全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 3期，第 472-477页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.3, 472-477
研究报告
Research Report
洋葱花发育 B类MADS-box基因 AcPI表达载体的构建及拟南芥转化
赵瑞 * 李丽林 陈俊琴 佟昊旻
沈阳农业大学,沈阳, 110161
*通讯作者, z.r.zh@163.net
摘 要 为进一步分析实验室前期利用 RACE技术从洋葱花蕾中分离到的 AcPI基因的功能，本研究构建了
AcPI基因的过表达载体，采用冻融法将表达载体转入农杆菌菌株 LBA4404后，通过花序侵染法介导转化生态
型拟南芥进行过表达试验。转基因植株的 PCR和 RT-PCR分析结果表明，外源基因 AcPI已经整合到拟南芥
基因组中并在转录水平上表达；转 AcPI基因植株除了开花时间比野生型植株有所提前外，花器官和营养器官
在形态上均未发生明显改变。因此，AcPI基因的功能需要进一步利用 RNAi干涉技术进行研究，以为今后全面
剖析洋葱花器官发育的分子遗传机制以及利用生物工程技术创造洋葱雄性不育植株提供理论依据。
关键词 洋葱, AcPI,表达载体,拟南芥
Construction of Expression Vectors of the B Class MADS-box Gene AcPI
Related to Flower Development in Onion and Transformation to Arabidopsis
thaliana
Zhao Rui * Li Lilin Chen Junqin Tong Haomin
Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110161
* Corresponding author, z.r.zh@163.net
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000472
Abstract In order to analyze the function of AcPI gene isolated from onion by RACE method, the pYBA1104-
AcPI(+) recombinant plasmids were constructed and introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by
freeze-thaw method, and then used to infect into Arabidopsis thaliana (Columbia ) through the floral-dip
method. The results of PCR and RT-PCR analysis for transgenic plants showed that AcPI genes has been
introduced into Arabidopsis genome and expressed at the transcriptional level. There was not found obvious
difference, but to display early flowering in AcPI transgenic plants. Thereby, the function of AcPI gene need
further to investigate by RNAi technology, perhaps the further results can provide theoretical basis for detail
dissect the mechanism of the flower development of onion and create male-sterility plants.
Keywords Onion, AcPI, Expression vector, Arabidopsis thaliana
收稿日期：2013-11-19 接受日期：2014-01-15 网络出版日期：2014-03-15
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/1878
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31071794)、北京市自然科学基金(6132016)和北京市农林科学院科技创新能力建设专项
(KJCX201101010-8)共同资助
大部分高等双子叶植物花器官的形成和发育都
是由多个基因共同调控的。早在二十世纪八十年代，
研究人员通过对拟南芥、金鱼草和它们同源突变体
花器官特征的深入研究，发现花器官的整个形成过
程都是由一系列同源异型基因共同控制的(Bowman
et al., 1989; Meyerowitz et al., 1989; Meyerowitz et al.,
1991; Schwarz-Sommer et al., 1990)。而后，Coen 和
Meyerowitz (1991)提出了经典的花器官发育模型，即
ABC模型。该模型显示：B功能基因参与第 2轮花器
官(花瓣)和第 3轮花器官(雄蕊)的形态建成，其功能
丧失可导致第 2轮花器官由花瓣转变为萼片，第 3
轮花器官由雄蕊转变成心皮。对非禾本科单子叶植
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
物花的研究发现许多花的最外两轮结构完全相同，
这与高等真双子叶植物的花有所区别(Kanno et al.,
2007)。随后 van Tunen等(1993)提出了修正的 ABC
模型以解释这种花形态结构。该模型认为：第一轮和
第二轮花器官呈几乎完全相同的花瓣状结构是由于
B功能基因在第一轮、第二轮和第三轮花器官中均
有表达所致。通过对影响兰科、百合科以及天冬门目
中大多数成员花器官发育 B功能基因的研究，修正
的 ABC模型同样得到了支持(Kanno et al., 2007)。但
是也发现了一些与 van Tunen 等(1993)提出的修正
的 ABC模型不相符合的现象，比如百合科植物芦笋
也有相同的花器官特征，第一轮花器官中却没有 B
功能基因的表达(Park et al., 2003; 2004)。对洋葱花器
官发育的研究发现：与大多数非禾本科单子叶植物
一样，洋葱(Allium cepa)的第一、二轮花器官也几乎
完全相同(李洪有等, 2012)。洋葱中 B类MADS-box
基因 AcPI独特的表达模式表明：B功能基因不仅调
控第一轮花器官、第二轮花器官和雄蕊的发育，而且
也调控心皮的发育(李洪有等, 2012)。
本课题组在前期研究中，通过同源克隆策略结
合 RACE技术从洋葱中克隆到了 1个 B类 MADS-
box 基因 AcPI (GenBank 序列号: JX679083)的全长
cDNA，并通过 RT-PCR和实时荧光定量 PCR分析
了它们的表达模式(李洪有等, 2012; Li et al., 2013)。
本研究利用本实验室前期通过 RACE技术从洋
葱花蕾中扩增到的 AcPI全长序列构建了植物过表
达载体，利用构建好的过表达载体进行了拟南芥转
化，旨在为进一步验证 AcPI基因的功能打基础。
1结果与分析
1.1 AcPI基因目的片段的 PCR扩增
以稀释 500倍的本实验室保存的 pGEM-T Easy
AcPI的质粒 DNA为模板，用 AcPI基因的特异引物
扩增到 674bp (图 1)。
图 1 AcPI基因的 PCR扩增产物
注: M: MarkerⅡ; 1~2:目的片段
Figure 1 The PCR products of AcPI gene
Note: M: MarkerⅡ; 1~2: The purpose fragment
1.2 AcPI基因阳性克隆的鉴定
将扩增到的目的基因 AcPI 回收后连接到
pGEM-T克隆载体上，菌液 PCR检测和双酶切鉴定
(图 2)得到了与预期大小一致的片段，表明目的基因
AcPI已插入到 pGEM-T克隆载体上，测序结果进一
步证明目的片段的正确性(图 3)。
图 2 AcPI基因酶切鉴定
注: M: Trans 2k plus DNA Marker; 1~2:目的片段
Figure 2 Restriction analysis recombinant plasmid of AcPI gene
Note: M: Trans 2k plus DNA Marker; 1~2: The purpose fragment
1.3植物表达载体的构建
将测序结果正确的插有 AcPI 的 pGEM-T 克隆
载体经 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切后回收的目的片段插
入到同样经 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切的 pYBA1104
质粒载体上，构建成 AcPI基因的过表达植物载体
(图4)，命名为 pYBA1104-AcPI(+)。
重组质粒表达载体 pYBA1104-AcPI(+)转化大
肠杆菌后，挑阳性克隆提取质粒，用 BamHⅠ和 Eco-
RⅠ双酶切进行酶切鉴定。结果显示，所得的酶切片
段大小与预期大小完全一致，初步表明 AcPI的过表
达载体已连接成功(图 5)。随后，送酶切验证正确的
质粒去公司测序，测序结果进一步确认了重组质粒
pYBA1104-AcPI(+)的正确性。
将构建好的重组质粒表达载体 pYBA1104-
AcPI(+)用冻融法转入农杆菌 LBA4404中，菌液 PCR
检测结果表明表达载体 pYBA1104-AcPI(+)已成功
的转入农杆菌 LBA4404中(图 6)。
1.4拟南芥遗传转化与 PCR、RT-PCR检测结果
经农杆菌LBA4404介导和潮霉素抗性筛选得到
转 AcPI的 T0代拟南芥 35株(图 7)。
PCR检测获得的条带与目的基因大小一致(图 8)，
初步表明外源基因 AcPI已经转入到拟南芥中，PCR
检测所得阳性植株占抗性植株的比例为 83%。
播种拟南芥 T0代种子得到转基因拟南芥 T1代
(第 2代)植株，取 T1代幼苗提取 RNA进行 RT-PCR
检测，结果表明外源基因确实已经转入到拟南芥基
473
图 3 AcPI测序序列比对
注: 1:原始序列; 2:测序序列
Figure 3 Sequence alignment of AcPI
Note: 1: Original sequence; 2: Sequencing target
图 4植物表达载体 pYBA1104-AcPI(+)简图
Figure 4 Expression vector of pYBA1104-AcPI(+)
图 5 pYBA1104-AcPI(+)酶切鉴定
注: M: Trans 2k plus DNA marker; 1~2:目的片段
Figure 5 Restriction analysis recombinant plasmid of YBA1104-
AcPI(+)
Note: M: Trans 2k plus DNAmarker; 1~2: The purpose fragment
因组 DNA中并在转录水平上得到表达，同时表明外
源基因在基因分离的基础上能够稳定遗传(图 9)。
1.5转基因拟南芥植株表型观察结果
对转 AcPI基因拟南芥的 T1代阳性植株进行开
花时间调查，营养器官和花器官的表型观察(图 10)，
结果表明转 AcPI 基因拟南芥植株除了开花时间略
有所提前(提前 2 d)外，营养器官和花器官的表型没
有发生明显变化。
洋葱花发育 B类MADS-box基因 AcPI表达载体的构建及拟南芥转化
B Class MADS-box Gene AcPI Related to Flower Development in Onion and Transformation to Arabidopsis thaliana 474
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
2讨论
根据花发育经典 ABC模型，B类 MADS-box基
因在植物生殖器官雄蕊和雌蕊发育过程中发挥着重
要作用(Yanofsky et al., 1990; Coen and Meyerowitz,
1991; Kramer et al., 1998)。本实验室在前期研究中，
从洋葱中克隆到一个 B类 MADS-box基因 AcPI，并
分析了序列结构及表达模式，但未进行功能验证。本
研究旨在利用反向遗传学技术手段对该基因的功能
进行初步研究，为今后详细剖析洋葱花器官发育的
分子遗传机制提供适当的参考信息。
由于洋葱的遗传转化体系尚不成熟，本研究在
拟南芥中对 AcPI基因进行了异源过表达分析。PCR
和 RT-PCR检测结果表明：AcPI基因整合到了拟南
芥基因组 DNA上，并在转录水平上得到了表达，且
能够稳定遗传。表型观察结果发现转 AcPI基因的拟
南芥阳性植株的营养器官和花器官表型均未发生明
显变化，但开花时间较对照植株略有提前。在双子叶
植物中，B 类 MADS-box 基因 AP3和 PI 共同调控
花瓣和雄蕊的发育(Whipple et al., 2004; Soltis et al.,
2007)。在拟南芥中 ap3和 pi突变体均表现为花瓣同
源转变为萼片而雄蕊被心皮所取代，这表明二者在
调控花瓣和雄蕊发育过程中是共同起作用而不是单
独起作用的(Albert et al., 1998; Mouradov et al., 1999;
Bowman et al., 1989; Jack et al., 1992)，这很好的解释
了转 AcPI基因的拟南芥植株的花器官未发生任何
形态上的改变。AcPI转基因植株开花时间有所提前，
这可能是由于外源基因在拟南芥染色体上的整合干
图 6 AcPI基因重组质粒 PCR验证
注: M: MarkerⅡ; 1~3:目的片段
Figure 6 The PCR validation of the recombinant plasmid AcPI
gene
Note: M: MarkerⅡ; 1~3: The purpose fragment
图 7拟南芥基因转化 T0代种子筛选
Figure 7 Selection of transgenic seeds from T0 generation
图 8转 AcPI基因拟南芥 PCR检测
注: M: MarkerⅡ; 1~4:目的片段
Figure 8 PCR amplification of AcPI from Arabidopsis genomic
DNA
Note: M: MarkerⅡ; 1~4: The purpose fragment
图 9转 AcPI基因 T1植株 RT-PCR鉴定
注: M: MarkerⅡ; 1:空白对照; 2:非转基因对照; 3~16:部分转
基因植株
Figure 9 RT-PCR identification of T1 transgenic seedlings of
AcPI gene
Note: M: MarkerⅡ ; 1: Blank; 2: Non-transgenic cotton; 3~16:
Parts of transgenic plants
图 10转基因植株不同时期生长状况
Figure 10 The different periods of transgenic plants growth status
475
扰或打断其它基因的表达。
本研究虽然在拟南芥中进行了洋葱 B类MADS-
box基因 AcPI的过表达实验，初步探讨了其功能；但
转基因植物除开花时间略有提前外，没其它任何明显
的表型变化。这可能是由于单子叶和双子叶植物花发
育相关MADS-box基因在功能上存在着一定差异性，
所以简单地通过在拟南芥中过表达来确定基因的功
能是不全面的。因此，AcPI基因的功能有待在具有相
同花发育型的植物中(兰科或百合科)进行过表达试验
和在洋葱中进行该基因的敲出试验来进一步验证。
3材料与方法
3.1试验材料
拟南芥(Columbia,生态型)、菌株 E. coli DH5α、
农杆菌 LBA4404、pYBA1104 载体质粒均由本实验
室保存。AcPI 的 cDNA由本实验室克隆并保存在
pGEM-T载体中。
pGEM-T克隆试剂盒购自 Promega公司；质粒
快速提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京全
式金生物技术有限公司；各种 DNA限制性内切酶、
第一链 cDNA合成试剂盒购自 TaKaRa公司；植物
RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术有
限公司。PCR引物由北京生物工程有限公司合成，
DNA测序送北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。
3.2实验方法
3.2.1表达载体引物设计
为了构建 AcPI基因的过表达载体，根据 AcPI
的克隆序列(GenBank序列号: JX679083)和载体质粒
pYBA1104上的酶切位点，设计了 AcPI的特异性引
物。AcPI上游引物为 PIBF：5-CGGGATCCCTCAA
CAATAAGAGGGGCAAAATT-3，下游引物为 PIER：
5-CGGAATTCTCAGGACTGTTGCAAATTAGGCT
G-3 (下划线分别为 BamHⅠ和 EcoRⅠ酶切位点)。引
物由北京生物工程有限公司合成。
3.2.2目的基因 cDNA的分离
以稀释 500 倍的 pGEM-T Easy AcPI 的质粒
DNA为模板，进行 PCR扩增得到目的片段。AcPI的
PCR反应体系如下：ddH2O 13.2 μL，10×Buffer 2 μL，
dNTP1.6μL(200μmol/L)，上游引物 1μL(10pmol/μL)，
下游引物 1 μL (10 pmol/μL)，质粒模板 1 μL，rTaq酶
0.2μL。PCR反应程序为：第一步：94℃预变性 3 min；
第二步：94℃变性 30 s；第三步：60℃退火 45 s；第四
步：72℃延伸 1 min。第二步到第四步为 30个循环。
第五步：72℃ 7 min，最后置于 4℃保存。取 AcPI的
PCR产物电泳检测，用试剂盒回收目的基因片段，然
后连接在 pGEM-T载体上，取 5 μL连接产物加入
50 μL大肠杆菌感受态(DH5α)中进行转化，经蓝白
斑筛选后挑取阳性克隆进行 PCR和测序鉴定。
3.2.3 AcPI过表达载体的构建
用 BamHⅠ和 EcoRⅠ两种限制性内切酶酶切测
序结果正确的 pGEM-T Easy-AcPI基因质粒，回收目
的片段；pYBA1104 质粒同样由 BamHⅠ和 EcoRⅠ
限制性内切酶酶切，电泳回收大片段；将经双酶切后
回收的 AcPI目的片段和 pYBA1104质粒片段用 T4
连接酶连接，然后转入大肠杆菌(E. coli) DH5α感受
态细胞中，在含有 100 μg/mL氨苄抗生素的 LB平板
上通过蓝白斑筛选阳性克隆，阳性克隆置于 LB液体
培养基中过夜培养，用碱裂解法提取质粒。用 Bam-
HⅠ和 EcoRⅠ双酶切质粒，电泳检测判断插入片段
的正确性。
3.2.4拟南芥的遗传转化、PCR和 RT-PCR鉴定及表
型观察
(1) AcPI基因的遗传转化将经酶切鉴定后正确
连接的 AcPI 基因的质粒用冻融法转入农杆菌
LBA4404中，待生态型拟南芥正常生长至花蕾期时，
将转化后的农杆菌用花序侵染法侵染拟南芥花蕾 3
次(Hopkins et al., 2009)转入拟南芥植株中。
(2)转基因拟南芥的 PCR检测。将转 AcPI基因
拟南芥的 T0 代种子经消毒后播种在含有潮霉素
(40 μg/mL) MS培养基上进行阳性苗筛选。挑选在抗
性培养基上能正常生长的转 AcPI基因的拟南芥植
株，采用改进的 CTAB法提取基因组 DNA (Abo-el-
wafa et al.,1995)。以提取的基因组 DNA为模板，以
PIBF和 PIER为基因的特异性引物进行 PCR鉴定。
(3)转基因拟南芥的 RT-PCR鉴定。取转 AcPI基
因拟南芥的 T1代阳性植株提取 RNA，然后参照反转
录试剂盒产品说明书的方法合成 AcPI基因的第一
链 cDNA作为模板，以 PIBF和 PIER为基因特异引
物，对转基因拟南芥植株进行 RT-PCR检测。
(4)转基因拟南芥的表型观察观察经 PCR鉴定
为阳性的 T0和 T1代转基因拟南芥植株的开花时间、
营养器官和花器官的表型变异。
作者贡献
李丽林是本研究的实验设计和实验研究的执行
洋葱花发育 B类MADS-box基因 AcPI表达载体的构建及拟南芥转化
B Class MADS-box Gene AcPI Related to Flower Development in Onion and Transformation to Arabidopsis thaliana 476
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
人，完成数据分析和论文初稿的写作；陈俊琴和佟昊
旻参与实验设计，实验结果分析；赵瑞是项目的构思
者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31071794)、北京市
自然科学基金(6132016)和北京市农林科学院科技创
新能力建设专项(KJCX201101010-8)共同资助。感谢
沈阳农业大学叶雪凌老师对论文写作与修改的指
导，感谢四川农业大学李洪有在实验过程中的帮助，
感谢北京农林科学院蔬菜研究中心王永勤副研究员
对实验的支持与帮助。
参考文献
Abo-elwafa A., Murai K., and Shimada T., 1995, Intra-and in-
ter-specific variations in Lens revealed by RAPD markers,
Theor. Appl. Genet., 90(3-4): 335-340
Albert V.A., Gustafsson M.H.G., and Di laurenzio L., 1998, On-
togenetic systematics, molecular developmental genetics,
and the angiosperm petal, In: Soltis D.E., Soltis P.S., and
Doyle J.J., eds., Molecular Systematics of Plant Ⅱ, Kluwer
Academic Publishers, Boston, USA, pp.349-374
Bowman J.L., Smyth D.R., and Meyerowitz E.M., 1989, Genes
directing flower development in Arabidopsis, Plant Cell, 1
(1): 37-52
Coen E.S., and Meyerowitz E.M., 1991, The war of the whorls:
Genetic interactions controlling flower development, Na-
ture, 353(6339): 31-37
Hopkins R.J., van Dam N.M., and van Loon J.J., 2009, Role of
glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic
interactions, Annu. Rev. Entomol., 54: 57-83
Jack T., Brockman L.L., and Meyerowitz E.M., 1992, The home-
otic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a
MADS box and is expressed in petals and stamens, Cell, 68
(4): 683-697
Kanno A., Nakad a M., Akita Y., and Hirai M., 2007, Class B
gene expression and the modified ABC model in nongrass
monocots, The Scientific World J., 7: 268-279
Kramer E.M., Dorit R.L., and Irish V.F., 1998, Molecular evolu-
tion of genes controlling petal and stamen development: du-
plication and divergence within the APETALA3 and PASTI-
LLATAMADS-box gene lineages, Genetics, 149(2): 765-783
Li H.Y., Wan C., Li L.L., Wan Y.Q., and Zhao R., 2012, Cloning
and expression analysis of A pu tative B class MADS-box
gene of AcPI in onion, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia
Agricultura Sinica), 45(23): 4759-4769 (李洪有,王婵,李丽
林,王永勤,赵瑞, 2012,洋葱花器官 B类MADS-box基因
AcPI的克隆及表达分析,中国农业科学, 45(23): 4759-4769)
Li H.Y., Zhao R., Wang C., Zhang L.Y., Zhao H., and Wang Y.
Q., 2013, Molecular cloning and transcriptional analysis of
the putative AGAMOUS homolog AcAG in onion (Allium
cepa), Plant Mol. Biol. Rep., 31(6): 1346-1357
Meyerowitz E.M., Bowman J.L., Brockman L.L., Drews G.N.,
Jack T., Sieburth L.E., and Weigel D., 1991, A genetic and
molecular model for flower development in Arabidopsis
thaliana, Dev. Suppl., 1: 157-167
Meyerowitz E.M., Symth D.R., and Bowman J.L., 1989, Abnor-
mal flowers and pattern formation in floral development,
Development, 106: 209-217
Mouradov A., Hamdorf B., Teasdale R.D., Kim J.T., Winter K.U.,
Theissen G., 1999, A DEF/GLO-like MADS-box gene from
a gymnosperm: pinus radiata contains an ortholog of an-
giosperm B class floral homeotic genes, Dev. Genet., 25(3):
245-252
Park J.H., Ishikawa Y., Ochiai T., Kanno A., and Kameya T.,
2004, Two GLOBOSA-like genes are expressed in second
and third whorls of homochlamydeous flowers in Asparagus
officinalis L., Plant Cell Physiol., 45(3): 325-332
Park J.H., Ishikawa Y., Yoshida R., Kanno A., and Kameya T.,
2003, Expression of AODEF, a B-functional MADS-box
gene, in stamens and inner tepals of dioecious species As－
paragus officinalis L., Plant Mol. Biol., 51(6): 867-875
Schwarz-Sommer Z., Huijser P., Nacken W., Saedler H., and
Sommer H., 1990, Genetic control of flower development by
homeotic genes in Antirrhinum majus, Science, 250(4983):
931-936
Soltis D.E., Ma H., Frohlich M.W., Soltis P.S., Albert V.A., Op
penheimer D.G., Altman N.S., dePamphilis C., and Leebens-
Mack J., 2007, The floral genome: an evolutionary history
of gene duplication and shifting patterns of gene expression,
Trends Plant Sci., 12(8): 358-367
van Tunen A.J., Eikelboom W., and Angenent G.C., 1993, Floral
organogenesis in Tulipa, Flowering Newsletter, 16: 33-38
Whipple C.J., Ciceri P., Padilla C.M., Ambrose B.A., Bandong S.
L., and Schmidt R.J., 2004, Conservation of B-class floral
homeotic gene function between maize and Arabidopsis, De-
velopment, 131(24): 6083-6091
Yanofsky M.F., Ma H., Bowman J.L., Drews G.N., Feldmann K.
A., and Meyerowitz E.M., 1990, The protein encoded by the
Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription
factors, Nature, 346(6279): 35-39
477