全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 2期，第 389-395页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.2, 389-395
研究报告
Research Report
蜻蜓凤梨 AfAG基因的克隆、载体构建及遗传转化
王之 1,2 石玲玲 2,3 李志英 2 雷明 2 徐立 2*
1海南大学园艺园林学院,海口, 570228; 2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部华南热带作物基因资源与种质创制重点开放
实验室,儋州, 571737; 3海南大学农学院,海口, 570228
*通讯作者, xllizhiying@vip.163.com
摘 要 本研究以蜻蜓凤梨为材料，利用 RACE技术获得一个与拟南芥 AGAMOUS (AG)同源的编码基因
cDNA，并将其命名为 AfAG。AfAG基因的 cDNA全长 1 422 bp,开放阅读框为 723 bp，可翻译成 240个氨基
酸。利用 NCBI对 AfAG蛋白进行序列分析，结果显示 AfAG蛋白含有MADS-box蛋白家族共有的功能结构
域：MADS 和 K-BOX 两个结构域。与水稻 (OsAG)；玉米 (ZmAGL)；拟南芥 (AtAG)；菜心 (BrAGL)；椰子
(CnAGL)；白兰花(MaAGL)的同源性比对结果分别为 65%、63%、68%、65%、83%、75%。本研究成功构建了
CaMV35S-AfAG过表达载体，用农杆菌介导的方法将表达载体成功转入到拟南芥中，为进一步研究蜻蜓凤
梨开花分子机理提供了理论依据。
关键词 AGAMOUS,基因, MADS-box家族,蜻蜓凤梨
Cloning and Overexpression Vector Construction of AfAG from Aechmea
fasciata
Wang Zhi 1,2 Shi Lingling 2,3 Li Zhiying 2 Lei Ming 2 Xu Li 2*
1 College of Horticulture, Hainan University, Haikou, 570228; 2 Institute of Tropical Crop Genetic Research, Chinese Academy of Tropical Agri-
cultural Sciences, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop Genetic Research and Germplasm Enhancement in Southern China,
Danzhou, 571737; 3 College of Agricultural, Hainan University, Haikou, 570228
* Corresponding author, xllizhiying@vip.163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000389
Abstract In this study, a cDNA homolog of AGAMOUS (AG) of Arabidopsis thaliana was isolated using rapid
amplification of cDNA ends (RACE) technology from Aechmea fasciata, and named it as AfAG. The full length
cDNA fragment of AfAG was 1 422 bp, which has an Open Reading Frame (ORF) of 723 bp and encodes a protein
of 431 amino acids. BLASTP analysis showed that AfAG has both MADS box and K box domains, which are
conserved in MADS box protein family. Phylogenetic analysis of AfAG indicated that the deduced protein had
65%、63%、68%、65%、83%、75% sequence identities with Oryza sativa, Zea mays, Arabidopsis, Brassica rapa,
Cocos nucifera and Michelia alba, respectively. Based on these, we successfully constructed 35S::AfAG
overexpression vector, and screened the positive transgenetic arabidopsis plants. Our studies provide some
theoretical research inspects of the flowering mechanism of Aechmea fasciata.
Keywords AGAMOUS gene, MADS-box gene family, Aechmea fasciata
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31372106)和中央级科研院所基本科研业务费专项(1630032014018)共同资助
观赏凤梨是重要的热带花卉，在中国的热带、亚
热带地区都有种植。作为观赏凤梨的一种，蜻蜓凤梨
(Aechmea fasciata)的花呈粉红色，故又名斑粉菠萝。
包括蜻蜓凤梨在内的观赏凤梨只有达到它们的生理
成熟期且一般只有在短日照和低温的环境下才会开
花(梁东成和黄万和, 2005)。针对其自然开花较慢的
缺点，生产上常常利用人工诱导剂如激素乙烯利等
诱导其开花(信彩云和李志英, 2009)。
MADS-box 蛋白质是一类 DNA结合转录因子
家族，它可以通过选择性地结合 C-A/T rich-GC (CArG)
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1蜻蜓凤梨总 RNA
Figure 1 Total RNA extracted from Aechmea fasciata
表 1 AfAG克隆及编码区扩增引物
Table 1 AfAG cloning and encoding sequence amplification primer
引物功能
Primer function
RACE-3克隆
Cloning of 3 RACE
RACE-5克隆
Cloning of 5 RACE
克隆载体插入片段检测
To detect fragment inserted in a cloning vector
AfAG编码区克隆
Cloning of the encode sequence
引物名称
Primer name
3-AfAG-out
3-AfAG-in
5-AfAG-out
5-AfAG-in
M13-R
M13-F
AfAG-SEN-KpnⅠ
AfAG-ANT-XbaⅠ
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
AGGTACAAGAAGGCCTGCTCCAAC
GAGCTCAAGCAACTCGAGAACCG
CGCTATTGTTCGAGTACTCGTAGAGGC
TGATCGAATCCGCGTGATTCCT
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
GGGTACCCATGGGGAGGGGGAAGATTGAGATC
CTCTAGAGTCAGAGCAAATTCTTGGAACCTTG
基序来激活或抑制目标基因的表达(Phanu, 2015)。
AG作为MADS-box基因家族的一员,是最早克隆到
的与花发育相关的调控基因。目前，已经在约 30种植
物克隆到了 AG同源基因，这些基因虽然在序列上会
有一些差异，但是功能都大致相近(龚霞峰等, 2009)。
在花的 ABCDE模型中，花器官的形成需要各
种基因的参与，MADS-box 基因在其中发挥了重要
的作用，除了 APETALA2 (AP2)，几乎所有的基因都
属于MADS-box基因，且序列在进化上都相对保守
(丛楠等, 2007)。在拟南芥的开花模型的 C类基因
中，AG是唯一克隆到的转录调控因子，它主要调控
雄蕊和心皮原基的发育, 决定了开花的成败，AG与
其他的基因也有着相互的作用，比如 A类基因 AP2
与 AG与在决定开花的过程中起到的作用是相互对
立的，LFY基因和 WUSCHEL (WUS)基因在花的第
3轮和第 4轮，也就是雄蕊和心皮原基的发育阶段正
调控 AG基因的表达(徐云远, 2005)。
本研究基于转录组数据结合 RACE技术从蜻蜓
凤梨中成功克隆到了 AG同源基因，并成功筛选到
了过表达转基因株系，为验证 AfAG的功能以及进一
步解析蜻蜓凤梨的开花机理提供了理论依据。
1结果与分析
1.1蜻蜓凤梨根、茎、叶总 RNA的提取质量
本研究提取蜻蜓凤梨茎尖、心叶的总 RNA，用
核酸蛋白分析仪测定其纯度和浓度，纯度：OD260/280
的比值为 1.8~2.0，浓度为 600~800 ng/μL，合格。通
过 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测(图 1)，有两条带。且
条带清晰符合实验要求，可以继续实验。
1.2蜻蜓凤梨 AfAG编码区序列全长的获得
对蜻蜓凤梨转录组分析，获得一个跟拟南芥 AG
基因同源的片段，据此片段设计引物，反向引物
5-AfAG-out (外侧)和 5-AfAG-in (内侧)，正向引物
3-AfAG-out (外侧)和 3-AfAG-in (内侧)（引物序列参
见表 1)。用 3-AfAG-out和 3-AfAG-in引物与接头引
物结合扩增 3RACE (图 2A)，以及用 5-AfAG-out和
5-AfAG-in引物与接头引物结合扩增 5RACE (图 2B),
这样得到了得到 3和 5两端的序列片段，分别送去
测序，根据测序的结果拼接出目的基因条带，为
1 422 bp，再使用开放阅读框得到 AfAG基因的 CDS
全长，为 723 bp。
1.3 AfAG基因的克隆
设计带有酶切位点的引物 AfAG-SEN-KpnⅠ和
AfAG-ANT-XbaⅠ进行 PCR扩增，得到条带(图 2C)，
与克隆载体连接，送测序，结果用 DNAMAN软件将
测序结果跟 RACE 得到的 AfAG 全长进行比对。
DNAMAN显示序列相同，证明已经获得了 AfAG的
编码区序列全长。
1.4蜻蜓凤梨 AfAG的生物信息学分析
1.4.1阅读框
蜻蜓凤梨 AfAG基因通过 RACE，得到的理论全
长为 1 422 bp，通过开放阅读框得到的编码区序列全
390
图 2 AfAG的 RACE PCR扩增及编码区序列全长克隆
注: M: DL2000 marker; A: 3-RACE PCR；B: 5-RACE PCR; C:
AfAG
Figure 2 RACE PCR amplification and cloning the full length en-
coding sequence of AfAG
Note: M: DL2000 marker; A: 3-RACE PCR; B: 5-RACE PCR;
C: AfAG
图 3 AfAG蛋白进化树分析
注:蜻蜓凤梨: AfAG
Figure 3 Phylogenetic tree analysis gene family of AfAG
Note: Aechmea fasciata: AfAG
长为 723 bp，可编码 240个氨基酸。
1.4.2基因系统进化树分析、同源性比对分析和结构
域分析
根据 AfAG基因的 CDS序列推导 AfAG的蛋白
序列，从 NCBI上下载与蜻蜓凤梨 AfAG同源的蛋
白，利用MEGA 6.0中的 ClustX多序列比对，使用邻
位相连法进行进化树分析(图 3)。结果表明：AfAG
蛋白与鸽石斛(DcAGL AAZ95251)亲缘关系较近。
从上述与蜻蜓凤梨 AfAG同源的蛋白中选择 6
个与 AfAG 同源性较高的热带物种，水稻 (OsAG
NP_001053649.1)；玉米 (ZmAGL NP_001105946.1)；
拟南芥(AtAG NP_001190766.1)；菜心(BrAGL XP_0-
09136978.1)；椰子(CnAGL AIK66813)；白兰花(MaA-
GL AFH74368.1)。其跟 AfAG的同源性分别为 65%、
63%、68%、65%、83%、75% (图 4)。然后用 NCBI的
Conserved domains对 AfAG蛋白进行分析，结果表
明 AfAG蛋白有两个结构域MADS_MEF2_like (my-
ocyte enhancer factor 2-like/TypeⅡsubfamily ofMADS
和 K-box(K-box supper family)蛋白结构域，分别位于
2~71 aa和 83~174 aa。
1.5 CaMV35S-AfAG表达载体的构建
提取 pEASY-blunt-AfAG的质粒，使用限制性内
切酶 XbaⅠ和 KpnⅠ切下目的片段(图 5A)，同时酶
切 CaMV35S空表达载体，使用 T4连接酶将目的基
因与空表达载体连接，转化大肠杆菌 DH5α，提取
CaMV35S-AfAG质粒，用相同的酶进行酶切检测(图
5B)，结果表明，构建过表达载体 CaMV35S-AfAG成
功，将CaMV35S-AfAG转化到农杆菌，菌液 PCR检测
到目的基因已成功转化到农杆菌EH105菌株(图 5C)。
1.6 AfAG转基因拟南芥阳性苗的检测与分析
在添加潮霉素和卡那霉素的 MS固体培养基上
对侵染过的转基因拟南芥 T0代种子进行筛选，得到
T1代苗，单株收集种子，在MS固体培养基上培养 T1
代种子，10 d后随机选取 2株野生型拟南芥和 12株
T2代转基因拟南芥植株，分别剪取 3~5片莲座叶，提
取单株的总 RNA，反转录成 cDNA，以此为模板，用
dh2o和野生型作为负对照，用 AfAG的特异引物进
行 PCR扩增，凝胶电泳显示，以野生型拟南芥和
dh2o为模板的 PCR没有目的片段的扩增，转基因阳
性苗能扩增出目的片段(图 6)。这个结果说明 CaM-
V35S-AfAG已经成功转入到拟南芥中。
2讨论
通过对 AfAG 蛋白的分析，我们发现它具有
蜻蜓凤梨 AfAG基因的克隆、载体构建及遗传转化
Cloning and Overexpression Vector Construction of AfAG from Aechmea fasciata
391
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4 AfAG蛋白同源比对分析
注: 框内为 MADS_MEF2_like 结构域和 K-box supper family 结构域; 蜻蜓凤梨: AfAG; 水稻: OsAG NP_001053649.1; 玉米:
ZmAGL NP_001105946.1;拟南芥: AtAG NP_001190766.1;菜心: BrAGL XP_009136978.1;椰子: CnAGL AIK66813.1;白兰花:
MaAGL AFH74368.1
Figure 4 Homology comparison analysis of AFAG
Note: Colum are MADS_MEF2_like domains and K-box supper family domains; Aechmea fasciata:AfAG; Oryza sativa:OsAG
NP_001053649.1; Zea mays:ZmAGL NP_001105946.1; Arabidopsis:AtAG NP_001190766.1; Brassica rapa:BrAGL XP_009136978.1;
Cocos nucifera:CnAGL AIK66813.1; Michelia alba:MaAGL AFH74368.1
MADS-box蛋白家族共有的功能结构域：MADS-box
和 K-box。在其他物种里，如拟南芥中，AG基因编码
产物的 MADS 蛋白域含有一个 C-A/T rich-GC
(CArG)基序，这对于 AG 与其他 DNA 的结合是必
须的(Phanu, 2015)。而 AG需要与其它的 MADS基
因相互作用才能发挥其功能，而这种作用需要 AG
的另一个结构域，即 K-BOX蛋白域的参与。本研究
里的蜻蜓凤梨 AfAG蛋白也具有这两个结构域，所
以我们推测它可以与其他的基因相互作用，共同调
控开花。
在 AG的进化树分析里，我们发现它与鸽石斛
的亲缘关系比较近，鸽石斛为兰科、石斛兰属、是一
种热带附生兰，而凤梨科植物也为热带附生草本植
物，说明其遗传背景相似。在进化树中，亲缘关系较
近的科也聚在了一起，比如兰科，说明 AG的基因序
列在进化上相对保守。
AG基因在拟南芥以及许多植物中的作用都得
到了证实，它控制花发育的第三轮与第四轮，也就是
392
图 5 CaMV35S-AfAG的构建
注: M1: DL15000 marker; M2: DL2000 marker;A: pEasy-blunt-
AfAG克隆载体的双酶切; B: CaMV35S-AfAG 过表达载体的
双酶切; C:农杆菌的 pcr检测目的条带
Figure 5 The structure of CaMV35S-AfAG
Note:M1:DL15000marker;M2:DL2000marker;A: pEasy-blunt-
AfAG cloning vector double enzyme digestion; B:CaMV35S-AfAG
double enzyme digestion C: Agrobacterium PCR detection target
strip
图 6对照和转基因植株的 PCR检测
注 : M: DL2000 marker; 1~12: 转 CAMV35S-AfAG 拟南芥植
株; 13~14:野生型拟南芥植株(对照);15:dh2o为模板(对照）
Figure 6 PCR test for comparison Arabidopsis plants and trans-
genic Arabidopsis plants
Note: M: DL2000 marker; 1~12: Transferred CAMV35S-AfAG
in Arabidopsis plants; 13~14: Wild type Arabidopsis plants
(Comparison); 15: dh2o (Comparison)
心皮和子房的发育，但是在蜻蜓凤梨里是否也是这
个作用呢？乙烯处理拟南芥可以延迟开花，但是乙烯
处理凤梨却可以使其提前开花，这说明拟南芥和蜻
蜓凤梨的开花机理存在着差异。在拟南芥中，与 AG
同源的基因 AGAMOUS-like 15 (AGL15)和 AGAMO-
US-like 18 (AGL18)，在它的双重突变体 agl15agl18里，
导致了提前开花(Phanu, 2015)，那么如果 AG 过表
达，是否会延迟开花呢？在蜻蜓凤梨里，AfAG的过表
达是否会延迟开花，或者有其他的表型，这些都有待
验证，本研究构建好了 CaMV35S-AfAG 过表达载
体，转入到拟南芥中，验证 AfAG基因的功能。为研究
蜻蜓凤梨的开花机理提供理论依据。
3材料与方法
3.1材料和试剂
蜻蜓凤梨(Aechmeafasciata)及拟南芥(Arabidops-
is thaliana) 由中国热带农业科学院热带作物品种资
源研究所、农业部华南热带作物基因资源与种质创
制重点开放实验室提供。农杆菌 EH105菌株、拟南芥
种子、植物表达载体 CAMV35S由本实验保存。
SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 试剂
盒由 clontech公司提供，克隆载体 pEasy-blunt、大肠
杆菌 DH5α、ransZol Plant试剂盒由北京全式金公司
提供，PrimescriptⅡ TM RT-PCR Kit 试剂盒、Primer-
Star DNA 聚合酶、T4连接酶由 TaKaRa 公司提供，
Gel Extraction Kit试剂盒、Plasmid Mini Kit试剂盒由
OMEGA公司提供。
3.2 蜻蜓凤梨总 RNA 的提取
蜻蜓凤梨总 RNA的提取采用 CTAB方法，方法
参照(郝宏刚等, 2012)。
3.3 蜻蜓凤梨总 RNA进行 RACE反转录
用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 试
剂盒(Clontech公司)进行 RACE反转录合成 5CNDA
和 3CNDA。用于 RACE PCR的扩增。
3.4 RACE获得 AfAG的 CDS全长
RACE PCR的扩增，参照(张鲲等, 2011)方法，得
到两条特异片段，与克隆载体 pEasy-blunt (北京全式
金公司)连接，转化到大肠杆菌 DH5α (北京全式金公
司的大肠杆菌感受态)，双酶切鉴定后，送英潍捷基公
司测序并拼接。
3.5生物信息学分析
利用 NCBI上的ORF finder (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html)查找 AfAG 的开放阅读框，推
测 AfAG的氨基酸序列，将得到的氨基酸序列通过
NCBI 的 Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行同
源性序列比对，下载与 AfAG蛋白同源的基因，用
MEGA6软件进行进化树分析;选择其中与 AfAG蛋
白同源性较高的基因，用 BioEdit软件进行同源蛋白
分析，用 NCBI上的 Conserved domains (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行保守结
构域的分析。
蜻蜓凤梨 AfAG基因的克隆、载体构建及遗传转化
Cloning and Overexpression Vector Construction of AfAG from Aechmea fasciata
393
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
3.6蜻蜓凤梨总 RNA进行普通反转录
用 PrimescriptⅡTM RT-PCR Kit 试剂盒(TaKaRa
公司)进行普通反转录，得到用于普通 PCR反应的模
板 CDNA。
3.7目的基因的克隆
根据RACE 拼接结果，利用 ORF finder 寻找
开放阅读框，用 Primer5.0 软件设计带有酶切位
点的引物，用 PrimerStar DNA 聚合酶 (TaKaRa)进
行 PCR 扩增目的基因，具体程序为，94℃ 5min；
94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min，共 32 个循环；72℃
10 min，4℃结束。 用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检
测。用 Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA)回收目的
条带，连接 pEasy-blunt 克隆载体，转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞，用 Plasmid Mini Kit 试剂盒
(OMEGA)提取质粒，KpnⅠ和 XbaⅠ双酶切鉴定，鉴
定成功后送测序。
3.8目的基因表达载体的构建
从测序成功的 pEasy-blunt-AfAG克隆载体的大
肠杆菌中提取质粒，双酶切目的基因与 CAMV35S
空载体，用 T4连接酶(TaKaRa)连接，提取质粒，酶切
验证，转化到农杆菌 EHA105感受态细胞，挑取单克
隆菌斑，进行 PCR检测，获得阳性菌液，用 50%的甘
油于-80℃保存。
3.9拟南芥的遗传转化
拟南芥的遗传转化参照杨彩云等(2009)方法。
3.10拟南芥阳性苗的 PCR鉴定
用 TransZol Plant试剂盒(北京全式金公司)提取
野生型和转基因拟南芥叶片的总 RNA，普通反转录
得到 CDNA，利用 AfAG-SEN-KpnⅠ和 AfAG-ANT-
XbaⅠ两对引物进行 PCR扩增检测，用 1.2%的琼脂
糖凝胶电泳检测。
作者贡献
王之是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，并完成数据分析和论文初稿的写作；石玲玲参与
实验执行，数据分析与文章修改；李志英参与文章修
改；雷明参与项目的构思，指导实验设计数据分析和
论文修改；徐立是项目的构思者及负责人，指导实验
设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读
并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31372106)和中央
级科研院所基本科研业务费专项(1630032014018)共
同资助。
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蜻蜓凤梨 AfAG基因的克隆、载体构建及遗传转化
Cloning and Overexpression Vector Construction of AfAG from Aechmea fasciata
Bioscience Methods (BM)
Bioscience Methods (ISSN 1925-1920) is an open access, peer reviewed journal published
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