的小片铝箔上 , 置于靶室中进行离子注入 , 依据 uY 等人 9[] 的方法
进行 . N 十离子能量为 30 ke V, 束流密度 25 m A c/ m , 脉冲时间为 5 5 , 间隔 25 5 , 每次脉冲剂量
为 1 、 10 ” N +/ c m Z , 处理的总剂量为 0( 作为对照 )和 80 次 , 每一剂量处理 30 粒种子 . 处理所用
的装置为中国科学院等离子体物理研究所的离子源 .
1 .3 基因组总 D N A 的提取和 R A P D 分析
分别取 10 个 T 80 n 和对照的植株进行总基因组 D N A 的提取 , 提取按照 R go er s 等人 t`01 所
描述的方法进行 , 提取过程中 , D N A 粗提液用 R N as e A 室温消化 30 m in 以去除 R N A 污染 .
R A P D 所用随机引物 、 aT q D N A p ol y m er as e 和 dN T P 均购 自上海生工生物工程技术服务
有限公司 . 对每个引物制备反应混合物 , 并加一个以水代替模板作为负对照 , 样品混合液的浓
度为 一o m m o l zL 肠15 一H e l , p H g . o , l o m m o l /L K e l , s mm o l /L (N H 4 ) 2 5 0 4 , Z m m o lz L M g C 12 , 0 . 0 5%
N p
一
4 0
,
2 0 0 林m o l几 d N T p s , 以及 0 . 2 7 林m o l几 随机引物 , 5 0 n g 基因组总 D N A . 5 0 林L 反应体系
含有 2 . 5 U aT q D N A p o l y m e r a s e , 用 w h a tm an B i o m e t r a O T g r a d i e n t P e R 扩增仪进行扩增 , 具体
扩增按照下述程序进行 : 9 2 ℃预变性 5 m i n , 9 5℃变性 3 0 5 , 3 4 ℃退火 15 5 , 7 2 ℃延伸 1 m i n , 4 5
个循环 , 最后在 72 ℃保温 10 m in . R A P D 扩增片段用 1 . 0%琼脂糖凝胶电泳进行分离 .
1 .4 特异条带的回收和克隆
R A P D 标记 中出现 的部分特异条带用 w i z a r d T M P e R P r e p s D N A P u r i ir e a t i o n s y s t e m
( P r o m e g a )从琼脂糖凝胶中回收 , 并用 p o EM吼T E a s y ve e t o r ( P r o m e g a )克隆试剂盒进行克隆 , 具
体方法依照产品说明书 . 回收后的 P C R 产物用上述 R A P D 一 P C R 方法检测纯度 , 循环程序略有
改动 : 9 5 ℃ 预变性 4 m i n , 9 5℃变性 15 5 , 5 2℃退火 4 5 5 , 7 2 ℃延伸 9 0 5 , 循环数为 3 5 , 最后 7 2℃
保温 s m i n ·
L S 特异条带 D N A 的测序
携带有特异条带质粒的 sE hc er ihc ia co il( D H a) 阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有
限公司进行双向测序 , 测序引物为 T 7 ls 6P 通用测序引物 (T 7 序列引物 : 5 ` d (AT A T A c G A c T c A -
C T朋队 G G G C G A ) 3 ` , s P 6 序列引物 : 5 ` d (C A A G C T A T T T A G G T G A C A C T A TAG ) 3 ` ) , 测通后 由该
公司拼接 .
第 2期 常凤启等 : 低能 N 斗辐照拟南芥诱导基因组 DN A碱基变异分析
2结果
2
.
1 离子束的诱变效应和 T 8 011突变体的选育
N
十离子注人处理的拟南芥种子萌发率和成苗率与对照相比都有所下降 , 对照拟南芥种子
的萌发率和成苗率分别为 89 . 7 %和 7 . 0% , 80 次剂量处理种子的萌发率和成苗率分别为 23 . 3%
和 21 . 4 % , 处理种子的萌发时间也较对照平均延迟 1周左右 . 在处理的拟南芥 M ,代植株中 , 基
本上没有发现变异株 , 但是有一株拟南芥特别矮小 , 是典型的矮化变异体 , 它的果实也较对照
短粗 . 将其 自交获得 M Z代 , 变异体的 M Z代中 , 矮株 65 棵 , 高株 21 棵 , 矮株和高株的比例约
为 3 : 1 . 经卡方检验表明 , 上述数据符合孟德尔 3 :1 分离规律 , 且在 尸 < 0 .0 5水平上显著 , 因
此突变体的矮生性状可能是由单个位点的显性突变造成的 . 再选取分离后的矮株连续自交 4
代 , 取遗传上 已经稳定的 M 6代矮生突变株系 T 80 n (图 1(b) )作为后续实验的材料 . 此外 , 在离
子注入处理的拟南芥 M : 代群体中也发现了一些表型变异 , 包括黄化 、 半致死 、 形态变异 (叶
形 、 花形和植株高度等 )以及开花结实性状的改变等 .
图 1 对照拟南芥和突变体 T 80 l 株高比较
(
a
) 对照拟南芥 , 株高超过 1 1 。 m ; (b ) s o x ] o ,” io n s z e m Z剂量 N +诱变的矮化突变体 T s o l , 高约 3 c m
.2 2 低能离子注入诱导 T 80 11R A P D 图谱变化
提取矮化突变体 T 80 n 和对照植株的基因组总 D N A 进行 R A P D 标记 . 所用的 40 条引物
都能产生稳定的扩增产物 , 但是不同的引物产生的扩增条带的数目不同 . 在 40 条引物中 , 有
2 7 条引物的扩增产物中出现了差异 , 表现为单条或者多条 R A PD 带的缺失或者增加 . 在所有
可分辨的 3 97 个 R A P D 条带中 , 52 条表现出差异 , 差异频率为 13 . 1% . 我们挑选 T 80 n 和对照
的 R A P D 结果具有较大差异的扩增产物进行电泳 , 部分结果见图 2 .
为了找出 T 80 l 的 R A P D 条带中可能存在的碱基序列变异 , 我们克隆了 n 条 R A P D 条带
并进行测序 , 1 个条带中 4 条是 T 80 l 特有的 , 3 条是对照特有的 , 另外 4 条是 T 80 n 和对照共
有的 (2 对 ) .
.2 3 离子束辐照诱导拟南芥基因组 D N A 序列变异
为了研究低能 N 十离子注人拟南芥诱导的矮化突变体基因组 D N A 序列变化及碱基突变的
类型及特点 , 我们将克隆的特异条带的序列通过 N c BI 服务器 , 用 B L A s T Z 软件在 G en B a n k
中进行序列相似性 比较 (h t t p : / zw w w . n c b i . n l m . n i h . g o v zB L A s侧) . 对照拟南芥 、 T s o l 特异条带
中 国 科 学1 2 0 ( C辑 )第 3 3 卷
k b p
2 0一
1 0一
0
.
5一
0
一
5 2一
0
.
1一
图 2对照拟南芥和 T8 0 n的扩增结果中具有明显差异的部分 RA P D 图谱
l和 2序列示为 5 ` 一 C TG G G G C TA G 一3 ’ 的随机引物对对照和 T8 0 H的扩增结果 ; 较上的箭头指 出的是克隆的 CK 1 3 7一 l, 较下
的箭头指出的是克隆的 C K 17 3一 2/ T 8 0 l 17 3 一 2 . 3 和 4 示引物序列为 5 ` 一 T CAT C C G A G G 一 3 ’ 的随机引物对对照和 T 80 n 扩增结
果 , 箭头指出的是 T 80 n 175 . 5 和 6 示引物序列为 5 ` 一 T C T C C G C C C下 3 ’ 的随机引物对对照和 T 80 l 扩增结果 . 7 和 8 示引物序
列为 5 ’ 一 G G T G G T G 八T G 一 3 ’ 的随机引物对 对照和 T 80 n扩增结果 . 9 和 10 示引物序列为 5 ` 一A A T G C G G G A G 一 3 ’ 的随机引物对
对 照和 T 80 n 扩增结果 . 1 和 12 示引物序列为 5 ’ 一 A A A G T G C G G C 一 3 ’ 的随机引物对对照和 T 80 l 扩增结果
(C K 2 3 一 T S O 1 1 7 5 )和共有条带 (C K 1 7 3一 2 一 T s o l 16 2 )的编号 、 大小 、 序列同源性 、 变异频率及
G e n B a n k 登录号见表 1 .
表 1 克隆的特异 R A P D 片段与 G en B an k 中拟南芥全序列的同源性 比较
克隆条带 克隆片段 G en B an k 识别的 最大同源 碱基变化 变异频率 G en B an k
编号 认 ) 大小 /bP 最大片段 /bP 片段儿 p 个数 /bP I% b) 登录号
C K 2 3 3 37 3 32 3 3 2 0 0 一
C K 17 3
一
1 1 86 4 1 86 2 18 6 2 0 0 一
C K 17 9 5 84 5 8 ] 5 7 9 2 0
.
34 一
T 8 0 11 60 5 2 1 5 14 4 7 3 4 1 7
.
9 7 A F 5 44 0 3 7
T 8 0 11 12 1 84 7 2 4 2 19 3 4 9 20
.
24 A F 5 44 0 3 6
T 8 0 11 16 8 13 9 5 13 9 1 13 8 3 8 0
.
5 8 A F 5 44 0 4 0
T 8 0 11 17 5 15 6 7 } 16 6 10 0 0 16 6 】4 2 3 A F 5 44 0 3 8
C K 17 3
一
2 2 3 9 2 3 6 2 3 6 0 0 一
T 8 0 11 17 3
一
2 2 3 9 2 3 6 2 3 5 1 0
.
4 2 A F 54 4 0 4 1
C K 16 2 10 7 1 10 6 9 10 6 6 3 0
.
2 8 一
T 8 0 I I 16 2 10 7 0 } 0 7 0 10 6 0 】0 0 .9 3 · A F 54 4 0 3 9
a ) C K 2 3
,
C K ]7 3
一
l 和 C K 17 9 为对照拟南芥特异的 R A P D 片段 ; T 80 II 6 0 , T 80 ll l Z一, T 80 II 一6 8 和 T 8 0 l l l 7 5 为 T 8 0 II特
异的 R A p D 片段 ; e K 17 3一 2 / T s o l l 一7 3 一 2 和 e K z 6 2 zT s o ll z 6 2 为对照和 T s o ll 共有的 R A P D 片段 . b ) 变异频率 (% ) = 碱基变化
个数 ( b p )/ e e n B a n k 识别的最大片段 (b p )
表 l 所示 , 克隆的对照拟南芥 R A P D 条带 (e K 2 3 , e K r 7 3一 1 , e K 17 9 , e K 17 3 一 2 和 e K 16 2 )的
序列与拟南芥基因组全序列相 比同源性很高 , 最多只有几个碱基的差异 . 其中 G e n B a nk 识别
的对照序列最大片段总长度为 4 0 8 0 帅 , 变异 5 个碱基 , 变异频率约为 0 . 12 % , 此变异频率是
在 P c R 反应和测序误差范围之内的 . 然而在克隆的 T 80 1 R A P D 片段中 , 都能够检测到一个
到多个位点的碱基突变 , 平均每 16 . 8 个碱基就会出现一个碱基变异位点 , T 80 n 的特异条带
T 8 0 1 6 0
,
T 80 1 12 1
,
T SO l 16 8 和 T S O l l 7 5 的碱基变异频率依次为 7 . 9 7% , 2 0 . 2 4% , 0 . 5 8 %和
14
.
23 %
, 都明显高于克隆对照序列的变异频率 . 用软件 D N A M A N Z . O对 T 80 n 17 3 一 2 和 C K 17 3 一 2,
T S O 1 1 6 2和 C K 16 2两对序列分别进行 同源性 比较发现 , 它们的同源性都约为 9 % , 因此可以
断定每对序列之间是同源序列 . 然而 T 80 n 17 3 一 2 和 T 80 1 162 的碱基变异频率为 .0 42 % 和
第 2期 常风启等 : 低能 N 十辐照拟南芥诱导基 因组 D N A碱基变异分析
0
.
9 3 %
, 分别高于其相对应的对照条带 C K I 7 3一 2 和 C K 162 因此可见 , 在克隆的 T 80 l 特异条
带以及它 与对照的共有条带中都存在较高频率的碱基突变 .
引物结合位点上碱基的突变或者 D N A 链的断裂和重排都可能引起 R A P D 多态性 . 在克隆
的 T S O 1 16 8 片段中 , 我们发现在序列的 5 ` 随机引物结合位点处至少发生了一个 T/ A 、 C/ G 的
转换 (由原初的 T G C C T G G T G A 变为突变体中的 T G C C C G G T G )A , 与这部分序列完全匹 配的随
机引物可以在 R A P D 反应中与序列结合并得到有效扩增 , 对照的这部分序列不能与同一引物
完全匹配 , 从而影响了引物与序列的结合而导致不能扩增 .
从序列同源性比较的结果可以看 出 , 低能离子注人可能导致突变体 T 80 l 染色体 D N A 双
链的断裂 . 例如 T s o 1 22 1 总长度为 84 7 b p , 但是由 G e n B a n k识别的最大片段长度为 2 4 2 b p (从
15 4 一 3 9 4 b p )
, 这一部分对应于拟南芥染色体 I 的第 1 17 9 2 5 0 7一 1 17 9 2 7 4 7 b p . 而 T 8 0 l 12 1 的
4 3 8码 9 0 和 5 16 一 5 5 3 碱基也位于 I 号染色体 _匕 分别对应于染色体 I 的 117 9 2 7 9 1一 1 17 9 2 84 3 b p
和 一17 9 2 86 9一 117 9 2 9 0 6 b p . 然而 T s o l l Z I 的 5 7 4 一 7 18 却对应于拟南芥染色体 1 的 10 5 7 96 6 9 -
10 5 7 9 5 2 5 b p (图 3 ) . 在 T S O l 特异的条带 T 80 l 6 0 和 T S O l l 7 5 中也存在 D N A 双链断裂的现象
发生 (结果未给出 ) . 但是我们克隆的对照植株的 R A PD 条带都可以在 G en B a nk 中找到其几乎
全长的同源序列 , 因此推断低能离子导致 了 T 80 n 基因组 D N A 双链的断裂 , 并在 以后的修复
过程中进行了重排 .
I 号染色体 川号染色体
11 79 2 5 0 7 117 9 2 7 4 7 11 79 2 7 9 1 1 179 2 84 3 1 179 2 8 6 9 1 17 9 29 0 6 10 5 7 9 6 6 9 10 57 9 5 2 5
3 94 4 3 8 4 9 0 5】6 5 5 3 5 7 4 7 1 8 8 4 7
图 3 T SO n 特异片段 T 80 n l ZI 的序列在拟南芥染色体 上的分布示意图
卜面数字为 T 80 H ! 21 在染色体 卜的位置 , 下面数字为克隆的 T 80 H 121 的序列
.2 4 离子束诱导 T 80 11基因组 D N A 碱基变异的类型及特点
在克隆的 T 8() n 的 R A P D 条带 中 , 单从 G en B a n k识别的大片段来看 , 共有 2 75 个碱基发生
突变 , 如果考虑 G e n B an k所识别的小片段 , 碱基变异的数 目还要多 . 碱基变异的类型包括碱基
的颠换 、 转换 、 缺失 、 插人等 , 其中 T 8 0 1 6 0 与拟南芥全序列相似性比较显示的碱基突变的
类型见图 4 . 此外 , 从表 2 的结果可以看出 , 单碱基置换的频率 ( 97 . 09 % )远远高于碱基缺失和
插人的频率 (2 . 9 1% ) . 在发生的 2 67 个单碱基置换中 , 碱基转换频率 (6 . 5 % )约为碱基颠换频率
(3 0
.
5 %) 的两倍 . 构成 D N A 的 4 种碱基均可以被离子束辐照诱发产生变异 , 而且每一种碱基
都可以被其他 3 种碱基所替换 . 腺膘吟 (A )发生变异 71 次 (包括 1 个缺失和 3 个插人突变 ) , 鸟
嗓吟 (G )发生变异 72 次 (包括 2 个缺失突变 ) , 胞嚓陡 ( )C 发生变异 4 次 , 胸腺嚓陡 ()T 发生变异
8 次 (包括 2 个缺失突变 ) , 可见胸腺嚓吮 ()T 具有更高的辐射敏感性 .
分析 2 75 个碱基突变位点的周边序列 (数据未给出 )可以看出 , 低能离子诱导突变体 T 80 n
基因组 D N A 碱基突变 与突变位点的周边序列没有相关性 . 在这种情况下较难发现突变热点存
在 , 因此对于热点问题还需要进一步研究 .
中 国 科 学 (C 辑 )第 3卷
G C A T
CGG TC CC A A T T TTC A TCG AAGG GG A TA AC C G G A TA T TT T T T T TG TAC A T AC G A A A T TTG T
34 0 1 34 1 3 34 184 3 26
G C TG G
ATA TTG G GG T T T TG TG G TG TC T TC G G T AA T ATAGC AG TA TCCCGC T T AG A ATAA A TAG A T
4 4 3 74 0 4 37 374 4 9 1 37 7 36
C 一 C A G T
A T TG T TGC T TC T TC AC A TG A TA TG T TTGC A TC T A TAAGC TTC TT T TC A TC A TAGCC AAA A
35 51 53 29 5 53 2 39 4 5 6 63 53 8 53
G G
G AC AA ACC TG TCC TAAA TGC AAC A TA TC AAG C ATT AGG TGC TG T TGG T TGG AG AAG G A AG
35 76 2 30 2
T G A
GGCC T TGC T TAC AAAAAG AAG TAGG TG AG TG T TG G A T TTC TT TC TG G G T T TG A T TAG AC T
6 3 3 8 6 0 6 4 3 8 3 8
T TC A A T T A T
G G C TAGG T TG G TCGG G G G AT AT AT A T T TT TG C A TC C C T T T AC Ge AA AGG TG T
36 87 36 9 0 0 8 73 2 734 6 73 1 73 176 73 22 73 2 730 3
C
TTC TGG A TA T TG TGG G AAA TG CC C G AATA T T AT TG C TC C G TAATAG AATA AAT T TGCC TTT TA TG AAG
0 3 8 1
C C C C G T A A
T T TT TG G T AA T TG TC T TC T T TG TG TA T TTGC TG G T TG C A AT TG G T T TGC TA T T T TGG A TA
3 8 13 3 829 8 3 83 3 84 0 3849 3 85 8 3 859 36 0 8
TC T
AC G G G A AT TGC AA TG C C T T TTGG G T TG G A T TG AC
3 86 9 378 10 38 8
图 4 T 80 n 6 0 与 G en B n a k中拟南芥全序列相似性比较
T8
0 n 60 的碱基变异位点位于 G en B n a k给出序列的上方 , 用单个大写字母表示 , 一 示缺失 , 原初序列下面的数字为突变位点
在染色体 V上 的位置
表 2 离子束辐照诱导拟南芥突变体 T 80 n 基因组 D N A 碱基突变的类型
碱基突变的类型 发生次数 突变频率 /%
碱基置换
转换
A叶 G
G朴 A
C叶T
T~ C
颠换
C什 G
G ~ C
A一 C
C朴 A
A叶 T
T叶A
G叶T
T叶 G
缺失
一 A
一G
一 T
插人
+ A
2 6 7 9 7
.
0 9
1 83 6 6 5 5
4 6 1 6
.
7 3
4 8 1 7
.
4 5
2 5 9
.
0 9
6 4 2 3
.
2 7
8 4 3 0
.
5 5
6 2
.
18
10 3
.
6 4
10 3
.
6 4
13 4
.
7 3
1 1 4
.
0 0
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7 3
3 1
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0 9
3 1
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0 9
总计
第 2期 常凤启等 : 低能 N +辐照拟南芥诱导基因组 N D A碱基变异分析
3 讨论
近 ( l)年来 , 一些研究组用低能离子辐照分离出来的裸露质粒 D N A 时发现 , 离子处理可以
引起质粒 D N A 双链或者单链 的断裂 5[,( ) j以及高频率多位点的碱基突变 17] . 除了张志宏等人 l川
曾经报道低能 N十离子诱导烟草 M ;代基因组 D N A多态性的改变外 , 低能离子对高等生物活体
D N A 分子水平上的作用却没有报道 .
我们以拟南芥为材料 , 研究了低能 +N 注入拟南芥诱导的矮化突变体基因组 D N A 多态性
的改变 、 D N A 序列变化 以及碱基突变的类型和特点等 . 从 R A PD 分析的结果可以看出 , 在所
用的 4 0 条随机引物中 , 有 27 条引物的扩增产物出现了差异 ; 在克隆的 T 80 n 的 R A P D 条带中 ,
平均每 16 . 8 个碱基就有一个碱基突变发生 , 这种高频率多位点的碱基突变说明 , 低能离子处理
诱导了突变体 T 80 n 基因组 D N A 序列发生了较大的改变 .
T 80 n 基因组 D N A 多态性的改变可能是由于碱基突变或者双链断裂造成的 . 如 当碱基突
变的位点发生在随机引物结合位点时 , 就会造成 D N A 多态性 . 在实验结果中 , T 80 1 168 的 5 ’
随机引物结合位点至少发生了一个 T/ A分C/ G 的转换 , 从而造成了这个多态性标记的出现 . 双
链 D N A 的断裂和修复过程中的重排也可以造成 D N A 多态性 , 例如图 3 显示的 T 80 fl 121 在
染色体不同位置上的分布可能是造成这个标记出现的原因之一
除了小片段基因组 D N A 的缺失外 , 在我们的实验中并没有发现较大如儿千到几万个碱基
对大小的 D N A 片段缺失 , 这可能是 由于 R A P D 方法本身引起的 , 因为 R A PD 方法对于大片段
的扩增是很困难的 .
与杨剑波等人 17 }用双链 M 13 m p ls D N A (R lF )作为离子辐照的底物而取得结果相类似 , 在
我们的实验结果中也观察到较高频率的 A/ -T G/ c 转换和 C/ G 一 A/ T 颠换 , 传统的辐射处理方
法 , 如 x 射线 、 丫射线以及 U V 等可以导致 A/ -T G/ C 和 C/ G 一A/ T 的发生 . 这两种情况的发生
与基团脱落 (无嚓吟位点或脱氨基 )密切相关 , s h a 。 等人 l ’ 2 ]曾报道低能离子照射 5 ’ 一d T M P 时会
发生脱磷和脱碱基现象 , 因此 , 基团脱落可能是低能离子辐照引起碱基突变的重要原因之一
在我们的实验结果中也发现了较高频率的 G/ c 一A/ T 转换 , 这与 M il e : ! ” }用紫外线作为诱
变剂处理 sE ch o ir o ih 。 。 口 il 的 zo cl 基因和 iT n da u 等人 [ ’ 4」用 Y射线照射补噬菌体和原噬菌体时取
得的结果相类似 . 对于发生 G/ C 一A/ T 转换最简单的解释就是腺嗦吟 与胞嚓陡的辐射脱氨基产
物错配造成的 , 而约有一半胞喀陡的辐射产物是脱氨基作用引起的 , 这些脱氨基产物可以作
为胸腺啼陡与腺嚓吟配对而发生错配 }’ “ 1 .
从变异碱基的周边序列来看 (结果未给出 ) , 离子束辐照拟南芥造成突变体 T 80 n 基因组
D N A 碱基变异的位点是比较离散的 , 难以找到一个突变热点 . 杨剑波等人 7l[ 用 M 13 m p 18 D N A
(R lF )作为辐照底物诱导 al 。 Z 突变发现 , 左右边界分别为 T G 和 c T 的碱基位点似乎比较容易
发生碱基变异 , 是突变较为集中的位点 , 似乎预示着存在突变热点 . 因此 , 低能 N +注人拟南芥
是否在一定条件下具有位点特异性和突变热点需要进一步的研究证实 .
参 考 文 献
T h e A r a b l d (
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A n a ly s l s O t t h e g c ll
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一2 4 中 国 科 学 ( C 辑 ) 第 3 3卷
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