全 文 ：Vol. 31 , No. 7
pp. 897 - 901 　July , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 7 期
2005 年 7 月 　897～901 页
小麦小 G蛋白 Tarab5B 基因全长 cDNA 克隆及表达特性的初步分析
陈秀珍　周荣华　贾继增 3
(中国农业科学院作物科学研究所农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 , 北京 100081)
摘 　要 : 通过对白粉病菌诱导的小麦叶片 cDNA 文库的测序 ,获得 1 个与水稻 Rab5B 基因一致性达 89 %的序列。以该序
列为信息探针 ,筛选小麦 EST数据库并进行电子拼接。根据拼接结果设计引物 ,利用 RT2PCR 方法获得了 1 个小麦中尚
未鉴定的全长 cDNA 克隆 Tarab5B 。Tarab5B 基因编码的蛋白具有结合 GTP/ GDP的 4 个保守结构域以及 Rab 家族成员所
特有的结构域。同源分析表明 ,该基因属于 Rab5B 亚族。麦类 Rab5B 蛋白的 GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA 和 MGC2
SSS 5 个结构域在进化上非常保守 ,而 YYRGA 结构域及其邻近的 C 端 6 个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低。RT2
PCR 检测显示 ,抗、感两个材料 Tarab5B 基因在接种后 24 h 和未接种 24 h 的表达水平基本相同 ;在接种后 1 h、4 h、7 h、12
h ,抗、感两个材料间 Tarab5B 基因的表达水平有一定差异。
关键词 : 小麦 ;小 G蛋白 ;基因克隆 ;结构域 ;白粉病
中图分类号 : S512
Isolation , Primary Expression Analysis of a Full2length cDNA Clone Encoding Small
GTP2binding Protein Gene Tarab5B in Wheat
CHEN Xiu2Zhen , ZHOU Rong2Hua , J IA Ji2Zeng 3
( Key Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology , Ministry of Agriculture , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China)
Abstract : Rab proteins are monomeric small GTP2binding proteins1 They exist in all eukaryotic cells and play an important
role in vesicular transport1 Vesicular transport is required for specialized phenomena as well as common house2keeping
function in higher plants. For example , some Rab proteins are involved in development , morphosis and adversity resis2
tance1 To date , four Rab5B genes have been isolated respectively from Lotus japonicus , Mesembryanthemum crystallinum ,
Oryza sativa and Arabidopsis thaliana1 Compared with yeast and mammalian , plant Rab5B proteins contain plant2unique
domain in addition to possessing several conserved domains common to small GTP2binding protein suggesting that plants may
well have developed plant2specific mechanisms of vesicular traffic1 Rab5B protein functions have been studied extensively in
yeast and mammalian systems1 However , little information is available about the function of plant Rab5B proteins1 In our
study , a cDNA library was constructed using mRNA from leaves of Pm16 near isogenic line inoculation with powdery
mildew1 A partial sequence encoding Rab5B protein has been isolated by sequencing the cDNA library1 In order to obtain
the full2length cDNA sequence of Rab5B gene in wheat , silicon cloning was performed against wheat EST database based
on this sequence1 A contig was obtained which shared high similarity to Rab5B gene1 According to the contig , a pair of
primers was designed and a predicted fragment with 722 bp length was obtained via RT2PCR1 PCR product was purified and
ligated into vector1 A positive cDNA clone was obtained , named Tarab5B , and sequenced1 Judged by the characters of its
nucleotide sequence , Tarab5B clone contains the full2length cDNA sequence of Rab5B gene1 This protein encoded by this
cDNA clone included four conserved domains for guanine nucleotide binding and GTPase activities and a domain specific to
Rab family1 Homologue analysis indicated that amino acid sequence deduced by Tarab5B clone showed high similarity to
those of Rab5B genes from Oryza sativa , Arabidopsis thaliana , Mesembryanthemum crystallinum and Lotus japonicus1 Do2
main comparison showed that GDSGVGKS , DTAGQE , NKAD , ETSA and MGCSSS were very conserved among six different
materials1 However , YYRGA and neighbouring six amino acid residues of its C ends showed significant differences1 Ex2
pression profile analysis indicated that the expression level of the Tarab5B gene between resistant and susceptible materials
基金项目 : 国家重点基础研究发展计划 (973 专项 ,G19980102) 。
作者简介 : 陈秀珍 (1971 - ) ,女 ,中国农业科学院博士研究生。3通讯作者 :贾继增 ,研究员 ,博士生导师。E2mail :jzjia @mail1caas1net1cn
Received(收稿日期) :2004204227 ,Accepted(接受日期) 2004208231.

at 24 h after inoculation with powdery mildew and 24 h in control(no inoculating with powdery mildew ) 1 At 1 h , 4 h , 7 h
and 12 h after inoculation with powdery mildew , expression level of the Tarab5B gene showed some difference between re2
sistant and susceptible materials1 Here it is the first time to report the full2length cDNA of Tarab5B gene in wheat1 It in2
cludes complete coding sequence of Rab5B gene1 The predicted protein belongs to Rab5B subfamily1
Key words : Wheat ; Small G protein ; Gene cloning ; Domain ; Powdery mildew
　　Rab 蛋白是一类单体形式的小 G 蛋白[1 ] ,与
Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran 亚家族共属于 Ras 超家
族[2 ,3 ] ,是 Ras 超家族最大的一个分支[4 ] 。Rab 家族
的不同成员定位于细胞内与胞吞和胞吐相关的不同
的膜区室上 ,在真核细胞的膜泡运输中起重要的调
控作用。目前 ,在高等植物中已分离克隆到许多
Rab 基因[3 ,5～7 ] 。与酵母和脊椎动物 Rab5B 蛋白相
比 ,植物 Rab5B 蛋白除具有小 G 蛋白共有的特征
外 ,还有自己的特殊性[8 ] 。它的 C 端没有异戊二烯
化基序 (CAAX ,CXC或 CC) ,而在 N 端有一个豆蔻酰
化基序。这两个脂肪酰化的基序与 Rab 蛋白的附膜
密切相关 ,因此 ,植物 Rab5B 蛋白很可能具有其他
物种来源的 Rab 蛋白所不同的附膜机制[9 ] 。近年
来 ,人们分别从龙船海棠属、百脉根属、拟南芥及水
稻中克隆到 Rab5B 基因 , 并对其表达进行了分
析[8～11 ] 。
本研究通过对小麦叶片 cDNA 文库进行测序、
电子拼接和 RT2PCR ,获得 1 个小麦中尚未报道的小
G蛋白基因 Tarab5B 的全长 cDNA 序列 ,初步研究了
其结构域及表达特性 ,为研究植物 Rab5B 基因的功
能奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
　　试验所用的小麦抗白粉病近等基因系 (Pm16/ 7 3
北京 837 F4)和北京 837 由本实验室提供。用于接
种的白粉病菌 ( Blumeria graminis DC) E09 菌株是北
京地区流行的 15 号生理小种。
112 　总 RNA、mRNA的提取
小麦总 RNA 提取采用一步法进行 ( TRIzol 试
剂 , GIBCO/ BRL 公司) 。mRNA 分离、纯化系按照
Promega polyAtract mRNA isolation system Ⅳ进行。
113 　cDNA文库构建和序列测定
以小麦抗白粉病近等基因系 ( Pm16/ 7 3 北京 837
F4)为材料 , 选取大小、色泽、饱满度一致的种子种
于培养钵中 ,室温条件下培养 ,培养钵套以透明塑料
膜圆桶 ,在圆桶上方盖 8 层纱布 ,待苗长至一叶一心
后 ,均匀抖落白粉病菌。提取接种后 1 h、3 h、6 h、9
h、12 h、16 h、20 h、24 h 的叶片总 RNA ,总 RNA 等量
混合后提取 mRNA。用 SMARTTM cDNA Library Con2
struction Kit (Clontech K105121) 完成双链 cDNA 合成、
sfi 酶切、片段的分级以及连接。连接产物按照 ZAP2
cDNA Gigapack ⅢGold Cloning Kit 进行包装 ,包装后
的产物即为原始文库 (primary library) 。原始文库未
经扩增直接转化大肠杆菌 BM2518 感受态细胞。挑
取 cDNA 克隆于 96 深孔板 ,常规培养。用 Millipore
方法抽提质粒 DNA。cDNA 的序列测定采用
ABI3700 和 ABI3730 测序仪。
114 　同源性比较
利用Blastn 和 Blastx 进行核酸和蛋白序列的同
源性比较 ,蛋白的多序列比较采用 DNAStar 的 Clustal
Ⅴ程序。
115 　Tarab5B cDNA的 PCR扩增及克隆
以构建 cDNA 文库的不同时间点等量混合的总
RNA 为模板合成 cDNA 第一链 ,第一链的合成参照
Gibco 公司反转录试剂盒 (Superscript Ⅱ) 进行。用于
反转录的引物序列是 5′2GAGAGAGAGAGAGAGAACT
CGAGTTTTTTTTTTTTTTTTVN23′, (V 是简并碱基 ,它
是 G、A、C三种碱基中的任一种。N 是简并碱基 ,它
是 G、A、C、T 四种碱基中的任一种) 。根据电子拼接
序列设计 5′引物 F022 (5′2AACCTCGGGCATTTACA2
3′)和 3′引物 R022 (5′2GAGACTCCGCACGAACC23′) 进
行 PCR 扩增 ,上下链引物序列均位于开放阅读框架
外侧。优化的 PCR 反应体系为 :25μL 反应体积 ,其
中含 215μL 10 ×PCR buffer ,118 mmol/ L MgCl2 ,4 种
底物 dNTPs 各 012 mmol/ L ,正反 2 个引物各 012
μmol/L , Taq DNA 聚合酶 1 U。反应条件为 94 ℃变
性 3 min ,继而 94 ℃1 min ,5312 ℃1 min ,72 ℃1 min ,
32 个循环 ,72 ℃延伸 3 min ,10 ℃保温。扩增片段回
收、克隆、测序。
116 　Tarab5B 基因的 RT2PCR半定量检测
以反转录时不加反转录酶为阴性对照 ,选用
tublin 基因作为内参来调整样品的模板浓度。RT2
PCR 反应体系及程序同 115。
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2 　结果与分析
211 　小麦 Tarab5B 基因 cDNA全长的分离
　　通过白粉病菌诱导的小麦叶片 cDNA 文库测
序 , 获得一个与小 G 蛋白基因 Rab5B 一致性达
89 %的 452 bp 的 cDNA 序列 , 以该序列为信息探针 ,
筛选小麦 EST数据库 ,并用 CAP3 进行拼接。拼接后
的序列长度为 1 024 bp ,与水稻、百脉根属、龙船海
棠属及拟南芥中的 Rab5B 基因的 cDNA 序列相似性
分别为 89 %、83 %、81 %、80 %。根据拼接序列设计
引物 ,利用 RT2PCR 得到了预期长度的扩增产物 (见
图 1) ,将其回收、克隆、测序。将该产物对应的克隆
命名为 Tarab5B ,长 722 bp ,编码区 36～632 bp ,拟编
码 199 个氨基酸 ,预测分子质量 21 428119 Da ,等电
点 51845。如图 2 框中所示 ,起始密码子 ATG左右
有典型的 Kozak 序列 GCCATGG,终止密码子 TGA 是
单子叶植物最常利用的密码子 ( http :/ / www1 ebio2
trade1com/ bbsf) ,3′端有典型的加尾信号 AATAAA ,从
序列特征判断 ,该克隆含有完整的编码框。
图 1 RT2PCR产物在 115 %琼脂糖凝胶上的电泳结果
Fig11 Result of RT2PCR product after electrophoresis
in 115 %agrose gel
M:MBI 100 bp DNA ladder marker plus ;1 :为阴性对照
(为了检测总 RNA 中有无 DNA 污染 ,确保扩增产物是目的片
段 ,在合成 sscDNAs 时 ,反应体系中不加反转录酶) ;
2 :箭头所指为预期的 RT2PCR 扩增片段。
M:MBI 100 bp DNA ladder marker plus system ;1 :Negative
control (when synthesizing sscDNAs , no reverse
transcriptase was added to the reaction system
in order to detect whether there existed the
genome DNA contamination in total RNA ) ;
2 :The predicted fragment for RT2PCR is
indicated by the arrow1
212 　推导的小麦 Tarab5B 蛋白质的结构域分析及
同源性比较
21211 　Tarab5B 蛋白质的结构域分析 　　从推导的
氨基酸序列看 , Tarab5B 基因编码的蛋白具有结合
GTP/ GDP 所必需的 4 个保守结构域 ( Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ,
Ⅳ) ,即磷酸结合回环 GDSGVKS ,协调 GTP 的β和γ2
磷酸基序 DTAGQE、强化鸟嘌呤结合基序 NKAD、帮
助鸟嘌呤结合和解离基序 ETSA。此外 , Tarab5B 蛋
白还具备 Rab 家族共有的结构域 YYRGA(图 2) 。
21212 　同源比较　　Blastx 结果显示 ,小麦 Tarab5B
基因编码的氨基酸序列与水稻、拟南芥、龙船海棠
属、百脉根属命名为 Rab5B 基因的氨基酸序列的相
似性分别为 86 %、74 %、73 %和 72 % ,同它们一样 ,
Tarab5B 蛋白在 N 端有一个豆蔻酰化的基序
MGXXXS ,且与水稻 OSRab5B 蛋白的豆蔻酰化基序
完全一致 ,上述分析表明该基因编码的蛋白属于
Rab5B 亚族。
213 　小麦 Tarab5B 蛋白结构域的保守性分析
将小麦 Tarab5B 基因的核苷酸序列与小麦的
EST数据库进行 blastn 比较 ,获得与之相似性在
85 %以上且期望值 E小于 e - 30的 19 条 EST序列 ,将
这些 EST序列递交给 GenBank 进行 Blastx 比较 ,获
得 5 条与 Rab5B 蛋白相似性较高的 EST序列 (登录
号分别为 BJ311727、BE585583、CD914499、AJ611644、
BF292512) 。这 5 条序列分别来自普通小麦中国春、
苏麦 3 号、Recital 以及圆锥小麦、拟斯卑尔脱山
羊草。
从图 3 可以看出 , 麦类 Rab5B 蛋白的 GDS2
GVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA 和 MGCSSS 结构域在
进化上非常保守 ,这 5 个结构域的保守性与其结合
GTP的功能和附膜机制密切相关。YYRGA 结构域
及其邻近的 C端 6 个氨基酸残基在材料间存在很大
的变异。
214 　Tarab5B 基因的表达分析
为研究 Tarab5B 基因在抗病反应中的可能作
用 ,分别提取了小麦抗白粉病近等基因系 ( Pm16/ 7 3
北京 837 F4) 和敏感材料北京 837 在白粉病菌诱导
后 1 h、4 h、7 h、12 h 及 24 h 的叶片总 RNA 以及未经
诱导的叶片总 RNA ,用于 RT2PCR 分析。以 Tublin
作为内参调整样品的模板浓度。从 Tublin 的 RT2
PCR 结果 (图 4) 可以看出 ,样品的模板浓度比较一
致。用上述的 5′引物 F022 和 3′引物 R022 ,在抗、感
两个材料间进行 RT2PCR ,结果显示 ,未接种 24 h 与
接种 24 h 抗、感两个材料间 , Tarab5B 基因的表达量
基本一致 ;在接种后 1 h、4 h、7 h、12 h ,抗、感两个材
料间 Tarab5B 基因的表达水平有一定的差异 ,敏感
材料北京 837 高于或略高于抗白粉病近等基因系
(Pm16/ 7 3 北京 837 F4) 。
998　第 7 期 陈秀珍等 :小麦小 G蛋白 Tarab5B 基因全长 cDNA 克隆及表达特性的初步分析 　　　

图 2 小麦 Tarab5B 克隆的核酸序列及其推导出的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of Tarab5B clone in wheat
斜体字母表示氨基酸。Italic letters represent amino acids1
图 3 小麦 Tarab5B蛋白结构域的保守性分析
Fig13 Conserve analysis of domain of Tarab5B protein in wheat
·表示序列两端空缺 ;X表示中间序列缺失。Dot indicates the vacancy of both ends of sequence ;X indicates the deletion of middle sequence1
009 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

图 4 小麦 Tarab5B 基因的 RT2PCR检测
Fig14 RT2PCR analysis of Tarab5B gene of wheat
24<表示未诱导 ;1、4、7、12、24 表示白粉病诱导
后的取样时间 (单位 :小时) 。
24<:non2inoculation with powdery mildew , 1 ,4 ,7 ,12 ,24 : the
sampling time after inoculation with powdery mildew(h) 1
3 　讨论
Rab 蛋白参与膜泡运输 ,严格调节着基因的表
达 ,在植物生长发育和形态建成过程中起着非常重
要的作用[12 ] 。Lu 等 (2001)研究表明 ,反义 Rab11 的
表达导致番茄发育异常、果实柔软度降低[13 ] 。Rab
蛋白除了参与膜泡运输持家功能外 ,它们还与抗逆
性有关[14 ] 。Bolte 等 (2000) 报道 ,在盐胁迫的早期 ,
普通冰草 Rab5B 基因的表达量增加[8 ] 。根据核苷
酸序列分析、蛋白质结构域分析和同源性分析 ,证实
笔者获得的 cDNA 克隆具有 Rab5B 基因的完整编码
序列 ,其编码的蛋白属于 Rab5B 亚族 ,在体内可能
行使 Rab 的功能。
结构域的保守性分析表明 , YYRGA 结构域及其
旁侧的 6 个氨基酸残基在小麦材料间存在很大差
异 ,而不同物种间的差异却很小。同一基因的种内
遗传多样性高于种间遗传多样性的现象在其他基因
中也有 (胡志昂 ,私人通讯) 。在已克隆的 4 个植物
Rab5B 基因中 ,只有拟南芥的作了功能分析。YYR2
GA 结构域的改变对于该类基因功能的发挥有何影
响 ,目前还未见报道。
RT2PCR 检测显示 , Tarab5B 基因的表达模式类
似于大麦中已克隆的小 G 蛋白基因 RacB 。Holger
等 (2002)的研究表明 , RacB 基因在抗、感材料间均
有表达 ,且不受白粉病菌诱导 ,通过 RNAi 技术 ,证
明 RacB 基因是一个感病因子[15 ] 。在白粉病诱导后
4 h、7 h、12 h 的 Tarab5B 基因表达水平敏感材料高
于抗病材料 ,但它是否是感病因子 ,还有待进一步验
证。另外 ,不同时间取样点该基因的表达水平又有
所不同 ,推测该基因的表达可能受 24 h 内在生长发
育节律的调控。
小麦 Tarab5B 基因全长 cDNA 的获得仅仅是一
个开端 ,关于它的基因组序列、染色体位置以及编码
蛋白的生物学功能尚需进一步研究。
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