全 文 ：第 23 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　10 月
Vol.23　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2003
五针松胚乳 ISSR—PCR反应体系的建立
吕艳芳 刘桂丰 姜　静 侯英杰
(东北林业大学森林资源与环境学院 , 哈尔滨 150040)
摘　要　采用改良的 CTAB法提取 5种五针松胚乳 DNA ,经检测 ,该方法提取的 DNA 纯度和
含量较高 ,单粒种子胚乳 DNA得率基本满足大量 PCR扩增的需要。建立了稳定的 、可重复的
五针松 ISSR—PCR最佳反应体系及 PCR扩增程序 ,筛选出了扩增条带清晰 、多态性丰富的 16
个 ISSR引物 ,为今后利用五针松种子胚乳开展遗传图谱构建等分子生物学研究提供一个标准
化程序。
关键词　五针松;胚乳;DNA提取;ISSR—PCR
THE ISSR—PCR REACTION SYSTEM S ESTABLISHMENT
ABOUT SEED S ENDOSPERM OF FIVE NEEDLES PINE
L Yan-Fang　LIU Gui-Feng　JIANG Jing　HOU Ying-Jie
(Collage o f Forest Resource and Environments , Nor theast Forestry University , Harbin 150040)
Abstract 　 DNA was ext racted f rom the endosperm of five needles pine by improved CTAB
method.The puri ty of DNA that ex t racted by this method w as high , which w as tested by UV-
spectrophotometer.The yield of single seed s endosperm DNA almost could meet the need of mass
PCR amplif ication.The best stable reduplicative ISSR—PCR reaction systems of five needles pine
and PCR amplification parameters w ere established.Six teen ISSR—PCR primers that had vivid
amplification band and abundant polymorphism had been screened.The w ork provides a standard
prog ram for using need s endosperm of pine to carry out establishment of genetic fingerprinting and
o ther studies of molecular biology in the future.
Key words　five needles pine;seed s endosperm;DNA extracted;ISSR—PCR
　　在针叶树众多遗传图谱作图群体中 ,单倍体
胚乳是最理想作图群体。其性状仅与母本有关 ,
按 1:1分离。可直接利用自然状态下杂合植株自
由授粉的种子 ,取材方便 ,并且可以利用显性标记
进行作图[ 1] 。但是 ,由于胚乳含有高达 80%左右
的脂肪和蛋白质[ 2] ,给胚乳 DNA 的提取带来困
难。于是 ,人们利用萌动的种子提取胚乳中的
DNA ,因为种子在萌动过程中蛋白质 、脂肪等被
转化[ 3] 。然而 ,对于深休眠的松树种子 ,混沙冷
藏萌动处理时间较长 ,影响分子生物学实验进程。
另外 ,在种子处理过程中 ,如果温度 、湿度控制不
当 ,种子会发生霉变 ,如果存放保存不当 ,会遭受
鼠害;对于非常珍贵的 、数量较少的种子 ,此方法
不佳。本文根据松树种子内含丰富蛋白质 、脂肪
基金项目:国家“ 948西伯利亚红松优良种质资源引进”资助(2001-31)
第一作者简介:吕艳芳(1977—),女 ,硕士 ,主要从事林木遗传育种研究。
收稿日期:2003-06-26
的特点 ,采用改良的 CTAB法提取 5 种五针松胚
乳 DNA ,并且建立了 ISSR—PCR反应体系 ,旨为
今后利用五针松种子胚乳开展图谱构建等分子生
物学研究提供资料。
1 实验材料与方法
1.1　材料
西伯利亚红松(Pinus sibirica)、偃松(Pinus
pum ila)种子采自俄罗斯托木斯科 ,华山松(Pi-
nus armandi)采自辽宁 ,柔枝松(Pinus f lexil is)、
北美白皮松(Pinus albicaulis)采自加拿大。在
DNA提取前 ,剥胚处理 ,去除内种皮 ,将所得胚乳
于-20℃冰箱冷冻存放。
1.2　胚乳 DNA的提取
1.2.1　改良 CTAB法提取 DNA
将 1粒种子胚乳放入研钵中 ,加入液氮充分
研磨 ,研磨至乳糜状 , 然后转入 65℃预热的 800
μL提取缓冲液中(2 %CTAB;1.4 mol·L-1Na-
Cl;20 mmol·L-1EDTA;100 mmol·L-1T ris-HCl;
2%β-巯基乙醇),充分混匀 ,置 65℃水浴锅中 ,保
温30 min ,期间不断摇匀 ,随后加入等体积氯仿/
异戊醇(24:1),充分混匀后 ,于 55℃保温 10 min。
室温下 13 800 r/min ,离心 10 min ,吸上清液于新
的离心管中 ,重复抽提 1 ～ 2 次后 ,上清液中加入
2/3体积预冷的异丙醇 ,混匀后室温放置 20 min ,
13 800 r/min ,离心 10 min 。沉淀用 75 %乙醇洗
2次 ,将离心管倒置于吸水纸上 ,使 DNA 干燥 ,然
后溶于 100 μL 无菌水中。加入 RNaseA(终浓度
10μg/mL),置 37℃温箱中保温 2 h;加入 300μL
灭菌的去离子水(使得纯化的 DNA 溶液总体积
为400 μL ,减少抽提过程中 DNA 的损失),然后
加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀 ,室
温下 13 800 r/min ,离心 10 min ,重复抽提 1 ～ 2
次 ,将上清液移至新的离心管中 ,先加入 1/10体
积的 3 mol·L-1NaAc(pH 5.2),然后加入 2倍体
积的无水乙醇沉淀 DNA ,静止 15 min ,室温下 13
800 r/min ,离心 10 min ,弃上清 ,用 75 %的乙醇
洗DNA沉淀 2次 ,将离心管倒置于吸水纸上 ,使
DNA干燥 ,最后溶于 80 μL 0.1×TE 中 ,4℃冰箱
保存备用 。
1.2.2 常规 CTAB法提取 DNA
提取流程与 1.2.1基本相同 ,不同处是:氯仿
/异戊醇(24:1)抽提时未进行 55℃保温处理 ,于
室温下进行 ,抽提次数至少 4次才能有效的去除
蛋白质和脂类物质。
1.3　胚乳 DNA浓度及纯度检测
利用紫外可见分光光度计(Lambda Bio 10
型 ,美国 PE公司)检测胚乳 DNA 的浓度和纯度 ,
同时 ,采用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的 DNA
是否降解 。
1.4　 ISSR—PCR引物筛选及 PCR产物的检测
根据哥伦比亚大学(University of Columbia)
提供的 ISSR引物序列 ,在赛百盛公司合成 60个
2核苷酸重复的引物 ,以 5种五针松胚乳 DNA为
材料 , 参考白桦 ISSR—PCR 反应体系[ 4 ,5] , 在
Biometra DNA 扩增仪上扩增 ,20μL 反应体系中 ,
模板 DNA浓度为40 ng 、0.5 pmol·L-1引物 、2μL
的10×反应缓冲液 、dN TP 各为0.2 mmol·L-1 ,
1 U TagDNA 聚合酶(Promega)。PCR扩增程序
为:94℃变性 5 min ,然后进入下列循环:94℃变
性 30 s 、56℃退火 45 s 、72℃延伸 2 min ,共计 35
个循环 ,循环结束后在 72℃延伸 7 min。从 60个
ISSR引物中筛选出条带清晰 、多态性高 、重复反
应稳定的 16个引物(表 1)。扩增反应结束后 ,用
1.2 %的琼脂糖凝胶分离扩增产物 ,在 UVP 凝胶
成像系统 GDS7600下观察照相。
表 1 ISSR引物序列
Table 1 Sequences o f primers
引物序号与序列
(5′-3′)
引物序号与序列
(5′-3′)
引物序号与序列
(5′-3′)
引物序号与序列
(5′-3′)
807(AG)8 T 812(GA)8A 827(AC)8G 836(AG)8YA
808(AG)8C 818(CA)8G828 (TG)8A 848(CT)8RC
809(AG)8G 820(GT)8C 834(AG)8YT 849(gT)8YA
811(GA)8C 822(TC)8A 835(AG)8YA 853(TC)8
　　注:R代表 A 和 T , Y 代表G 和 C
430 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
2　结果与分析
2.1 五针松胚乳 DNA提取最佳方法的建立
松树胚乳脂类和蛋白质含量较高 ,严重影响
DNA提取的纯度和得率 ,本实验以种子数量较多
的西伯利亚红松为试材 ,采用改良 CTAB法和常
规CTAB法提取胚乳 DNA ,反复比较仅用 1粒种
子胚乳分别采用上述 2种方法提取 DNA ,结果表
明:DNA得率及纯度采用改良 CTAB法均优于常
规CTAB法(表2 ,图1)。采用改良CTAB法提取
胚乳 DNA ,即使是种子较小的柔枝松 ,每粒种子
胚乳所得 DNA的量(2.01μg)也基本满足遗传图
谱构建等分子生物学实验的需要。对于类似于西
伯利亚红松等大粒种子的胚乳所得 DNA的量可
以完全满足遗传图谱构建等分子生物学实验的需
要。
本实验改良 CTAB 法的主要特点是:氯仿/
异戊醇抽提时 55℃保温 10 min(所用温度应该在
氯仿的沸点温度以下),在该温度条件下 ,增强了
氯仿与蛋白质 、脂类等大分子的相互作用 ,可以快
速 、有效的去除与 DNA 结合的大分子 ,与常规
CTAB法相比 ,减少了抽提次数 ,降低了 DNA 的
损失 ,大大提高了 DNA 的得率。
表 2 胚乳 DNA 得率与纯度比较
Table 2 Measurment of yield and purity of the DNA from Endosperm of five-needle pines
树种
Tree species
DNA提取方法
Ext raction s method
of DNA
20粒种子胚乳
平均重
(g)
Average w eight
of 20 seeds
OD260/OD280
DNA 得率
(μg/ g)
Yield of DNA
每粒种子胚乳
所得 DNA的量
(μg)
Product ion of DNA
from single seed s endosperm
柔枝松
(Pinus f lexi lis) 0.031 1.862 1 64.800 0 2.01
华山松
(P.armandi) 0.095 1.840 0 55.663 2 5.30
北美白皮松
(P.a lbica ulis) 改良CTAB 0.035 1.856 7 57.942 8 2.03
偃松
(P.pumi la) 0.041 1.809 5 53.658 5 2.20
西伯利亚红松
(P.sibir ica) 0.076 1.808 7 54.757 9 4.16
西伯利亚红松
(P.sibir ica) 常规CTAB 0.076 1.930 9 20.263 1 1.54
图 1 胚乳总 DNA电泳图谱
F ig.1　electropho resis parameter
of endosperm s w hole DNA
1.西伯利亚红松(常规 CTAB法)2.λDNA 3.柔枝松
4.北美白皮松 5.偃松 6.华山松
7.西伯利亚红松(改良 CTAB法)
图 2 引物 811 ISS R—PCR 扩增电泳图谱
Fig.2　Amplifica tion electropho resis
parameter of primer 811 ISSR—PCR
1.Mark 2.柔枝松 3.华山松 4.北美白皮松
5.偃松 6.西伯利亚红松 7.对照(模板为水)
4314期　　　　　　　　　　　　　　吕艳芳等:五针松胚乳 IS SR—PCR反应体系的建立
2.2　ISS R—PCR扩增程序的建立
ISSR—PCR与 RAPD相比具有重复性高的
优点[ 6 ,7] ,但其反应体系与扩增程序不同也可产
生不同的结果。为了确保 ISSR分析结果的可靠
性和重复性 ,进行 ISSR—PCR 反应体系的优化
是非常必要的。
利用改良 CTAB 法提取的 5种五针松胚乳
DNA为材料 ,根据桦树 ISSR—PCR扩增程序 ,通
过退火温度的梯度试验 ,对退火 、延伸时间的适当
调整 ,建立了重复性好 、分辨率高的五针松胚乳
ISSR—PCR扩增程序:即 94℃变性 5 min ,然后
进入下列循环:94℃变性 30 s 、56℃退火 45 s、
72℃延伸 2 min ,共计 35 个循环 ,循环结束后在
72℃延伸 7 min(图 2)。
3 结论
　　五针松种子的胚乳是由大孢子直接发育而
来 ,这一单倍体组织是优良的作图材料 。单粒种
子胚乳 DNA的得率 ,决定了 PCR扩增的次数和
所用引物的数量 ,最终决定作图密度 。本实验采
用改良的 CTAB法提取五针松种子胚乳 DNA ,最
小种子的胚乳(柔枝松)可进行 50次 PCR反应 ,
大粒种子胚乳(华山松 、西伯利亚红松)可进行
100 ～ 130次 PCR反应。对于大粒种子 ,这样的
得率基本满足图谱构建的需要 。
以 5种五针松为试材 ,建立了重复性好 、分辨
率高的 ISSR—PCR扩增程序 ,初步筛选出 16个
适合于五针松胚乳 ISSR—PCR引物 ,为今后开展
五针松图谱构建等分子生物学研究奠定了基础。
参　考　文　献
1.田敏 , 谭晓风 ,胡芳名.林木分子遗传图谱的构建.生命
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Birch Species Using ISS R Markers.林业研究 , 2002 , 13
(4):281 ～ 284
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出版社 , 2001
432 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷