全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 4期，第 748-753页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.4, 748-753
研究报告
Research Report
洋葱花发育 C类MADS-box基因 AcAG表达载体的构建及拟南芥转化
赵瑞 * 李丽林 陈俊琴 孙吉娜
沈阳农业大学,沈阳, 110161
*通讯作者, z.r.zh@163.net
摘 要 为分析洋葱 AcAG基因(GenBank ID: JX974431)的功能，本研究根据课题组前期获得的洋葱 C类
MADS-box基因 AcAG的 cDNA序列设计特异引物，利用 RT-PCR技术从洋葱花瓣中分离到了 AcAG基因
的全长 CDS序列，连接到植物载体 pCAMBIA1304中，构建超表达载体 pCAMBIA1304-AcAG(+)。采用冻融
法将重组植物表达载体转入到农杆菌菌株 LBA4404中，并利用花序侵染法对野生型拟南芥进行遗传转化。
经 RT-PCR和酶切鉴定，结果表明，AcAG过表达载体构建成功；转基因植株基因组 PCR和 RT-PCR分析结
果表明，外源基因 AcAG已经整合到拟南芥基因组中，并在转录水平上发生表达。
关键词 洋葱, AcAG,表达载体,拟南芥
Construction of Expression Vectors of the C Class MADS-box Gene AcAG
Related to Flower Development in Onion and Transformation to Arabidop-
sis thaliana
Zhao Rui * Li Lilin Chen Junqin Sun Jina
Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110161
* Corresponding author, z.r.zh@163.net
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000748
Abstract In order to analyze the function of AcAG (GenBank ID: JX974431) gene, primers were designed
according to C Class MADS-box gene AcAG gene in GenBank, the cDNA were cloned from the petals of onion by
RT-PCR. The pCAMBIA1304-AcAG(+) over-expression vectors were constructed by inserting into the pCAMBIA-
1304 plasmid vector. Then, the recombinant plasmids were introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404
by free-thaw method, and then were transformed into Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) by the floral-dip
method. Using PCR and restriction analysis recombinant plasmid, we proved that the expression vector were
constructed successfully and the genes were integrated into Arabidopsis thaliana and expressed on the trans-
criptional level.
Keywords Onion, AcAG, Expression vector, Arabidopsis thaliana
收稿日期：2014-11-19 接受日期：2014-01-26 网络出版日期：2014-04-21
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/1879
基金项目：本研究由国家自然科学基金北京市自然科学基金(6132016)资助
MADS-box基因是一个庞大的转录因子家族，
它们在植物花发育过程中起着极其重要的作用。根
据 Coen 和 Meyerowitz (1991)提出的植物中参与花
器官发育的 MADS-box基因可以划分为 A、B、C三
种功能类型。其中，A类基因控制第 1、2轮花器官(萼
片和花被)的发育，其功能丧失会导致第 1轮萼片转
变成心皮，第 2轮花瓣转变成雄蕊；B类基因参与第
2、3轮花器官(花瓣和雄蕊)的形态建成，其功能丧失
可导致第 2轮花瓣转变为萼片，第 3轮雄蕊转变成
心皮；C功能基因控制第 3、4轮花器官(雄蕊和心皮)
发育，该类基因突变会使第 3轮雄蕊变成花瓣，第 4
轮心皮变成萼片。随后在矮牵牛中又分离到了控制
胚珠发育的 D功能基因(Angenent et al., 1995)以及
在拟南芥中分离到了对花瓣、雄蕊和心皮发育所必
需的 E功能基因(Pelaz et al., 2000)。这样参与植物花
器官发育的 MADS-box基因被划分为 A、B、C、D、E
5个主要的类型(Ditta et al., 2004)。C类 MADS-box
基因 AcAG表达模式分析显示，在洋葱生殖器官发
育过程中发挥着决定性作用，只在生殖器官花中表
达，并特意地在第 3轮生殖器官雄蕊和第 4轮生殖
器官心皮中表达(Li et al., 2013)。到目前为止，虽然有
一些与花器官发育相关的分子机制被揭示出来，但
其中某些类型的 MADS-box基因在不同植物(尤其
是低等被子植物,单子叶植物与双子叶植物)中具有
不同的表达模式，还有一些 ABCDE模型中某些特
定的基因组合形成变态的和无功能的花器官而不
能诱导出与野生型相同的结构，如 SEP1和 AG共
同异位表达所产生的心皮状结构(Honma and Goto,
2001;樊金会等, 2007,中国科学(C辑:生命科学), 37
(4): 466-478)。这说明花器官的发育有某些未知机制
的参与，不同植物花器官发育在遵循保守的分子机
制外，还可能具有自身独特的部分。
洋葱是最早育成并在生产上使用 F1代杂种的蔬
菜作物之一(王建军等, 2003,中国蔬菜, (4): 57-59)，
在国内外蔬菜市场上占有重要的地位，剖析洋葱花
器官发育的分子遗传机制在育种上具有重要的理论
与实践意义。反向遗传学技术手段的使用给目的基
因功能研究带来了便利(李卫等, 2000,科学通报, 45
(8): 798-807)。本课题组通过同源克隆策略结合
RACE技术，从洋葱中克隆到了 C类MADS-box基
因 AcAG的全长 cDNA，而且通过 RT-PCR和实时荧
光定量 PCR 对其表达模式进行了分析(李洪有等,
2012; Li et al., 2013)。
为了研究 AcAG的生物学功能，本课题组构建
了 C类MADS-box基因 AcAG的过表达载体，并在
拟南芥中进行了超表达试验，旨在为进一步验证
AcAG基因的生物学功能奠定基础。
1结果与分析
1.1 AcAG基因目的片段的获得
以稀释 500倍的 pGEM-T Easy AcAG测序质粒
DNA为模板，用特异扩增引物扩增到约 710 bp的片
段(图 1)，回收目的片段转化大肠杆菌，挑阳性克隆
提质粒，用 BamHⅠ+PstⅠ双酶切，同样得到相同大
小的片段(图 2)，保存测序结果正确的 AcAG质粒。
阳性克隆经 LB液体培养基过夜培养后进行测
序，将测序结果与实验室前期得到的序列进行比对，
图 1 AcAG基因的 PCR扩增产物
注: M: MarkerⅡ; 1~2:目的片段
Figure 1 The PCR products of AcAG gene
Note: M: MarkerⅡ; 1~2: The purpose fragment
图 2 AcAG基因酶切鉴定
注: M: MarkerⅡ; 1~3:目的片段
Figure 2 Restriction analysis recombinant plasmid of AcAG gene
Note: M: MarkerⅡ; 1~3: The purpose fragment
结果表明扩增到的 AcAG基因 CDS序列与前期结果
完全吻合(图 3)，进一步证明扩增到的序列的正确性。
1.2 AcAG基因植物表达载体的构建与检测
将含有目的基因 AcAG 的片段插入 pCAMBI-
A1304载体相对应的位置中构建成 AcAG基因的植
物表达载体 pCAMBIA1304-AcAG(+)。将连接体系转
化到农杆菌 LBA4404中，挑取阳性克隆提质粒，用
BamHⅠ+PstⅠ双酶切，得到大小为 710 bp的目的片
段(图 4)，初步证明了重组质粒 pCAMBIA1304-AcAG
(+)的正确性，然后通过测序进一步确定表达载体
构建成功。
1.3 转 AcAG 基因拟南芥 T1代植株的分子鉴定及表
型观察
用验证正确的 LBA4404进行拟南芥转化，转化
后收取成熟的 T0代拟南芥种子进行潮霉素抗性筛
选，大多数不发芽或发芽后死亡，只有少数能正常生
长，待长出真叶后(图 5A)，将生长绿色健康的植株移
入育苗基质中(图 5B)，大约 25 d后得到了多株生长
正常的拟南芥植株(图 5C)。
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Construction and Transformation of Expression Vectors of MADS-box AcAG Gene in Onion Flower Development 749
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Molecular Plant Breeding
图 3 AcAG测序序列比对
注: 1: AcAG基因原始 cDNA序列; 2: AcAG基因 CDS测序序列
Figure 3 Sequence alignment of AcAG
Note: 1: The original cDNA sequence of AcAG gene; 2: AcAG CDS gene sequences
图 4 pCAMBIA1304-AcAG(+)酶切鉴定
注: M: Trans 2 k plus DNA marker; 1~2:目的片段
Figure 4 Restriction analysis recombinant plasmid of pCAMBIA1304-AcAG(+)
Note: M: Trans 2 k plus DNA marker; 1~2: The purpose fragment
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将单株阳性苗从培养基中移栽到营养钵中继续
培养，待植株长大后，提取植株叶片 DNA，进行
DNA-PCR检测。结果显示，野生型植株没有获得扩
增条带，而抗性苗扩增出了约 700 bp的特异性条带，
为转基因阳性植株(图 6)。
本研究一共转化 10株拟南芥，将搜集到的种子
进行潮霉素抗性苗筛选，一共筛选了约 15 000颗转
化种子，共得到抗性苗 29株，PCR检测后 23株阳性
苗，转化率为 0.15% (表 1)。
待 T1代植株有足够的叶子时，取幼叶提取总
RNA进行 RT-PCR检测(图 7)。结果显示：野生型植
株没有扩增出相应条带；抗性筛选的幼苗中有假阳
性(第 6,第 12和第 14泳道)。对 T1代阳性植株整个
图 5拟南芥基因转化 T0代种子筛选
Figure 5 Selection of transgenic seeds fromT0 generation
图 6转 AcAG基因拟南芥 PCR检测
注: M: MarkerⅡ; 1~11:目的片段
Figure 6 PCR amplification of AcAG from Arabidopsis genomic
DNA
Note: M: MarkerⅡ; 1~11: The purpose fragment
图 7转 AcAG基因 T1植株 RT-PCR鉴定
注: M: MarkerⅡ; 1:空白对照; 2:非转基因对照; 3~16:部分转
基因植株
Figure 7 RT-PCR identification of T1 transgenic seedlings of
AcAG gene
Note: M: MarkerⅡ ; 1: Blank; 2: Non-transgenic cotton; 3~16:
Parts of transgenic plants
生长期的观察研究发现开花时间较野生型植株平均
提前 2 d左右，但是营养器官和花器官的表型没有发
生明显变化。
2讨论
植株生殖器官的发育不是由单个基因单独调
控的，而是由多个基因共同调控的(Bowman et al.,
1989; Jack et al., 1992; Albert et al., 1998)。其中 C类
MADS-box基因在植物生殖器官雄蕊和雌蕊发育过
程中发挥着重要作用(Yanofsky et al., 1990; Coen and
Meyerowitz, 1991; Kramer et al., 1998)。在高等植物
中，C类基因的主要功能是促进雄蕊和心皮的发育，
同时抑制 A类基因在第 3 和第 4 轮花器官中表达
(Krizek and Meyerowitz, 1996)；在烟草植株中过表达
梅花 C 类 MADS-box 基因 PmAG (Hou et al., 2011)
和在拟南芥中过表达木兰 C类MADS-box基因 MA-
wuAG，结果二者的过表达转基因植株开花期均比对
照提前(Wu et al., 2012)。这表明 AcAG可能具有促进
植物提早开花的功能。
目前国内均没有有关洋葱遗传转化的成熟体系
报道，因此，本研究在拟南芥中对 AcAG基因进行了
异源过表达分析。本研究通过在拟南芥中过表达洋
葱 C类MADS-box基因 AcAG初步探讨其生物学功
能，发现转基因植株的花器官形态特征没有发生改
变，可能是由于单子叶和双子叶植物花发育相关
MADS-box基因在功能上可能存在着差异性，也说
明简单地通过在拟南芥中过表达来确定基因的功能
是不全面的，因此，在自身物种上进行基因过表达和
基因敲出来研究目的基因的功能更加可靠。目前洋
葱尚未建立成熟的遗传转化体系，这为进一步验证
AcAG基因的功能带来不便，而对于这个基因的功能
尚需要在洋葱中利用基因沉默、过表达和部分功能
区域的手段深入验证。
转基因植株开花时间会有所提前，一种可能是
由于栽培条件不统一造成的，比如养分、水分供应不
足会导致植物提前由营养生长向生殖生长过渡，因
而提前开花；第二种可能是 AcAG的确具有使拟南
表 1拟南芥转化效率统计
Table 1 The statistics of Arabidopsis transformation
筛选种子数
The number of
screening seeds
15 000
抗性植株
Resistant plant
29
转基因植株
Transgenic plant
23
转化效率(%)
Conversion ef-
ficiency (%)
0.15
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芥提前开花的功能；第三种可能是插入的基因干扰
或打断了其它基因的表达造成的后果。一些研究表
明，外源基因以多拷贝的形式插入很容易干扰受体
原有的一些有益基因的表达，从而造成一些预期外
的表型(Napoli et al., 1990; 曾凡锁和詹亚光, 2004)。
我们可以进行 Southern 印迹实验做进一步验证外
源基因是以单拷贝还是多拷贝的形式插入到拟南芥
基因组中。
3材料与方法
3.1植物材料和菌株
植物材料：洋葱(Allium cepa L.)，品种为自交系
‘8677B’，采自北京农林科学院蔬菜研究中心试验
地。拟南芥，品种为 Columbia，生态型，由本实验室保
存。植物材料在试验地自然条件下生长。
菌株：大肠杆菌 E. Coli (Escherichia coli) DH5α
购自北京天根生化科技有限公司(TIANGEN)。农杆
菌 LBA4404，由本实验室制备保存。
载体质粒：PCR产物克隆载体(氨苄抗性)PGEM-T
载体购自 Promaga公司。表达载体 pCAMBIA1304载
体，由本实验保存。
3.2 AcAG基因植物表达载体的构建
根据 AcAG的克隆序列(GenBank ID: JX974431)
和载体质粒 pCAMBIA1304 上的酶切位点设计引
物。AcAG上游引物为 AGBF：5-CGGGATCCATGG
GTAGGGGGAAGATAGAG-3；下游引物为 AGPR：
5-AACTGCAGCTTACCCAAGCTGGAGTGCAGT
-3 (下划线分别为 BamHⅠ和 PstⅠ酶切位点)，由北京
生物工程有限公司合成。以稀释 500倍的 pGEM-T
Easy AcAG 的质粒 DNA 为模板进行 PCR 扩增。
PCR 反应程序为：第一步：94℃预变性 3 min；第二
步：94℃变性 30 s；第三步：55℃退火 45 s，第四步：
72℃延伸 1 min，第二步到第四步为 30个循环；第
五步：72℃ 7 min，用 DNA凝胶回收试剂盒回收扩
增产物，转化 DH5α大肠杆菌，经蓝白斑筛选后，挑
取阳性克隆提质粒，进行 PCR和酶切鉴定并进行测
序。对测序结果正确的 AcAG 质粒和载体 pCAM-
BIA1304分别用 BamHⅠ+PstⅠ进行双酶切。用 T4
连接酶将经双酶切后回收的 AcAG 目的片段和
pCAMBIA1304质粒片段连接起来，得到质粒 pCA-
MBIA1304-AcAG(+)，进行 PCR 和双酶切鉴定确保
其正确性。
3.3 AcAG基因植物表达载体转化拟南芥
将连接正确的质粒 pCAMBIA1304-AcAG(+)用
冻融法转入农杆菌 LBA4404中，用花序侵染法(Ho-
pkins et al., 2009)将转化后的农杆菌转入拟南芥中。
3.4 转 AcAG 基因拟南芥植株的筛选、分子鉴定及表
型调查
将成熟的转 AcAG基因拟南芥的 T0代种子播种
在含有潮霉素(40 μg/mL)MS培养基上进行抗性筛
选，大部分种子不发芽或在发芽后不长时间死亡，只
有少部分能正常生长。待幼苗长出真叶后，将生长绿
色健康的植株移入育苗基质中使其有足够的营养和
空间，待 T1代植株有足够的叶子时，采用改进的
CTAB法提取基因组 DNA (Abo-elwafa et al., 1995)。
以提取的基因组 DNA为模板，以 AcAG基因的特异
性引物 AGBF和 AGPR进行 PCR鉴定；用试剂盒提
取 RNA，并进行反转录，以合成 AcAG基因的第一链
cDNA作为模板，以 AGBF和 AGPR为特异引物进
行 RT-PCR检测。在植株生长期间对其开花时间、营
养器官和花器官的表型变异进行观察。
作者贡献
李丽林是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成数据分析和论文初稿的写作；陈俊琴和孙吉
娜参与实验设计，试验结果分析；赵瑞是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金北京市自然科学基
金(6132016)资助。感谢北京农林科学院蔬菜研究中心
王永勤副研究员在本研究过程中提供的帮助；感谢沈
阳农业大学叶雪凌老师对论文写作与修改的指导。
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