全 文 ：收稿日期:2012 － 11 － 10
基金项目:国家自然科学基金项目(31060123，30760025) ;海南省自然科学基金项目(311021，312056) ;海南大
学教育教学研究课题立项项目 (hdjy0920) ;东莞市高等院校、科研机构科技计划项目
(2011108102039，2012108102054)
作者简介:王雪兵(1985 －) ，男，四川广安人，东莞植物园研究实习员，硕士．
通信作者:胡新文，男，教授． E-mail:hqx888999@ 163． com
第 3 卷 第 4 期 热 带 生 物 学 报 Vol． 3 No． 4
2012 年 12 月 JOURNAL OF TROPICAL ORGANISMS Dec. 2012
文章编号:1674 － 7054(2012)04 － 0379 － 05
巢蕨基因组 DNA提取与 RAPD反应体系优化
王雪兵1，4，于旭东1，3，朱会军1，2，吴繁花1，黄小凤4，胡新文1
(1．海南大学 农学院，海南 海口 570228;2．贵州大学 精细化工研究
开发中心 /绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地 /教育部重点实验室，贵州 贵阳 550000;
3．海南大学 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口 570228;4．东莞植物园，广东 东莞 523086)
摘 要:以新鲜幼嫩的巢蕨叶片为材料，优化了巢蕨叶片基因组 DNA 的提取方法与 RAPD 反应体系。结果
表明，利用改进的 CTAB方法，能够提取出高质量的巢蕨基因组 DNA;优化的巢蕨 RAPD的最终反应体系(25
μL)为:模板 DNA(50 mg·L －1)1． 5 μL，引物(1 mmol·L －1)1． 5 μL，2 × EasyTaq PCR SuperMiX 12． 5 μL 。
关键词:巢蕨 Neottopteris nidus;DNA提取;RAPD;分子标记
中图分类号:Q 949． 36 文献标志码:A
巢蕨(Neottopteris nidus (L．)J． Sm．)是分布于旧世界热带地区［1 － 3］的大型附生蕨类植物。它附生于
雨林或季雨林的树干或林下石头上，成一大丛而中空，能承接枯枝落叶和雨水等成分。这些成分经过一
系列物理、化学过程及生物相互作用形成巢蕨基质。转化而来的巢蕨基质提供巢蕨本身所需的营养物
质，这种营养方式能使巢蕨生长发育成巨大植株，湿重达 200 kg［4］，且对巢蕨基质的形成及雨林生态产生
重要影响［5］。巢蕨奇特的营养方式，独特的生活环境引发了研究者对这类附生蕨类植物的遗传多样性与
遗传结构的兴趣。RAPD分子标记能极其灵敏地揭示 2 个亲缘关系十分接近的个体之间的遗传变异，因
此，它适合于检测种以下水平的多样性。近年来，运用 RAPD 标记开展濒危植物居群的保育遗传学研究
受到重视。人们已经对猪血木(Euryodendron excelsum)个体［6］，长叶榧(Torreya jackii)居群［7］、崖柏(Thuja
sutchuenensis)居群［8］、白豆杉(Pseudotaxus chienii)居群［9］、长叶红砂(Reaumuria trigyna)居群［10］等一大
批珍稀濒危植物的遗传多样性进行了分析并提出了相应的保育策略。因此，应用分子标记技术来研究这
类大型附生蕨类植物的遗传多样性非常有意义。笔者优化了巢蕨的基因组 DNA 提取方法和 RAPD 反应
体系，以期建立一个稳定的 RAPD反应体系，为今后开展巢蕨居群的遗传多样性分析提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验材料 实验材料取自海南大学儋州校区农学院教学科研基地迁地保育的巢蕨的嫩叶。
1． 1． 2 试剂与引物 溴酚蓝、氯化钠、φ = 2%的 β －巯基乙醇、Tris －平衡酚、无水乙醇、异戊醇等均为国
产分析纯;CTAB，SDS，PVP，EDTA，RNase 均购于上海生工;2 × EasyTaq PCR SuperMiX(包含 EasyTaq
DNA聚合酶、dNTPs 和优化的反应缓冲液，浓度 2 ×)购于北京 Trangen company;琼脂糖购于 Gene Tech
(Shanghai)company;CTAB抽提缓冲液(10 mmol·L －1的 Tris-HCl pH8． 0，1． 4 mol·L －1的 NaCl，w = 2%
的 CTAB ，20 mmol·L －1的 EDTA，w = 2%的可溶性 PVP) ;氯仿 －异戊醇混合液(V氯仿 ∶V异戊醇 = 24∶1) ;
DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.2012.04.019
酚 －氯仿 －异戊醇混合液(V酚 ∶V氯仿 ∶V异戊醇 = 25∶24∶1)。100 条长度为 10 bp的随机引物由上海生物工程有
限公司合成。
1． 1． 3 主要仪器 德国 EPPENDROF冷冻离心机、德国 Biotra PCR仪、德国 TGRADIENT梯度 PCR仪、上
海 Unico分光光度计(UV －2000)、北京佰亿新凝胶成像系统(Tanon4100)等。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA 提取 CTAB 用量与不同 NaCl 浓度的处理组合为:①w = 1%的 CTAB，1． 4 mol·L －1的
NaCl;②w = 1%的 CTAB，2． 5 mol·L －1的 NaCl;③w = 2%的 CTAB，1． 4 mol·L －1的 NaCl;④w = 2%的
CTAB，2． 5 mol·L －1的 NaCl;⑤w = 3%的 CTAB，1． 4 mol·L －1的 NaCl;⑥w = 3%的 CTAB，2． 5 mol·L －1的
NaCl;⑦w = 4%的 CTAB，1． 4 mol·L －1的 NaCl;⑧w = 4%的 CTAB，2． 5 mol·L －1的 NaCl。采用改良的
CTAB法(在文献［11］的基础上，进行改进)提取巢蕨基因组 DNA，具体操作步骤如下:(1)在 65 ℃水浴中
预热 CTAB抽提缓冲液;(2)称取幼嫩叶片约 300 mg置于研钵中，用液氮研磨至粉状，然后迅速装入 2 mL
的离心管中;(3)依序加入 1． 5 mL的 w = 2%CTAB抽提缓冲液和 20 μL的 β －巯基乙醇，摇匀;(4)将离心
管置于 65 ℃的水浴锅中，每 5 min 摇动 1 次，混匀，30 min 后取出;(5)冷却 2 min 后，于 25 ℃ 12 000 r·
min －1离心 15 min;(6)取上清，加入相同体积的 Tris －平衡酚，摇匀成乳浊状，于 4 ℃ 12 000 r·min －1离心
20 min;(7)取上清，加入相同体积的酚 －氯仿 －异戊醇混合液(V酚 ∶V氯仿 ∶V异戊醇 =25∶24∶1) ，于 4 ℃ 12 000 r·
min －1离心 20 min;(8)重复步骤(7) ;(9)取上清，加入相同体积的氯仿 －异戊醇混合液(V氯仿 ∶V异戊醇 =24∶1) ，
于 4 ℃ 12 000 r·min －1离心 20 min;(10)用移液枪吸取 200 μL上清转入 2 mL的离心管中，依序加 1 /10
体积的醋酸钠溶液(pH5． 2)和 － 20 ℃的无水乙醇 400 μL，慢慢上下摇动离心管 30 s，－ 20 ℃沉淀 30 min;
(11)4 ℃ 12 000 r·min －1离心 10 min，倒掉液体;(12)加入 φ = 70%的乙醇进行漂洗，重复 1 次，注意勿将
白色 DNA沉淀倒出;(13)吸出乙醇后，置于超净工作台里风干 DNA 1． 5 ～ 2 h;(14)加入 50 μL 的 TE 缓
冲液溶解 DNA，再加入 0． 5 μL的 RNase，于 37 ℃水浴 30 min，冷却后检测，保存于 － 20 ℃冰箱中。
1． 2． 2 DNA纯化 按文献［12］的方法进行 DNA的纯化。
1． 2． 3 DNA纯度检测 分光光度计检测:取 DNA 原液 5 μL，用 TE 稀释 100 倍，用 UV － 2000 型紫外分
光光度计测定 260，280 nm处的吸光值。根据 260 nm处的吸光值计算 DNA 浓度;根据 OD260 / OD280比值
判断有无多糖、蛋白质、RNA等杂质，从而确定 DNA的纯度。琼脂糖凝胶电泳检测:取 5 μL DNA原液，加
入 1 μL的 6 ×溴酚蓝，混匀，点入 w = 0． 8%琼脂糖凝胶中，用 1 × TAE缓冲液，2． 5 V·cm －2电泳 1． 5 h，凝
胶成像系统(Tanon4100)观察拍照记录。检测 DNA的完整性，并根据分子质量标准判断 DNA分子大小。
1． 2． 4 RAPD反应体系 RAPD-PCR的扩增程序为:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，30 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 45 s，进行 5 个循环;94 ℃变性 30 s，48 ℃变性 30 s，72 ℃延伸 45 s，进行 35 个循环;72 ℃终延
伸 7 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物采用 w = 1． 0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
为增加结果的可靠性和提高反应体系的稳定性，在 RAPD-PCR 扩增反应体系中，进行了不同模板
DNA用量(DNA质量浓度为 50 mg·L －1)和不同引物(浓度为 1 mmol·L －1)上样体积的试验。模板 DNA
体积梯度:0． 5，1． 0，1． 5，2． 0，2． 5 μL;引物体积梯度:1． 0，1． 5，2． 0，2． 5，3． 0 μL。用 2 号和 28 号引物进行
扩增，重复 1 次。为了筛选每条引物的最适退火温度，本实验设 12 个梯度进行筛选。用筛选出的引物和
优化后的 RAPD-PCR反应体系对材料进行 PCR扩增。
2 结果与分析
2． 1 巢蕨基因组 DNA提取 实验结果表明:处理③(w = 2%的 CTAB，1． 4 mol·L －1的 NaCl)提取 DNA
的效果较好，提取的 DNA条带清晰可见，无 RNA，无降解现象(图 1) ;DNA质量浓度为 80 ～ 100 mg·L －1，
OD260 / OD280比值为 1． 78 ～ 1． 96，说明 DNA纯度高，蛋白质、酚类及多糖等杂质去除完全。
083 热 带 生 物 学 报 2012 年
8 97654321M 15 M161413121110
23 130 bp
9 416 bp
6 557 bp
2 322 bp
2 027 bp
图 1 巢蕨基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
2． 2 巢蕨基因组 DNA的 RAPD反应体系的优化 实验结果表明:模板用量为 1． 5 μL时，可扩出全部产
物，且条带清晰，0． 5 μL时，重复差，1 μL时，带型不整齐(图 2) ;引物体积在 1． 5 μL时，能扩出全部产物，
带型均匀(图 3)。
M 0.5 μL 1.5 μL 2.5 μL1.0 μL 2.0 μL M M
M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1.0 μL 2.0 μL 3.0 μL1.5 μL 2.5 μL M M
M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
0.5 μL 1.5 μL 2.5 μL1.0 μL 2.0 μL 1.0 μL 2.0 μL 3.0 μL1.5 μL 2.5 μL
图 2 模板体积优化 图 3 引物体积优化
经过优化后的巢蕨 RAPD-PCR扩增反应体系为:总反应体积 25 μL，模板 DNA(50 mg·L －1)1． 5 μL，
引物(1 mmol·L －1)1． 5 μL，2 × EasyTaq PCR SuperMiX 12． 5 μL，ddH2O 9． 5 μL。
根据所购引物的理论退火温度，设计了 12 个退火温度:46． 5(A) ，46． 6(B) ，46． 8(C) ，47． 1(D) ，47． 5
(E) ，47． 8(F) ，48． 2(G) ，48． 9(H) ，49． 2(I) ，49． 3(J) ，49． 4(K) ，49． 5(L)℃，运用上述优化后的反应体系
对所购引物进行退火温度筛选，若上述温度范围不能筛选出最适合的退火温度，则调整扩大梯度 PCR 的
梯度温度范围直到筛选出最适合的退火温度。从图 4 中可以看出，引物 WR02(退火温度为 49． 5 ℃)和
WR06(退火温度为 46． 6 ℃)能扩增出较多且清晰的条带。
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M M
Primer code WRO2 Primer code WRO6
J KIHGFEDCBA J KIHGFEDCBA LL
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M
图 4 退火温度对 RAPD-PCR的影响
183第 4 期 王雪兵等:巢蕨基因组 DNA提取与 RAPD反应体系优化
对 100 条 RAPD引物进行随机筛选，筛选出了能产生清晰的带型的 10 条引物，这些引物具有很好的
多态性和良好的重复性。从表 1 可以看到每条引物对应的序列号、理论退火温度、最适退火温度。图 5 是
引物 WR23 对 3 个巢蕨居群 60 个个体样品扩增的结果。从图 5 可以看出，扩增的带型既有相同的带型又
有差异带型，带型均匀清晰，对照 CK没有任何带型，说明建立的体系稳定有效。
表 1 10 条筛选出的 RAPD引物序列与其对应的最适退火温度与理论退火温度
引物 序列(5—3) 理论退火温度 /℃ 最适退火温度 /℃
WR02 AACCGCGGCA 34 49． 5
WR03 AACGGGCGTC 34 40． 1
WR06 AAGCGACCTG 32 46． 6
WR15 ACGAGCATGG 32 47． 8
WR20 AGATGCGCGG 34 36． 6
WR23 AGTCACTCCC 32 40． 8
WR28 CAGTGCCGGT 34 49． 4
WR39 CCTCACGTCC 34 39． 0
WR65 GGGAACCCGT 34 40． 1
WR94 TTCCGCCACC 34 36． 6
M
M
M
M
M
M
MCK
1 500 bp
500 bp
100 bp
1 500 bp
500 bp
100 bp
图 5 RAPD引物 WR23 对 3 个巢蕨居群 60 个个体样品扩增的带型
3 讨 论
巢蕨因富含多酚、多糖等次生代谢产物给 DNA的提取带来了困难。目前常用的植物 DNA 的提取方
法主要有 CTAB法、SDS 法及高盐低 pH法等［13］。近年来，学者对蕨类植物 DNA提取进行诸多尝试，已成
功地提纯了一些蕨类植物的 DNA［14 － 18］。李先进等［19］认为，对药用蕨类植物大叶贯众(Cyrtomium macro-
phyllum)、掌叶铁线蕨(Adiantum pedatum)、凤尾蕨(Pteris cretica)、石韦(Pyrrosia lingua)而言，改进的
CTAB优于 SDS法;在多糖含量高的类群可增加 CTAB的浓度［20 － 21］。本实验结果表明，使用改进的 CTAB
法，能够快速提取出高纯度、高质量的巢蕨 DNA，能够满足进一步的研究需要。
对于要求检测大量样本的遗传多样性和居群遗传结构研究来说，检测手段的实验稳定性至关重
要［22］。所以有必要针对不同的实验材料进行 RAPD 反应体系的优化。主要影响反应体系的因素有模版
DNA、引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR程序等。本实验中的 2 × EasyTaq PCR SuperMiX 已经包含 Eas-
yTaq DNA聚合酶、dNTPs 和优化的反应缓冲液、浓度 2 ×，所以无需对 Taq DNA 聚合酶、dNTPs 及其缓冲
液优化，只需对模版 DNA、引物进行优化。PCR程序为:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，30 ℃退火 30
283 热 带 生 物 学 报 2012 年
s，72 ℃延伸 45 s，进行 5 个循环;94 ℃变性 30 s，48 ℃变性 30 s，72 ℃延伸 45 s，进行 35 个循环;72 ℃终
延伸 7 min，4 ℃保存。本实验优化出巢蕨 RAPD的最终反应体系(25 μL)为:模板 DNA(ρ = 50 mg·L －1)
1． 5 μL，引物(1 mmol·L －1)1． 5 μL，2 × EasyTaq PCR SuperMiX 12． 5 μL。实验证明，该体系引物扩增出
的条带清晰、多态性条带谱具有重复性。
致谢:海南大学的姜艳、冯耀文、司更花、陈吉良、李江渝、周双清和中国热带农业科学院品种资源研究所的黄明忠在实
验过程中给予了帮助，特此致谢!
参考文献:
［1］HOLTTUM R E． Asplenium Linn． sect． Thamnopteris Presl［J］． Gardens’Bulletin，Singapore，1974，27:143 － 154．
［2］BENZING D H． Vascular Epiphytes:General Biology and Related Biota［M］． Cambridge:University of Cambridge Press，1990:
354．
［3］HUANG T C． Flora of Taiwan［M］． Taipei:Editorial Committee of the Flora of Taiwan，1994:648．
［4］ELLWOOD M D F，FOSTER W A． Doubling the estimate of invertebrate biomass in a rainforest canopy［J］． Nature，2004，429:
549 － 551．
［5］王雪兵，黄勇，杨琪，等．巢蕨基质的形成及其对雨林生态的影响［J］．仙湖，2010，9(3 /4) :66 － 68．
［6］王艇，苏应娟．中国特有极度濒危植物猪血木的保护遗传学研究［J］．中山大学学报:自然科学版，2005，44 (1) :68 － 71．
［7］李建辉，金则新，李钧敏．濒危植物长叶榧群体遗传多样性的 RAPD分析应用［J］．应用生态学报，2007，18(12) :2661 －
2667．
［8］刘建锋，肖文发．濒危植物崖柏遗传多样性的 RAPD分析［J］．江西农业大学学报，2008，30 (1) :68 － 72．
［9］王艇，苏应娟，欧阳蒲月，等．利用 RAPD 标记分析濒危植物白豆杉种群的遗传结构［J］．生态学报，2006，26(7) :2313 －
2316．
［10］张颖娟，王玉山．濒危灌木长叶红砂遗传多样性 RAPD的分析［J］．生物学杂志，2008，27 (2) :157 － 161．
［11］DOYLE J J，DOYLE J L． A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］． Phytochem Bul，1987，
19:11 － 15．
［12］邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记［M］．北京:科学出版社，2001:128．
［13］周延清，杨清香，张改娜．生物遗传标记与应用［M］．北京:化学工业出版社，2008:28 － 93．
［14］付再萍．狗脊蕨(Woodwardia japonica(L． f．)Sm)基因组 DNA提取与随机扩增多态性 DNA(RAPD)的优化［J］．杭州
师范学院学报:自然科学版，2007，6(2) :129 － 132．
［15］沈洁，罗安才．提取蕨类植物 DNA方法比较［J］．安徽农业科学，2010，38(4) :1738 － 1740．
［16］陈进明，王青峰．珍稀濒危蕨类植物东方水韭的遗传多样性［J］．武汉植物学研究，2006，24 (6) :569 － 573．
［17］陈进明，刘星，王青峰．中国珍稀濒危特有蕨类植物———云贵水韭的遗传多样性［J］．武汉大学学报:理学版，2005，51
(6) :767 － 770．
［18］陈进明，王晶苑，刘星．中华水韭遗传多样性的 RAPD分析［J］．生物多样性，2004(12) :348 － 353．
［19］李先进，彭正松，张正英，等．四种药用蕨类 DNA提取的比较研究［J］．绵阳师范学院学报，2008，27(8) :67 － 69．
［20］AITCHITT M，AINSWORTH C C，THANGAVELU M． A rapid and efficient method for the extraction of total DNA from mature
leaves of the date palm (Phoenix dactylifera L．) ［J］． Plant Molecular Biology Reporter，1993，11(4) :317 － 319．
［21］MAGUIRE T L ，COLLINS G G，SEDGLEY M． A modifies CTAB DNA extraction procedure for plants belong to the family
Proteaceae［J］． Plant Molecular Biology Report ，1994 ，12 (2) :106 － 109．
［22］钱韦，葛颂，洪德元．采用 RAPD和 ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性［J］．植物学报，2000 ，42(7) :741 －
750．
(下转第 386 页)
383第 4 期 王雪兵等:巢蕨基因组 DNA提取与 RAPD反应体系优化
植物学会，2003:488．
［20］文伟．骨碎补愈伤组织的诱导及无性系建立的研究［J］．黑龙江农业科学，2010(2) :3 － 6．
［21］檀龙云，刘宝东，张凌献．骨碎补科两种植物配子体发育的研究［J］．武汉植物学研究，2008，26(3) :219 － 223．
［22］徐艳，李扬，李东，等．槲蕨配子体形态发育研究［J］．热带亚热带植物学报，2009，17(1) :12 － 16．
［23］吴艳芳，尤敏，王新胜，等．槲蕨配子体发育影响因素的初步研究［J］．武汉植物学研究，2005，23(5) :461 － 463．
［24］刘闻川，俞慧娜，戎华磊，等．不同光照条件对槲蕨组织培养外植体褐化的影响［J］．广东农业科学，2008(8) :22 － 25．
Research Advances on Propagation of Drynaria fortunei
LI Cui，HUANG Xue-yan，LV Hui-zhen，HUANG Bao-you，ZHANG Zhan-jiang
(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Guangxi Key Laboratory for Conservation and
Genetic Improvement of Medicinal Plant Resources，Nanning 530023，China)
Abstract:Drynaria fortune，a medicinal fern，is used as a kind of medicine to improve bone cell activities，pre-
vent the toxic，reduce blood lipid and so on． The researches on D． fortune were mainly focused on the herbal-
ism，pharmacological action，chemical constituents，physiology and artificial propagation． In recent years wild
D． fortunei resources have sharply decreased as their living environment has been damaged due to their excessive
collection driven by market demand． For conservation and sustainable utilization of the wild resources the meth-
ods for propagation of D． fortunei were reviewed based on available literature． Clearly，the tissue culture is the
best way to propagate D． fortune in the future and problems arising from D． fortunei propagation are pointed out．
Key words:Drynaria fortune;sporogony;rhizome division;tissue culture
(上接第 383 页)
Extraction of Genomic DNA of Neottopteris nidus and Optimization
of the RAPD Reaction System
WANG Xue-bing1，4，YU Xu-dong1，3，ZHU Hui-jun1，2，WU Fan-hua1，HUANG Xiao-feng4，HU Xin-wen1
(1． College of Agronomy，Hainan University，Haikou 570228，China;2． Research and Development Center for Fine Chemicals /
State Key Laboratory Breeding Base for Green Pesticide and Agricultural Bioengineering / Ministry of Education Key Laboratory，
Guiyang，Guizhou 550000，China;3． Ministry of Education Key Laboratory for Conservation and Utilization of Tropical Crops
Germplasm Resources，Haikou 570228，China;4． Dongguan Botanic Garden，Dongguan，Guangdong 523086，China)
Abstract:In order to study the genitic diversity and genetic structure of Bird’s nest fern (Neottopteris nidus)
populations，fresh tender fronds of the Bird’s nest fern were collected and resorted to genomic DNA extraction
through optimized RAPD reaction system by using different concentrations of CTAB and NaCl，different volumes
of template DNA and primer． The improved CTAB DNA extraction method was the best to extract the genomic
DNA of the fronds of the Bird’s nest fern． The optimum reaction system (25 μL)for RAPD amplification of the
Bird’s nest fern DNA was listed as follows:The template DNA (50 mg·L －1)1． 5μL;the primer (1 mmol·
L －1)1． 5 μL;2 × EasyTaq PCR SuperMiX 12． 5 μL．
Key words:Bird’s nest fern;Neottopteris nidus;Asplenium nidus;extration of genomic DNA;RAPD;molecu-
lar marker
683 热 带 生 物 学 报 2012 年