全 文 ：　山 东 农 业 科 学　2010, 1:1 ～ 5 ShandongAgriculturalSciences
收稿日期:2009-09-25
基金项目:国家自然科学基金项目(30871706),山东省农业科学院创新基金项目(2006YCX015)。
作者简介:缪　军(1968-),男 ,博士,助理研究员 ,主要从事蔬菜分子生物学以及分子育种研究。 E-mail:sdnkymj@yahoo.com.cn
＊通讯作者:吴　雄(1964-),男 ,博士 ,研究员 ,主要从事蔬菜遗传育种方面的研究。
洋葱花青素合成酶基因的克隆和序列分析
缪　军 ,刘冰江 ,杨妍妍 ,霍雨猛 ,张一卉 ,霍凤梅 ,修景润 ,吴　雄＊
(山东省农业科学院蔬菜研究所 ,山东 济南　250100)
　　摘　要:采用 PCR法克隆了洋葱的花青素合成酶基因 AcANS,并对其进行序列比对和生物信息学分析。
结果表明 ,其开放阅读框为 1 059 bp, 编码 352个氨基酸残基;具有一个富含 AT的内含子 , 符合 GT-AG规
则;其蛋白质第 210 ～ 309肽段含有 2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基因的结构域。
关键词:洋葱;花青素合成酶基因;基因克隆;序列分析
中图分类号:Q785　　文献标识号:A　　文章编号:1001-4942(2010)01-0001-05
CloningandSequenceAnalysisofAnthocyanidinSynthase
GeneinOnion
MIAOJun, LIUBing-jiang, YANGYan-yan, HUOYu-meng, ZHANGYi-hui,
HUOFeng-mei, XIUJing-run, WUXiong＊
(InstituteofVegetables, ShandongAcademyofAgriculturalSciences, Jinan250100, China)
Abstract　Bulbcolorisanimportanteconomictraitinonion(Aliumcepa).Theanthocyanidinsynthase
geneAcANSinonionwasclonedbyPCR, anditssequencealignmentandbioinformaticsanalysiswerecarried
out.Theopenreadingframe(ORF)ofAcANSgenewas1 059 bp, anditencodedaproteinwith352 amino
acids.AnAT-richintronof107bp, obeyingtheGT-AGrule, wasintheDNAsequence.The2OG-Fe
(I)domainofoxygenasefamilygenewasinthepeptidefrom210 to309.
Keywords　Onion;Anthocyanidinsynthasegene;Geneclone;Sequenceanalysis
　　洋葱(AliumcepaL.)以肥大的肉质鳞茎为
食用器官 ,根据其鳞茎的皮色可分为红皮 、黄皮和
白皮等品种。皮色是洋葱的重要经济性状之一 ,
具有其自身的遗传规律 [ 1, 2] 。器官的颜色是植物
最重要 、最直观的表型之一 ,对其遗传规律的研究
起始于孟德尔对豌豆花色的研究 ,当时的研究是
将基因位点与易于观察的色彩变异联系起来 。如
今有关花[ 3 ～ 5] 、玉米籽粒 [ 6 ～ 8]和拟南芥种皮 [ 9, 10]
的颜色等 ,在遗传学 、生物化学和分子生物学等方
面的研究已取得重要进展。
花青素是决定花 、叶片 、果实和种子等颜色的
重要因素之一 ,属类黄酮(flavonoids)物质 。类黄
酮化合物是植物的次生代谢产物 ,其基本碳骨架
结构为 C6 -C3 -C6, C3部分与 O形成吡喃杂
环。类黄酮化合物因其结构差异可被分为 6种主
要类型 ,包括查耳酮(chalcones)、黄酮(flavones)、
黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、花色素
苷(anthocyanins)和缩合单宁(condensedtannins
或 proanthocyanidins)[ 11 ～ 13] 。类黄酮广泛分布于
植物界且在植物体内具有重要生理学意义 ,现已
知它们控制着生长素的运输 、根系的发育分支和
向重性 、种子萌发 、紫外保护和抵御等 [ 9, 10, 14] 。
花青素由一系列酶催化合成 ,经由苯基丙酸
类合成路径(phenylpropanoidpathway)和类黄酮
生物合成途径(flavonoidsbiosyntheticpathway)生
成[ 11 ～ 13] 。生物合成前体为丙二酰 CoA和对香豆
酰 CoA,由苯基乙烯酮合成酶(CHS)催化二者形
成苯基乙烯酮 。黄色苯基乙烯酮异构化形成无色
DOI :10.14083/j.issn.1001-4942.2010.01.031
的黄烷酮 。在黄烷酮羟基化酶(F3H)催化下形成
无色的二羟基黄酮醇 ,由二羟基黄酮醇还原酶
(DFR)催化还原形成无色花色素 ,无色花色素在
花青素合成酶(ANS)作用下转变成有色花色素 。
然后由 UF3GT(UDP-葡萄糖类黄酮 -3-氧 -
葡萄糖转移酶)催化 ,糖基化形成比较稳定的花
青素 。本文克隆了洋葱的花青素合成酶基因 ,并
对其进行序列比对和生物信息学分析 ,以期为进
一步探索洋葱不同皮色的形成原因和分子机制奠
定基础。
1　材料与方法
1.1　植物材料及 DNA、RNA提取
以洋葱 (AliumcepaL.)的新鲜叶片和花为
材料 ,采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基
地 ,取样后迅速放入液氮中冷冻 ,于 -80℃保存备
用。基因组总 DNA用植物基因组 DNA提取试剂
盒(Tiangen,北京)提取 ,用 pH8.0的 TE稀释成
50 ng/μl。总 RNA用 RNAsimple总 RNA提取试
剂盒(Tiangen,北京)提取 , cDNA第一链的合成用
TIANScriptRTKit(Tiangen,北京)完成。
1.2　PCR反应及目的片段的克隆
本研究所用的上游引物 P1:CGGGACAA-
CATAACTCAGAACAATT和下游引物 P2:CATA-
ATCAAACATCAGAGTCATCC由博尚生物技术有
限公司合成。
PCR反应总体积为 25 μl,其中模板(基因组
总 DNA或 cDNA)1 μl, 2.5 mmol/LdNTPs2 μl,
引物各 0.5 μl, 10×Ex-Taqbufer2.5 μl, Ex-
TaqDNApolymerase(Takara,大连)0.13 μl,用灭
菌蒸馏水补充至 25 μl。
扩增程序:94℃预变性 3min;94℃变性 30s,
58℃退火 1 min, 72℃延伸 1min, 35个循环;最后
72℃保温 7 min。
扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离 ,然
后在 FluorChemTM5500凝胶成像系统(AlphaIn-
notech, USA)上检测并照相记录 ,分子量 Marker
DL2000从大到小依次为:2000、 1000、 750、 500、
250和 100 bp。
PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒(Tiangen,
北京)进行回收 ,与克隆载体 pMD18-T(Takara,
大连)连接 ,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5
感受态细胞 ,经蓝白斑筛选和 PCR鉴定 ,将阳性
克隆送到博尚生物技术有限公司进行测序。
1.3　序列分析
利 用 Blast进 行 序 列 比 对 (htp://
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), 主要采
用 DNAMAN软件及 htp://www.expasy.org和 ht-
tp://www.softbery.com等网上软件进行生物信
息学分析 。
2　结果与分析
2.1　洋葱 AcANS基因的克隆
洋葱总 DNA扩增的 PCR产物和 RT-PCR
产物经电泳分离(图 1),再通过回收 、连接 、转化
后 ,经蓝白斑筛选和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行
序列测定 。测序结果显示总 DNA扩增片段 1 215
bp, RT-PCR产物 1 108 bp,将其序列进行 ORF
分析 ,发现有完整的开放读码框 。其 ORF序列
1 059bp,预测的蛋白质由 352个氨基酸残基组
成 ,将其命名为 AcANS基因。
1.gDNA为模板　2.cDNA为模板　M.MarkerDL2000
图 1　洋葱 AcANS基因扩增产物电泳图
2.2　洋葱 AcANS基因的序列特征
将 AcANS基因的基因组序列和 cDNA序列进
行比对 ,发现其编码区有一个 107 bp的内含子
(图 2)。这一内含子符合 GT-AG规则 ,即其 5′
端为 GT核苷酸残基 ,而 3′端为 AG核苷酸残基 。
并且内含子区富含 AT,其中 A和 T共 85个 , G和
C共 22个 , AT含量高达 79.4%;而外显子区的
AT含量为 53.1%。
AcANS的 BlastP分析结果表明 , 此蛋白第
210 ～ 309肽段含有 2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基
因的结构域(图 3)。 ProtParam程序预测 , AcANS
的氨基酸组成中Leu占最大比例 ,高达 12.2%;
2 山 东 农 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　2010年　
黑体部分显示内含子序列(符合 GT-AG规则)
图 2　洋葱 AcANS基因编码区的 DNA序列
图 3　洋葱 AcANS的 2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基因的结构域
Glu第二 ,占到 8.0%。SignalP3.0Server检测结
果显示 AcANS不含信号肽序列 ,为非分泌蛋白。
洋葱的 AcANS与水稻的 OsANS和拟南芥的
AtANS蛋白序列比较(图 4),显示它们具有一些
保守的区段 , 其中第 210 ～ 309肽段很保守 ,与
BlastP分析结果一致 ,含有 2OG-Fe(Ⅱ)加氧
酶家族基因的结构域。
2.3　洋葱 AcANS进化分析
将洋葱的 AcANS与水稻(Oryzasativa)、小麦
(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、红掌(An-
thuriumandraeanum)、荷兰鸢尾(Irisholandica)、
芥菜(Brasicajuncea)、甘蓝(Brassicaoleraceavar.
图 4　洋葱的 AcANS与水稻的 OsANS和拟南芥的 AtANS蛋白序列比较
3　第 1期　　　　　　缪　军等:洋葱花青素合成酶基因的克隆和序列分析
capitata)、拟南芥 (Arabidopsisthaliana)、大豆
(Glycinemax)、苜蓿(Medicagotruncatula)和牵牛
(Ipomoeanil)等的花青素合成酶进行聚类分析 ,
结果(图 5)单子叶植物和双子叶植物各聚成一
类。十字花科的甘蓝 、芥菜和拟南芥聚在一起;豆
科的大豆和苜蓿聚在一起;洋葱和鸢尾有较近的
亲缘关系 ,并且与禾本科的水稻 、小麦和玉米聚在
一起 。这就提示我们在今后洋葱的研究中 ,可以
优先借鉴其它单子叶植物的信息 ,同时参考双子
叶植物的相关信息 。
图 5　植物 ANS的系统进化
3　讨论与结论
本研究从洋葱基因组 DNA和 cDNA分别扩
增了花青素合成酶基因(AcANS),通过两者的序
列比较发现其含有一个内含子 ,这一内含子符合
GT-AG规则。 AcANS的开放阅读框为 1 059bp,
编码 352个氨基酸残基 ,其蛋白质第 210 ～ 309肽
段含有 2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基因的结构域 。
花青素合成酶(anthocyanidinsynthase, ANS)是花
青素合成后期的酶 ,也有人称其为无色花青素双
加氧酶 (leucoanthocyanidindioxygenase, LDOX),
是一种 2-酮戊二酸铁依赖型双加氧酶 ,催化从
无色花青素到有色花青素的转变 ,即催化无色翠
雀素 、无色矢车菊色素和无色天竺葵色素生成翠
雀素 、矢车菊色素和花葵素[ 15 ～ 17] 。
花青素合成酶基因是决定植物器官颜色的关
键因素之一。 Rosati等(1999)[ 4]从美国金钟连翘
(Forsythiaintermedia)中克隆得到了 ANS基因和
其启动子 ,并证明在花瓣中无花色素苷是由于缺
少 ANS基因的表达所至。 Nakatsuka等(2005)[ 5]
发现 , ANS基因的突变是导致龙胆花变为白色的
重要原因 。
花青素合成酶只是类黄酮生物合成途径中的
一个环节 ,整个途径由一系列酶催化完成;同时编
码这一系列酶的结构基因又受调节基因的控制 ,
调控其表达的强度和模式。随着洋葱类黄酮生物
合成途径的相关基因逐步被揭示 ,我们将从这些
基因的等位变异中开发与皮色相关的分子标记 ,
并把这些标记应用于洋葱的杂交育种实践中 ,建
立具有自主知识产权的洋葱杂交育种体系。
参　考　文　献:
[ 1] 　ClarkeAE, JonesHA, LitleTM.Inheritanceofbulbcolor
intheonion[J].Genetics, 1944, 29(6):569-575.
[ 2] 　PatilBS, PikeLM, YooKS.Variationinthequercetincon-
tentindiferentcoloredonions(AlliumcepaL.)[ J] .J.A-
mer.Soc.Hort.Sci., 1995, 120(6):909-913.
[ 3] 　MartinC, CarpenterR, SommerH, etal.Controlofanthocyanin
biosynthesisinflowersofAntirrhinummajus[ J] .PlantJ.,
1991, 1:37-49.
[ 4] 　RosatiC, CadicA, DuronM, etal.Molecularcharacterizationof
theanthocyanidinsynthasegeneinForsythiaintermediareveals
organ-specificexpressionduringflowerdevelopment[ J] .
PlantSci., 1999, 149:73-79.
[ 5] 　NakatsukaT, NishiharaM, MishibaK, etal.Twodifferentmu-
tationsareinvolvedintheformationofwhite-floweredgentian
plants[J].PlantSci., 2005, 169:949-958.
[ 6] 　MesenA, HohmannS, MartinW, etal.TheEn/Spmtranspos-
ableelementofZeamayscontainssplicesitesatthetermini
generatinganovelintronfromadSpmelementintheA2 gene
[ J].EMBOJ., 1990, 9:3051-3058.
[ 7] 　WeissD, VanderLAH, KroonJTM, etal.Thepetuniahomo-
logueoftheAntirhinummajuscandiandZeamaysA2 fla-
vonoidgenes:homologytoflavonone3-hydroxylaseandthe
ethyleneformingenzyme[ J] .PlantMol.Biol., 1993, 22:893
-897.
[ 8] 　LesnickML, ChandlerVL.Activationofthemaizeanthocya-
ningeneA2ismediatedbyanelementconservedinmanyan-
thocyaninpromoters[ J] .PlantPhysiology, 1998, 117:437-
445.
[ 9] 　DebeaujonI, Léon-KloosterzielKM, KoornneefM.Influ-
enceofthetestaonseeddormancy, germination, andlongevity
inArabidopsis[ J].PlantPhysiology, 2000, 122:403-413.
[ 10] BuerCS, MudayGK.Thetransparenttesta4mutationprevents
flavonoidsynthesisandaltersauxintransportandtheresponse
ofArabidopsisrootstogravityandlight[ J] .ThePlantCell,
2004, 16:1191-1205.
[ 11] RupertC, WilmouthR, JonathanJ, etal.Structureandmecha-
nismofanthocyanidinsynthasefromArabidopsisthaliana[ J].
4 山 东 农 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　2010年　
　山 东 农 业 科 学　2010, 1:5 ～ 9 ShandongAgriculturalSciences
榅桲离体培养繁殖的研究
魏国芹 1, 2 ,戴洪义 1＊ ,孙玉刚 2 ,梁美霞1 ,安　淼 2
(1.青岛农业大学园林园艺学院 ,山东 青岛　266109;2.山东省果树研究所 ,山东 泰安　271000)
　　摘　要:利用榅桲茎尖进行继代培养 ,建立了榅桲的离体再生体系。结果表明 , 适合离体叶片愈伤组织诱
导的培养基为 1/2MS+KT0.5 mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L;适合愈伤组织分化
不定芽的培养基为 MS+TDZ3.0mg/L+NAA0.3 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L;适合叶片再生不定
芽的培养基为 MS+TDZ2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L;适合榅桲茎段生根的培养
基为 1/2MS+IAA0.3 mg/L+蔗糖 30.0g/L+琼脂 6.5g/L。
关键词:榅桲;愈伤诱导;植株再生;生根诱导
中图分类号:S661.94 +3　　文献标识号:A　　文章编号:1001-4942(2010)01-0005-05
ResearchonPropagationinVitroofQuince
WEIGuo-qin1, 2 , DAIHong-yi1＊ , SUNYu-gang2 , LIANGMei-xia1 , ANMiao2
(1.ColegeofHorticulture, QingdaoAgriculturalUniversity, Qingdao266109, China;
2.ShandongInstituteofPomology, Taian271000, China)
Abstract　Theregenerationsysteminvitroofquince(CydoniaoblongaMil.)wasestablished.There-
sultsindicatedthattheoptimalmediumforcaliinductionvialeaveswas1/2MS+KT0.5 mg/L+2 , 4-D1.
0mg/L+sucrose30.0 g/L+agar6.5g/L.Theoptimalmediumforthediferentiationofcaliwas1/2MS+
TDZ3.0mg/L+NAA0.3mg/L+sucrose30.0g/L+agar6.5g/L.Theoptimalmediumforplantregener-
ationvialeaveswasMS+TDZ2.0 mg/L+NAA0.1mg/L+sucrose30.0 g/L+agar6.5g/L.Theoptimal
mediumforrootinductionwas1 /2MS+IAA0.3mg/L+sucrose30 g/L+agar6.5 g/L.
Keywords　Quince;Calusinduction;Plantregeneration;Rootinduction
　　榅桲(CydoniaoblongaMil.)属蔷薇科 、榅桲
属(cydonia)果树 ,原产于伊朗 、土耳其[ 1] 。其果
实营养丰富 ,具有特殊芳香味 ,是食品工业的重要
原料 。榅桲在欧洲被用作西洋梨的矮化砧木 ,如
榅桲 A、榅桲 B和榅桲 C[ 2] 。榅桲还可用作药材
和观赏树木[ 3 ～ 4] 。
收稿日期:2009-11-02
基金项目:山东省良种产业化项目。
作者简介:魏国芹(1983-),女 ,在读硕士研究生 ,主要从事果树育种工作。 E-mail:guoqinw1983@126.com
＊通讯作者, E-mail:hydai@qau.edu.cn
Structure, 2002, 10:93-103.
[ 12] HoltonTA, CornishEC.Geneticsandbiochemistryofantho-
cyaninbiosynthesis[ J].ThePlantCel, 1995, 7:1071-1083.
[ 13] ShirleyBW.Flavonoidbiosynthesis:acolorfulmodelforgenet-
ics, biochemistry, celbiologyandbiotechnology[ J] .Plant
Physiology, 2001, 126:485-493.
[ 14] WassonAP, PeleroneFI, MathesiusU.Silencingthefla-
vonoidpathwayinMedicagotruncatulainhibitsrootnodulefor-
mationandpreventsauxintransportregulationbyrhizobia[ J].
ThePlantCel, 2006, 18:1617-1629.
[ 15] SaitoK, KobayashiM, GongZ, etal.Directevidenceforantho-
cyanidinsynthaseasa2-oxoglutarate-dependentoxygenase:
molecularcloningandfunctionalexpressionofcDNAfromared
formaofPerillafrutescens[ J].PlantJ., 1999, 17:181-189.
[ 16] NakajimaJ, SatoY, HoshinoT, etal.Mechanisticstudyonthe
oxidationofanthocyanidinsynthasebyquantummechanicalcal-
culation[ J] .J.Biol.Chem., 2006, 281(30):21387 -
21398.
[ 17] SharonA, ElizabethL, AmandaRW, etal.TheArabidopsis
TDS4 geneencodesleucoanthocyanidindioxygenase(LDOX)
andisessentialforproanthocyanidinsynthesisandvacuolede-
velopment[ J].PlantJ., 2003, 35:624-636.