全 文 ：2 9 0 0年 5月
第 4 6卷 第 3期
四川大学学报 (自然科学版 )
Jon r u al o f Si ehu an Un i r s v ei t y(N at r u al Sei en e e Edi ti on)
M
a y2 0 09
Vol
.
4 6 No
.
3
doi
:
10 39 9 6/ j
.
i s sn
.
0 49 0
一
7 6 6 5
.
2 0 09
.
0 3
一
0 7 5
紫茎泽兰多糖提取优化及抗氧化活性研究
苏文涛` , 皮宁宁` , 苏东海` , 谢 明 ` , 多 吉 2 , 高 平 `
(l
. 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都 6 1 0 0 6 4 ;
2
. 西藏大学经济与管理学院 , 拉萨 8 5 0 0 0 0)
摘 要 : 以 多糖得率为指标 ,选用正交试验对紫茎泽兰粗 多糖的提取工 艺进行优化 ,再经 乙醉
沉淀 、 脱蛋白和真空干燥后得到紫茎泽 兰多糖 ( E A )P . 结 果表 明紫茎泽 兰粗 多糖最佳提取工
艺为 : 温度为 10 0 ℃ , 在料液 比 1 , 20 下提取 Z h , 提取 2 次 . 用 脱氧核 糖体 系测 E A P 对
·
O H 的清除作用 ; 用硫代 巴 比妥酸法 测 小 鼠肝组织 丙二醛 ; 用 分光光度 法测 E A P 对郁苯三
酚 自氧化体 系的抑制 作用 . 结果表 明 : E A P 具有抗氧化 活性 , 以抑制体 外脂质过氧化效果最
为显著 .
关键词 : 紫茎泽兰 ; 正交试验 ; 多糖 ;抗氧化作用
中图分类号 : Q 9 4 6 文献标识码 : A 文章编号 : 0 4 9 0一 6 7 5 6 ( 2 0 0 9 ) 0 3一 0 514 一 0 5
O P t im u m i s o l a t i o n a n d a n t i o x i d a t i o n P r o P e r t i e s o f P o l y s a e e h a r i d e
f r o m E u P a t o
r i u m a d e n o P h o r u m S P r e n g
S U We
n 一 T a o
` ,
P l N i n g
一
N i
n g
` ,
S U D o n g
一
H
a i ` , X I E uY
e ’ , D 乙飞) J i Z , G月O P i n g `
( 1
.
K
e y L
a b o r a t o r y o f B i-o r e s o u r e e a n d E e o
一 e n v ir o n m e n t o f M in i
s t r y o f E d u e a t io n
,
C
o
ll
e g e o f L if
e
S
e i e n e e s
,
S i
e
h
u a n U n i v e r s i t y
,
C h e n g d u 6 1 0 0 6 4
,
C h i
n a
2
.
S
e h o o l o f E e o n o m y a n d M
a n a g e m e n t
,
T i b
e t U
n iv e r s i t y
,
L h a s a 8 5 0 0 0 0
,
C h i
n a )
A b s t r a e t : O p t im i
z a t i o n o f e x t r a e t io n p r o e e s s o f e r u d e E u P a t o
r i u m a d e n o P h o
r u m S p r e n g p o l y s
a e e h a r id e s
w a s i n v e s t i g a t e d b y o r t h o g o n a l t e s t s
.
T h e n t h e E u P a t o r i u m a d e n o P h o
r u m S p r e n g p o l y s a e e h a r id e ( E A P )
w a s o b t a i n e d a f t e r e t h a n o l
一
p r e e i p i t a t i o n
,
d e p r o t e i n i x a t i o n
, a n d v a e u u m d r y i n g
.
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t
t h e o P t im u m e o n d i t i o n s f o r t h e i s o l a t i o n w a s a s f o l l o w s
: t im e s o f e x t r a e t io n Z
,
t im e Z h
, t e m p e r a t u r e
10 0 ,C
,
m a t e r i a l t o w a t e r r a t i o l
, 2 0
.
T h e s e a v e n g i n g e f f e e t o f E A P o n h y d r o x y l r a d i e a l (
·
O H ) w a s
s t u d i e d i n d e o x y r ib o s e s y s t e m
.
T h e e o n t e n t o f M D A i n m i e e l i v e r w a s m e a s u r e d b y T B A a s s a y
.
S e l f
一 o x i
-
d a t i o n i n h ib i t i o n w a s s t u d i e d u s i n g t h e l
, 2 , 3
一
p h e n t r i o l w h i l e d e t e e t e d b y s p e e t r o p h o t o m e t r i e m e t h o d s
.
T h e r e s u l t s h o w e d t h a t E A P h a d t h e e f f e e t o f a n t io x id a t i o n
, e s p e e i a l l y i n m a r k e d l y in h ib i t i o n o f t h e p r o
-
d u e t i o n o f l i p i d p e r o x id e s i n n o r m a l l i v e r h o m o g e n a t e o f m i e e
.
K e y w o r d s : E u P a t o
r
i u m a d e n o P h o
r u m S p r e n g
, o r t h o g o n a l t e s t s
,
p o l y s a e e h a r id e s
, a n t i o x i d a t io n
1 引 言
紫 茎 泽 兰 ( E u p at or iu m a d en o p h or u m
S p r e n g )俗名破坏草 、解放草等 , 英文名为 C r o f t o n
w e d
,菊科泽兰属 多年生 、 丛生状半灌木植物 . _ 紫
茎泽兰排斥其他植物的生长 , 导致 土壤肥力严重
收稿 日期
作者简介
通讯作者
: 2 0 0 8
一0 8
一
2 2
: 苏文涛 ( 1 9 85一 ) , 男 , 硕士研究生 ,从事药用天然产物研究 , E一m a i l : f o r e s tw t@ 1 6 3 . e o m
: 高平 . E 一 m a i l : g a o p i n g s l 98@ s o h u . 。 o m
第 3期 苏文涛等 :紫茎泽兰 多糖提取优化及杭 氧化 活性研究
下降 , 土地严重退化 , 给蔓延 区 的农 林牧 副业带
来了严重危害 . 〔`〕鉴于紫茎泽兰已成为我国危害最
为严重的外来人侵物种之一 , 在加强研究控制紫
茎泽兰蔓延措施的同时 ,积极展开其有益活性物质
的研究 , 力图为变害为宝 ,综合利用开辟途径 . 在
利用紫茎泽兰生物活性成分的研究方面 ,主要集中
于昆虫拒食活性 、植 物生长 的双向调节作用 、 杀虫
和杀菌活性等 , 〔2一 `〕未见紫茎泽兰抗氧化活性的报
道 . 本实验室在前期进行杀菌 、 杀虫活性物质研究
中 ,发现紫茎泽兰水提物对小 白鼠的经 口急性毒性
为弱毒 ,且水提物 、多糖均具有一定的抗氧化作用 ,
为拓宽紫茎泽兰天然产物的开发利用途径 ,本文对
紫茎泽兰多糖的抗氧化活性及紫茎泽兰多糖 的最
佳提取工艺进行 了相关研究 .
2 材料与方法
2
.
1 材 料
实验动物 : 昆明种小鼠 ,雌雄各半 ,体重 20 士 2
g
, 由四川大学实验动物中心提供 .
供试植物 : 紫茎泽兰地上部分 , 采集 自四川省
西 昌市 .
2
.
2 方 法
2
.
2
.
1 紫茎泽兰多糖的提取与制备 将紫茎泽兰
晒干 , 打碎 , 以 5 , 1( 提取溶剂 /样品 , v/ w ) 的比
例加人 95 写乙醇浸提 3 次 , 滤渣挥干乙醇 ,用蒸馏
水作溶剂 , 按一定料液 比 、 水浴 温度 、 浸 提时 间 ,
在热水浴中浸提一段时间 , 提取液减压浓缩 , 4 ℃
乙醇沉淀 ,沉淀用水溶解 ,经 S e va g 法圈 除蛋 白 ,再
经浓缩醇析沉淀 (重复 3 次 ) , 沉淀用无水乙 醇 、 丙
酮 、 乙醚分别洗涤 , 真空干燥得土黄色紫茎泽兰多
糖 ( E A P ) .
粗多糖提取优化 : 采用 L g _ 3 _ 4 正交设计进行
优化 , 因素水平设计见表 1 . 每一处理用紫茎泽兰
25 .g
表 1 因素水平表
T a b
.
1 F
a e t o -r le v e l t a b le
水平 提取温度
(℃ ) ( A )
提取时间
( h ) ( B )
料液 比
( g / m L ) ( C )
提取次数
(次 ) ( D )
1 8 0 1 1
:
1 5 1
9 0 2 1
:
2 0
1 0 0 3 1
:
2 5
2
.
2
.
2 多糖含量的 测 定方 法 苯酚硫酸法 , 参照
文献 sj[ 进行 , 以葡萄糖为标准品 .
2
.
2
.
3 紫茎泽兰 多糖对 · O H 自由基的 清除试验
参照文献川配制 1 m L 的反应液 , 反应液中各试
剂终 浓 度 为 E D T A 1 . 0 4 m m o l / L , F e C 13 0 . 2
m m ol / L (与 E D T A 预 先按体 积 比 1 , 1 混合 ) ,
K H
Z P O
4 一
K
:
H P O
; 2 0 m m o l / L ( 内含 E A P 或 V 。 ) ,
H
Z
O
: 1 m m o l / L
,
V e 1 m m o l / L
, 脱氧核糖 ( D R )
2 8 m m o l / L
. 混匀后 3 7 oC 保温 l h , 再加人 2 8 9 / L
三氯乙酸 1 m L , 10 9 / L T B A l m L , 沸水浴煮沸
2 0 m in
, 冷却 . 不加脱氧核糖的反应混合液不发生
反应 , 作 为 比色时的空 白液 , 测 A 53 : , 计算清除
率 .
S 一「A 。 一 ( A l 一 A : ) ] / A 。 x 1 0 。%
其 中 A 。 为空 白吸光度 ; A l 为加人清除剂和 D R 后
吸光度 ; A : 为样品本身吸光度 (不加 D R ) .
2
.
2
.
4 紫茎泽兰 多糖对 0 2’ 一 自由基清除活 性
以邹国林 s[] 等的方法为基础并改进 , 即加人 0 . 01
m o l / L T r i s
一
H C I ( p H 8
.
2 0
, 内含 1 m m o l / L E D -
T A )缓冲液和二次蒸馏水 , 于 25 ℃恒温 20 m in
后加人 25 ℃ 预热过 的邻苯 三酚溶液 (3 m m ol / L
邻苯三酚于 10 m m ol / L H CI 中 ) , 迅速摇匀 , 立即
倾人光径 1 e m 比色杯中 , 在波长 3 2 5 n m 处每 0 . 5
m in 测定一 次 吸光值 A 32 5 n m , 自氧 化速 率控制在
0
.
0 6 m i n左右 ,测定 3 . 5 m i n . 在上述 T r i s 一 H C I缓
冲液中预先加人一定量 的 E A P 或 V 。 溶 液 , 再按
上述方法测定邻苯三酚的自氧化速率 ,表示为每分
钟 的光密度变化值 ( A ) .
抑制率 ( % ) 一 ( A 。 一 A ) / A 。 x l 。。%
其中 A 。 为空 白溶液 的光密度变化速率 ; A 为样品
溶液的光密度变化速率 .
2
.
2
.
5 紫茎泽兰 多糖对 小鼠肝组 织过氧化 脂质
( L P O )抑制 活性 参照文献 [ 9 , 10 〕方法 ,绘制丙二
醛 ( M D A , m a l o n a l d e h y d e ) 标准 曲线 , 求 出回 归方
程 .
依同样方法 ,取 2 m L S%肝匀浆液和 O . s m L
样 品液 (对照以等体积生理盐水代替样品液 ) 于试
管中混匀 , 37 ℃温育 Z h 后 ,使其充分氧化 . 恒温
后 ,在每管中加入 20 9 / L 三氯乙酸 1 . 5 m L , 以终
止反应 . 3 0 0 0 r / m i n 离心 1 5 m i n , 取上清 Z m L ,加
人 0 . 6 7% T B A 1 m L , 0 . 1 m of / L H C I 2 m L ,沸水
浴 ( 1 0 ℃ ) 1 5 m in , 取出迅速冷却 . 测定 A 53 : ,计算
抑制率 ,并 以 T E P 为标准物质 , l[ 〕计算过氧化脂
质的二级产物丙二醛的含量 , 即每克湿组织 中过氧
化脂质的生成量 ( n m o l / 9 t i s s u e ) .
四 川大学学报 (自然科学版 )第 46 卷
抑制率 ( % )一 (阴性对 照 组 L P O一 药 物组
L P O )/阴性对照组 L P O火 1 0 %
2
.
2
.
6 数据处理 为表示结果 , 不同实验间差异
用 T 检验 , 由 S A S 软件处理 .
3 结果与分析
3
.
1 紫茎泽兰多糖提取条件的优化
一般影响植物有效成分 的提取因素主要 有时
间 、 温度 、 料液比 、 提取次数等 ,作者在对多糖活性成
分的提取分别进行了单因素试验 的基础之上 , 选取
有效因素进行正交试验设计 ,结果见表 2 和表 .3
取工艺则为 : A 3 B Z C Z D : , 即温度为 10 ℃ , 在料液
比 1 : 2 0 下提取 Z h , 提取 2 次 .
3
.
2 E A P 对 · O H 的清除作用
E A P 对脱氧核糖一铁体系产生的 · O H 均表现
出一定的抑制作用 ,并随着浓度 的增加 ,清 除率增
大 (表 4 ) , E A P 浓度与清 除率存 在一 定的量效关
系 . 在 Z x lo 一 3 9 / m L 时 , E A P 有明显清除 · O H
的作用 , 抑制率为 37 . 24 写 , 略强于 同浓度下的维
生素 C ( 3 4 . 8 1% ) .
表 4 E A P 对 · O H 的清除作用
T a b
.
4 S e a v e n g i n g a e t iv i t ie s o f E A P fo r
.
O H
表 2 多糖提取正交实验结果
T a b
.
2 R e s u l t
s o
f
o r t h
o g o n a l t
e s t f
o r p o ly s a e e h a r id e
e X t r 8 C t l o fl
样品 质量浓度
( X 1 0一 3 9 / m L )
A
5 3 z
抑制率
( % )
e o n t r o l
因素 A B C D 多搪得率
( % )
1
.
2 16士 0 . 0 4 2
1
.
0 7 0士 0 . 0 1 5 1 2 . 0 2
1 1 1 1 1 2 3
.
6 1
2 1 1 2
3 7
.
2 4
2 8
.
1 8
1 6
.
3 0
0
.
9 6 0士 0 . 0 1 1
0
.
7 6 4士 0 . 0 2 5 件
0
.
7 9 3士 0 . 0 0 1 香 3 4 . 8 1
n = 3 ; 二 P < 0
.
0 5 ; 对比对照组
2 3
.
6 1
2 7
.
9 9
2 5
.
4 2
2 9
.
0 1
1八乙自勺
2 5
。
4 7
2 4
.
4 9
n乙ój1八
2 2
.
6 9 7 2 5
.
4 1 0 2 4
.
8 3 3 2 5
.
3 6 3
2 5
.
6 7 3 2 7
.
2 1 3 2 5
.
4 2 7 2 7
.
5 3 7
2 6
.
3 2 3 2 2
.
0 7 0 2 4
.
4 3 3 2 1
.
7 9 3
3
。
6 2 6 5
.
1 4 3 0
.
9 9 4 5
.
7 4 4
3KZR
表 3
T
a b
.
3
方差分析表
A
n a
ly
s is o f
v a r ia n e e
方差来
源 S V
偏差平方
和 5 5
自由度
d f
均方
M S
显著性
50
.
4 5 4 2 5
.
2 2 7 3 3
.
6 58 关
4 0
.
8 6 1 2 0
.
4 3 0 2 7
.
2 59 朴
3
.
3 E A P 对邻苯三酚 自氧化的抑制
邻苯三酚在碱性条件下能迅速发生 自氧化反
应 , 生成 O牙一 和有色中间物 , 其反应速度依赖于
自氧化反应所产生的 O牙一 浓度 , 本实验邻苯三酚
自氧化曲线在 3 . 5 m in 内线性关系 良好 , 0 2’ 一 生
成量和中间产物较稳定 , 故可以用不 同质量浓度
的 E A P , 测定 E A P 对邻苯三酚 自氧化速率的抑制
作用 . E A P 能清除邻苯三酚 自氧化反应所产生的
O玄一 ,其抑制率随 E A P 质量浓度的增加而增加 (表
5)
,在 E A P 质量浓度为 2 只 10 一 3 9 /m L 时 ,抑制率
为 3 0 . 6 7% ,与 V 。 ( 0 . 0 5 又 1 0 一 ’ g / m L )相当 . 说明
E A P 对邻苯三酚 自氧化体 系产生的 0 牙一 有一定
的清除作用 ,但明显弱于 V .c
表 5 E A P 对邻苯三酚自氧化 的抑制
T a b
.
5 E f f
e e t o f E A P o
n t h
e s e l f
一 o x i d
a t i o n
o f l
,
2
,
3
一
Ph e n t r io l
2 2
.
4 36 1 1 2 1 8 1 4
.
9 67
误差 e
总和
1
.
4 99 0
.
7 5 0
样 品 质量浓度
( X 10
一 3 9 /m L )
△ A /△ t 抑制率
(% )
1 1 5
.
25 0 8 e o n t r o l 0 0
.
0 6 0士 0 . 0 0 2
注 : F o . 。 x ( 2 , 2 ) = 9 9 , F o . 。 5 ( 2 , 2 ) = 1 9 E A P 0 . 5 0 . 0 5 2士 0 . 0 0 3 . 12 . 7 5
0
.
0 4 4士 0 . 00 2 二 2 5 . 6 2
由表 2 的极差值 R 和表 3 的分析结果可以看
出 , 4 种因素对总多糖提取的影 响程度为 : D > B
> A > C
, 其中提取次数影响最为显著 , 提取时
间其次 , 料 液比影 响最小 . 紫茎泽兰多糖最佳提
2 0
.
0 4 1士 0 . 0 0 2 脸 .
0
.
0 5 0
.
0 4 1士 0 . 0 0 1 二
30
.
6 7
30 6 7
n = 3 ; 二 P < 0
.
0 5 ;
, ,
P < 0
.
0 1 ;对 比对照组
第 3期 苏文涛等 :紫茎泽 兰 多糖提取优 化及杭氧化活性研究
3
.
E 4A P对小鼠肝组织过氧化脂质抑制活性
过氧化脂质 L PO, 是生物膜和亚细胞膜 中磷
脂质所含多元不饱和脂肪酸被 自由基损伤 、 氧化而
成的过氧化产物 . 过氧化脂质 的二级分解产物丙
二醛能与硫代巴 比妥酸反应生成红色产物 ,在波长
5 3 2 n m 有最大吸收可进行 比色测定 . 又因四乙氧
基丙烷与过氧化脂质在 同一条件下进行反应均产
生丙二醛 (M D A ) , 因此用 四乙 氧基丙烷做标准物
质 , 绘制丙二醛标准 曲线 , 求 出相应 回归方程 (见
表 6) . 同时 ,从表 7 可 以看出在有 E A P 时 , 丙二
醛生成量有明显减少 , 当 E A P 的质量浓度在 0 . 5
x 1 0 一 ’ g /m L 时 ,具有极 明显的抑制正常小鼠肝组
织在体外的过氧化脂质生成 , 抑 制率达 86 . 19 % ,
与同浓度下的 B H T (8 7 . 07 % )相 当 .
表 6
T a b
.
6
M D A 标准 曲线
M D A
s t a n d
a r
d
e u r v e
浓度 (产m o l / L ) 1 0 2 0 3 0 4 0
吸光度 A
回归方程
0
.
0 62 0
.
0 8 8 0
.
18 1 0
.
25 7 0
.
3 65 0
.
4 0 7 0
.
9 7 5 1
.
4 0 3 1
.
7 8 6
C = 2 1
.
8 8 2A + 0
.
0 0 9 , R z = 0
.
9 9 7
表 7 E A P 对小 鼠肝组织过叙化脂质 ( L P O )抑制活性
T
a b
.
7 E f f
e e t o f E A P o n m ie r o s o m a l l i P id P e r o 元d a t io n
样品 质量浓度
( X 10
一 3 9 / m L )
e o n t r o l
L P O 士 5 . D .
( n m o l / 9 t is s u e )
36 6 1 7 6士 1 . 6 7 4
抑制率
( % )
E A P 3 2 6
.
5 6 9土 3 . 2 2 2 1 0 . 82
1 5 0
.
4 1 9士 0 . 4 3 7 份 5 8 . 9 4
4 9
.
32 4士 1 . 6 7 4 二 8 6 . 1 9
B H T 2 5
.
2 5 4士 0 . 4 3 7 . 份 8 7 . 0 7
, = 3 ;
,
P < 0
.
0 5 ;
, ,
P < 0
.
0 1 ; 对 比对照组
4 讨 论
中草药和天然产物是活性多糖的主要来源 , 特
别是从药用植物 中分离得 到的具有水溶性 的多糖
类化合物最为重用 , 植物多糖没有细胞毒性 , 而且
药物质量通过化学手段容易控制 , 已成为当今新药
发展的方向之一 12[ 〕本实验以 多糖得率为指标 ,对
紫茎泽兰粗多糖提取优化的结果为 : 提取次数影响
最为显著 , 提取时间其次 , 料液 比影响最小 .
来源于阳光 、 紫外线 、 化学反应和代谢作用的
活性氧会产生一系列的病理作用 , 比如 引起 D N A
损伤 、 致 癌 、 细胞 功 能衰 退 所 导 致 的机 体 老 化
等 . ls[ 一 ` 5〕其中 ,超氧阴离子 自由基 ( O牙一 )和经 自由
基 ( · O H )是最具代表性的两种 自由基 . 另一类对
生命有机体产生重大影 响的氧化作用是脂质过氧
化反应 . 过氧化脂 质的生成使细胞膜的脂 质组成
发生变化 , 并导致细胞膜 内酶与蛋 白质变性 , 破环
了细胞结构与功能 ,这种 自由基导致脂质过氧化反
应的非组织特异性 , 使得体 内重要脏器如肝 、 脑 都
有受害的可能 . 〔` 6〕由本实验可知 , 紫茎泽兰多糖能
一定程度的清除超氧 阴离子 、 经基 自由基 , 阻断或
终止脂质过氧化 . 在相 同的质量浓 度 (0 . 5 只 10 一 3
g / m )L 下的紫茎泽 兰多糖对上述三种 自由基 的清
除率分别为 12 . 02 % , 1 2 . 75 % 和 86 . 19 % , 说明 , 紫
茎泽兰多糖中断或终止脂质过氧化更有效 . C uz oz -
c r e 。 等 vl[ 〕的研究证实不少疾病如肿瘤 、 炎症 、 衰老
等的起因和发展与 自由基和脂质过氧化作用有关 .
因此 ,紫茎泽 兰多糖在防衰老 、 抗肿瘤和抗炎 等方
面的作用有待进一步研究 .
紫茎泽兰材料易得 , 来源广泛 , 其多糖成分在
抗氧化活性试验 中所表现 出的潜力 , 对于食品 、 医
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【责任编解 : 白林含〕