全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&西北农林科技大学基本科研业务费"
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#
作者简介$张钟仁"
#(&(
#!男!在读硕士研究生!主要从事蛋白质与酶学研究
2)34/5
$
6741
8
6791
8
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!
#!$-<93
"
通信作者$陈
!
鹏!博士!教授!主要从事蛋白质与酶等方面的研究
2)34/5
$
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8
<7;1
!
1>0?4@-;A?-<1
苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化
张钟仁!陈
!
鹏"
"西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
,#!#""
#
摘
!
要$高效分离原生质体是遗传转化(细胞融合和再生培养的基础性工作该实验以苦荞"
!"
#
$
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()*"*"+,
-()
#品种)榆
$)!#
*的叶肉细胞为材料!研究了酶类组合(甘露醇浓度(酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原
生质体分离纯化的影响结果表明$酶解液组成为
#-+B
纤维素酶
C)#"D"-+B
离析酶
C)#"D"-+395
%
E
甘露醇
D
!"3395
%
EF2GD!"3395
%
EHI5D#"3395
%
EI4I5
!
D"-#B
牛血清白蛋白!以第
+
"
,
片真叶为材料!用胶带纸
撕去叶片下表皮后!
+J
黑暗酶解
*7
!以
("":
%
3/1
离心收集!可以获得高质量的原生质体!原生质体产量可达
$
K#"
$ 个%
8
!活力达到
("B
以上&用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率!以分离纯化的苦荞叶肉细
胞原生质体为受体!将双荧光素酶报告基因载体与其混合后!在终浓度为
!"BL2M*"""
介导下!黑暗转化
!"3/1
!
可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶!证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中研
究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础
关键词$苦荞&原生质体&分离和纯化&瞬时转化&双荧光素酶报告载体
中图分类号$
N,&#
&
N,&+
文献标志码$
O
$%"&(#")
!
*+,#-#.(#"))!/,)%#0)(12
3
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3
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X
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8
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8
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X
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X
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^
?/A<93\/14S/91
!
3411/S95<91<;1S:4S/91
!
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X
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8
450
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X
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7
X
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X
3;C)#"D"-+395
%
E3411/S95D!"3395
%
EF2GD!"3395
%
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%
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!
D
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S:410/;1S;Z
=
:;00/91
&
A?45)5?=
9:S;:W;!!
植物原生质体是指除去细胞壁后的!仅有一个
被质膜包围而生存的裸露细胞去除了细胞壁的植
物原生质体!仍保持着细胞全能性!在适宜的条件
下!可以再生成新的与其相似的个体+#,因此被广
泛用于遗传转化(细胞融合+!,以及细胞体突变+%)+,
植物原生质体的分离和纯化!是原生质体融合
以及植物体再生研究的基础+$,植物原生质体是研
究细胞生理功能的一种理想的材料!同时也是原生
质体融合以及外源基因遗传转化的合适受体原生
质体的研究将为基因工程和细胞工程的研究提供广
阔的前景+#!,,要实现植物原生质体的遗传转化及
其再生培养!就需要获得高产量和高质量的原生质
体关于原生质体的分离方法主要有机械法(化学
法和酶解法等其中!应用最广泛(最快速有效分离
原生质体的方法是酶解法+&)#",在分离和纯化大量
有活力的植物原生质体的过程中受到多种因素的影
响!例如酶类配比+##,(酶解时间+#!,(渗透压浓度+#%,
以及材料的生长状态等关于植物原生质体的分离
和纯化的方法在拟南芥+#*,(烟草+#+,(玉米+#$,(水
稻+#,,等植物中已有报道由于不同植物细胞壁组
成成分不同!因此在分离和纯化原生质体的过程中!
方法也略有差别
苦荞在中国历史悠久!营养丰富!是一种重要的
药粮兼用作物但由于其生长周期较长!遗传背景
较为复杂!通过传统育种方法和转基因方法进行品
质改良均存在一定困难!使得有关苦荞分子机制的
研究困难重重!而原生质体作为单细胞系统!是研究
植物生理生化过程和遗传转化的理想受体目前!
关于苦荞原生质体的制备方法还未见报因此开展
苦荞原生质体制备和瞬时转化体系的研究迫在眉
睫本研究以苦荞品种)榆
$)!#
*叶片为材料!研究
酶类配比(酶解时间(甘露醇浓度和离心强度对苦荞
叶肉细胞原生质体分离纯化效果和活力的影响!以
期建立获得高质量的苦荞叶肉细胞原生质体的方
法!为利用原生质体进行苦荞的遗传转化(细胞融合
和再生培养等研究奠定基础
#
!
材料和方法
=-=
!
材
!
料
苦荞)榆
$)!#
*由榆林农业学校提供!常规种植
管理至幼苗有
&
片真叶时待用主要试剂有纤维素
酶"
C)#"
!
Y4]?5SQ91074
#(离析酶"
C)#"
!
Y4]?5S
Q91074
#(二乙酸荧光素"
U` O
!
454AA/1
#(甘露醇
"
O3:;0<9
!
VGL
级#(牛血清白蛋白"
_GO
!
G/
8
34
#(
!)
"
R)
吗啡啉#乙磺酸"
F2G
!
M;1W/;>
#和双荧光素
酶报告检测系统试剂盒"
A?45)5?#
:;
=
9:S;:
4004
X
0
X
0S;3
!
=
:93;
8
4
#
=->
!
方
!
法
=->-=
!
叶片处理
!
选取完全展开的第
+
"
,
片真
叶!用无菌水冲洗干净!之后用
,+B
酒精浸泡
%"0
!
再用无菌水冲洗干净!用滤纸吸干表面的水分后!参
照
a?
等+#&,的方法!用胶带纸将叶片正反两面粘
住!轻轻撕去粘在叶片下表皮上的胶带!使叶肉细胞
暴露!用于原生质体分离
=->->
!
原生质体的分离
!
原生质体分离的方法参
照
Y99
等+#*,的方法!并略作修改使用不同浓度纤
维素酶
C)#"
和离析酶
C)#"
的酶类组合"表
#
#!酶
溶剂为
!"3395
%
EHI5
(
!"3395
%
E!)
"
R)
吗啉#乙
磺酸"
F2G
#和不同浓度甘露醇"
-!
(
"-%
(
"-*
(
"-+
和
"-$395
%
E
#的混合液!用
HbQ
调节
=
Q
至
+-,
!
将酶解液放入
++J
水浴锅中加热
#"3/1
!待恢复
至室温后!加入
#"3395
%
EI4I5
!
(
"-#B _GO
!经
"-*+
$
3
微孔滤膜过滤灭菌按
"-&c#"
"即
"-&
8
去掉下表皮的叶片加
#"3E
酶解液#的比例将去掉
下表皮的叶片加入到酶解液中!于
*":
%
3/1
(
!+J
黑暗条件下酶解处理
!
"
#"7
!每隔
!7
在显微镜下
观察原生质体的形态和活力!选取膜结构完整和在
荧光显微镜下发绿色荧光的原生质体计数!确定最
佳酶解时间实验重复
%
次
=->-?
!
原生质体的纯化
!
酶解结束后!向酶解混合
物中加入等体积的
a+
溶液"
!3395
%
EF2GD#+*
3395
%
ER4I5D#!+3395
%
EI4I5
!
D+ 3395
%
E
HI5
!用
HbQ
调节
=
Q
至
+-,
#!经
!""
目纱布过滤
后!于不同离心速度"
$""
(
""
和
#!"":
%
3/1
#下!室
表
=
!
不同浓度的酶类组合
[4\5;#
!
/`@@;:;1S<91<;1S:4S/9109@;16
X
3;
5/
^
?/A<93\/14S/91
"
a
%
d
#
酶
216
X
3;
# ! % * + $
纤维素酶
C)#"
I;5?540;C)#"
%
B
# # #-+ #-+ ! !
离析酶
C)#"
F4<;:96
X
3;C)#"
%
B
"-% "-+ "-% "-+ "-% "-+
*&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
温离心
*3/1
!弃上清收集原生质体!之后再加入
%
3Ea+
溶液重悬后!冰上放置
%"3/1
!再次离心
*
3/1
!弃上清加入
#3E a+
溶液重悬!得到纯化
后的原生质体
=->-@
!
原生质体的计数与活力测定
!
将原生质体
溶液用
a+
溶液稀释后!取上述少量溶液滴加在
"-#
33
血球计数板上!在光学显微镜下观察!选取膜结
构完整的原生质体进行计数每个样品计数
%
个重
复!取平均值!最后计算原生质体产量
原生质体产量"个%
8
#
e
"
+
个大方格内原生质
体总数
K+K#"
*
K
稀释倍数#%叶片总质量
原生质体活力的测定用
"-"#B
二乙酸荧光素
"
U` O
#对其进行染色将
U` O
溶于丙酮中!配成
浓度为
+3
8
%
3E
溶液!于
* J
保存染色时将
U` O
加入用
a+
溶液悬浮的原生质体中!使其终浓
度为
#""
$
8
%
3E
!黑暗处理
#"3/1
!并用
a+
溶液洗
!
次后立即在荧光显微镜下观察!选取在
*&&13
激
发光下发绿色荧光的原生质体进行计数每个样品
计数
%
个重复!取平均值!最后计算原生质体活力
原生质体活力
e
"发绿色荧光的原生质体%原生
质体总数#
K#""B
=->-A
!
原生质体的瞬时转化
!
!
#
"双荧光素酶报告
基因载体的构建
!
选用
=
ME%)_40/<
"
L:93;
8
4
#载体
作为骨架!该载体自身带有萤火虫荧光素酶"
./$*+,
0(1
%&
"2+1
#开放阅读框!但该阅读框没有启动子
用
!
对分别带有
6"-
%
,7/4
%
和
8+0A
&
)7-$
%
酶
切位点的引物!利用
LIC
技术从
=
IOF_fO%%"#
质
粒上分别扩增出
%+G
启动子&用带有
7/4
%
,8+0A
&
酶切位点的引物利用
LIC
技术从
=
CE)[H
"
L:9)
3;
8
4
#质粒上扩增出带有海肾荧光素酶"
340+22"
40+
5
$)+1
#开放阅读框和胭脂碱合酶终止 子
"
RbG
#的片段将上述
%
个片段胶回收后!分别用
各引物特定的限制性内切酶在
%,J
双酶切
%7
!采
用逐次连接的方法!将酶切好的插入片段与相应限
制性内切酶双酶切的
=
ME%)_40/<
载体相连接!并将
连接产物转化大肠杆菌
[9
=
#"
!经菌落
LIC
(质粒
LIC
和双酶切鉴定为阳性的克隆送往北京奥科生
物技术有限责任公司进行测序鉴定!测序正确的重
组质粒命名为双荧光素酶报告基因载体
!"
L2M)I4
!D介导的原生质体转化
!
将纯化的
原生质体在冰上静置
#+3/1
后!室温离心弃上清!
用
FFM
溶液"
*3395
%
EF2GD"-*395
%
E
甘露醇
D
#+3395
%
EF
8
I5
!
!用
HbQ
调节
=
Q
至
+-,
#重悬原
生质体!使其数量达到
!K#"
+ 个%
3E
向
!3E
离心
管中依次加入
#"
$
E
含有双荧光素酶报告基因载体
的质粒"
!"""1
8
%
$
E
#!
#""
$
E
原生质体和
##"
$
E
L2M*""")I4
!D 溶 液+
*"B
"
9
%
:
#
L2M*"""D"-!
395
%
E
甘露醇
D#""3395
%
EI4I5
!
,!混匀后!黑暗
!+
J
放置
!"3/1
!加入
**"
$
Ea+
溶液终止反应!室温
离心弃上清后!用
#3Eaf
溶液"
*3395
%
EF2GD
"-+395
%
E
甘露醇
D!"3395
%
EHI5
!用
HbQ
调节
=
Q
至
+-,
#重悬原生质体!并转移至
$
孔细胞培养
板中
!+J
静置培养
!"7
后!将原生质体加入
!
3E
离心管中!离心收集原生质体!加入
+"
$
E
原生
质体裂 解 液 "
#"" 3395
%
E H
%
Lb
*
D# 3395
%
E
[`[
!用磷酸调节
=
Q
至
,-&
#!冰上放置
+3/1
!
#!""":
%
3/1
离心
+3/1
!将上清转移至另一干净
#-+3E
离心管中参照
L:93;
8
4
公司的双荧光素
酶报告检测系统试剂盒"
?`45)E?#
C;
=
9:S;:
O004
X
G
X
0S;3
#说明书!先加入
#""
$
E
萤火虫荧光
素酶测定液"
5?X
:;4
8
;1S

#!混匀后!
通过化学发光仪
M59F4Z
#
!"
%
!"E?3/193;S;:
"
L:93;
8
4
公司#检测萤火虫荧光素酶"
U5?<
#活性!
再加入
#""
$
E
海肾荧光素酶测定液"
GS9
=
TM59
#
C;4
8
;1S
#!混匀后!检测海肾荧光素酶"
C5?<
#活性
实验重复
%
次
=->-B
!
数据处理
!
用
GLGG
软件对所有数据进行
统计分析!并用
EG`
法进行差异显著性检验!所有
数据均用平均值
g
标准误"
F;41gG2
#表示!并用
b:/
8
/1&-"
作图
!
!
结果与分析
>-=
!
酶对原生质体产量和活力的影响
以苦荞叶肉细胞为材料!使用不同浓度酶类组
合!
"-+ 395
%
E
甘露醇
D!" 3395
%
E F2GD!"
3395
%
EHI5D#"3395
%
EI4I5
!
D"-#B _GO
酶
解液!黑暗酶解处理
*7
!以
("":
%
3/1
离心收集原
生质体!结果"图
#
#显示!当纤维素酶浓度为
#B
时!
原生质体产量显著低于其它酶浓度组合"
.
#
"-"+
#!随着纤维素酶浓度的升高!原生质体的产量
明显增多当使用
#-+B
纤维素酶
C)#"
和
"-+B
离
析酶
C)#"
时!原生质体产量和活力均达到最大值!
分别为
$-%%K#"
$ 个%
8
和
(#-+B
继续增加两种
酶的浓度后!原生质体的产量和活力均显著降低"
.
#
"-"+
#!说明高浓度的酶液在裂解细胞的同时!对
原生质体本身也存在一定的伤害本研究表明酶解
液中最佳的纤维素酶
C)#"
和离析酶
C)#"
的浓度分
别是
#-+B
和
"-+B

+&#
#
期
!!!!!!!!!!!!!
张钟仁!等$苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化
>->
!
甘露醇对原生质体产量和活力的影响
以苦荞叶肉细胞为材料!使用
#-+B
纤维素酶
C)#"D"-+B
离析酶
C)#"D!"3395
%
EF2GD!"
3395
%
EHI5D#"3395
%
EI4I5
!
D"-#B _GO
的
酶液组合!以不同浓度甘露醇调节渗透压!黑暗酶解
处理
*7
!
("":
%
3/1
离心收集原生质体!结果"图
!
#
显示!当甘露醇浓度为
"-!395
%
E
时!原生质体产量
很低"
!-#!K#"
$ 个%
8
#!这是因为渗透压低导致原
生质体胀破随着甘露醇浓度升高!原生质体的产
量和活力均显著提高"
.
#
"-"+
#当甘露醇浓度为
"-+395
%
E
时!原生质体产量和活力均达到最大值!
分别为
$-$$K#"
$ 个%
8
和
(#-&B
继续增加甘露
醇浓度"
-$395
%
E
#!原生质体产量和活力分别下
降了
!(-*B
和
#(-#B
!均达到显著水平"
.
#
"-"+
#!主要是由于渗透压过高导致原生质体在离心
时难以沉降!同时高渗造成原生质体皱缩!活力降
低因此!酶解液中最佳甘露醇浓度为
"-+395
%
E

>-?
!
酶解时间对原生质体产量和活力的影响
以苦荞叶肉细胞为材料!使用
#-+B
纤维素酶
C)#"D"-+B
离析酶
C)#"D"-+395
%
E
甘露醇
D!"
3395
%
E F2GD!" 3395
%
E HI5D#" 3395
%
E
I4I5
!
D"-#B_GO
酶液组合!黑暗酶解处理
!
"
#"
7
!
("":
%
3/1
离心收集原生质体结果"图
%
#显示!
在酶解时间为
!
"
*7
内!原生质体产量随时间增加
I#
(
I!
(
I%
(
F#
(
F!
分别是
#B
纤维素酶(
#-+B
纤维素酶(
!B
纤维素酶(
"-%B
离析酶(
"-+B
离析酶&不同字母表示在
"-"+
水平存在差异显著&下同
图
#
!
酶类组合对原生质体产量和活力的影响
I#
!
I!
!
I%
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F#
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F!
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X
/;5A41AW/S45/S
X
而显著增加"
.
#
"-"+
#酶解
*7
!原生质体产量和
活力均达到最大值!分别为
$-+&K#"
$ 个%
8
和
("-%B
继续增加酶解时间"
$
(
&
和
#"7
#!原生质
体产量分别下降
*%-"B
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和
&#-$B
!原生质
体活力下降
#!-!B
(
#%-!B
和
%,-(B
!均达显著水
平"
.
#
"-"+
#!说明过长的酶解时间对原生质体有
一定的负作用!导致原生质体破裂由此可见!最适
宜酶解时间为
*7

>-@
!
离心速度对原生质体产量和活力的影响
以苦荞叶肉细胞为材料!使用
#-+B
纤维素酶
C)#"D"-+B
离析酶
C)#"D"-+395
%
E
甘露醇
D!"
3395
%
E F2GD!" 3395
%
E HI5D#" 3395
%
E
I4I5
!
D"-#B_GO
酶解液!黑暗酶解处理
*7
!不同
离心速度下收集原生质体!结果"图
*
#显示!随着离
心速度的增加!原生质体产量先增加后降低!而原生
质体活力逐步降低当离心速度由
$"":
%
3/1
升高
到
("":
%
3/1
时!原生质体产量显著提高
$*-&B
"
.
图
!
!
甘露醇对原生质体产量和活力的影响
U/
8
-!
!
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X
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X
图
%
!
酶解时间对原生质体产量和活力的影响
U/
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#当离心速度为
$"":
%
3/1
时!原生质体活力
最高!达到
(%-%B
!但与离心速度为
("":
%
3/1
时收
集得到的原生质体活力"
(#-%B
#差异不显著"
.
$
"-"+
#综上分析!收集原生质体时最佳离心速度为
("":
%
3/1

>-A
!
原生质体活力检测
U` O
是一种亲脂性物质!可以透过原生质体膜
进入细胞内部!被胞内酯酶分解成一种发荧光的亲
脂性物质!因此!可以用来检测细胞膜的完整性!荧
图
*
!
离心速度对原生质体产量和活力的影响
U/
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-*
!
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可见光下的原生质体&
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经
U` O
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图
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!
原生质体活力检测
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萤火虫荧光素酶&
C5?<-
海肾荧光素酶&
"
表示在
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水平存在差异显著
图
$
!
双荧光素酶活性检测
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+
!
O
(
_
分别表
示在可见光下纯化后的原生质体(
*&&13
激发光下
经
U` O
染色后发绿色荧光的原生质体可以观察
到!
U` O
可定位于细胞膜!指示细胞膜的完整性!说
明在本实验条件下获得的原生质体活力较高
>-B
!
原生质体瞬时转化效率检测
将经测序鉴定正确的由
!
个
%+G
启动子分别驱
动萤火虫荧光素酶"
U5?<
#和海肾荧光素酶"
C5?<
#的
双荧光素酶报告基因载体!与纯化后的原生质体混
合后!在终浓度为
!"BL2M*"""
介导下!黑暗转化
!"3/1
后!用
af
溶液重悬转化后的原生质体并过
夜培养后!使用双荧光素酶报告检测系统试剂盒
"
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#检测!
结果"图
$
#显示!转入双荧光素酶报告基因载体后!
!
种荧光强度分别达到
!-,$K#"
+ 和
#-(+K#"
+
!相
比对照显著提高了
#+*+
和
#*(*
倍"
.
#
"-"+
#!表
明双荧光素酶报告基因载体可成功转入原生质体
中!进一步说明了利用本研究方法制备的原生质体
可满足苦荞瞬时转化研究的需求
%
!
讨
!
论
苦荞作为一种重要的药粮兼用作物!由于其转
基因技术的缺乏使得关于其遗传转化的研究寸步难
行!而使用原生质体进行瞬时表达则克服了这一障
碍!由于原生质体失去了细胞壁这一屏障!因而使其
具有特殊的优点!当使用原生质体作为受体时!外源
基因更易于转化!经培养(选择和分化后!便可以获
得基因工程植株目前!关于苦荞原生质体制备方
法的研究尚未见报道因此!关于苦荞原生质体制
,&#
#
期
!!!!!!!!!!!!!
张钟仁!等$苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化
备方法的研究不仅成为研究其体细胞遗传(细胞信
号转导(建立再生体系的理想材料!更是生物工程及
品质改良的有效手段
不同植物原生质体制备体系不尽相同!原生质
体的产量和活力与材料的选择(酶类组合(酶解时间
以及渗透压等因素密切相关分离和纯化得到的原
生质体通常是用来研究启动子活性(亚细胞定位(蛋
白互作等幼嫩组织分离得到的原生质体活力相对
较高!外源基因转化率也相对较高!因此选择健康适
宜生长阶段的叶片对于原生质体的分离非常重要
本研究在前期的预实验中!确定选用第
+
至
,
片真
叶最佳"结果未显示#!在未去除叶片下表皮的前提
下!各种酶类组合均出现细胞壁去除不完全(细胞成
团等现象!利用胶带撕去下表皮再进行酶解!酶解效
果良好本研究以苦荞叶片为材料!系统分析了分
离纯化原生质体过程中酶类组合(甘露醇浓度(酶解
时间与离心速度对原生质体产量和活力的影响!结
果表明!以苦荞叶片为材料!在
#-+B
纤维素酶
C)#"
D"-+B
离析酶
C)#"D"-+395
%
E
甘露醇
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3395
%
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%
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!
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酶解液中!黑暗处理
*7
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3/1
离心速度收集原生质体!可以获得大量(细胞
膜完整(高活力的原生质体!原生质体的产量为
$K
#"
$ 个%
8
!活力达到
("B
以上
在原生质体制备过程中!消化酶直接影响原生
质体产量+#(,!通常用纤维素酶(果胶酶(离析酶(半
纤维素酶等来酶解细胞壁!其中使用最多的是纤维
素酶和离析酶+#*,廖嘉明等+!",(
Q?41
8
等+!#,(陈名
红等+!!,分别在研究拟南芥(黄瓜和烟草原生质体的
瞬时转化时!均使用这
!
种酶获得的原生质体产量
分别为每克
!-(#K#"
$
(
$
"
,K#"
$ 和
#"K#"
$ 个!
本研究用
#-+B
纤维素酶
C)#"D"-+B
离析酶
C)#"
消化苦荞叶片获得足够量的原生质体"
$K#"
$
#
当原生质体与外界酶解液不能保持等渗时!原
生质体会发生破裂或皱缩!因此!在酶解液中添加渗
透压稳定剂是非常重要的+!%,常用的渗透压稳定
剂有无机盐"
HI5
(
R4I5
(
F
8
Gb
*
#(糖类物质"甘露
醇(蔗糖(山梨醇#!或者是这些物质混合使用+!",!不
同的材料需要的渗透压稳定剂浓度不同+#*!#,)#&,!大
多使用甘露醇来调节渗透压!浓度一般在
"-%
"
"-&
395
%
E
范围内!
Y99
等+#*,在分离拟南芥叶肉原生质
体时甘露醇浓度为
"-*395
%
E
!舒小娟等+!%,在分离
葡萄叶片原生质体时甘露醇浓度则为
"-$395
%
E
!
而本研究中分离苦荞叶肉细胞原生质体时最佳甘露
醇浓度为
"-+395
%
E
!这可能是因为不同植物细胞
质的浓度不同
酶解时间是另一个获得高质量原生质体的重要
条件!酶解时间的选择根据材料的不同而有所差
异+#*,酶解时间过短!导致原生质体产量低!无法
满足下游实验需要!酶解时间过长!对原生质体又有
伤害!导致原生质体活力降低+!*,
a?
等+#&,使用胶
带去掉拟南芥叶片下表皮后!酶解时间需要
!"
"
$"
3/1
!本研究中苦荞叶片在去掉下表皮后!分离原生
质体的最佳酶解时间为
*7
可见不同植物对酶解
时间的需求是不同的!这可能与材料(酶的种类和浓
度等因素有关!因此!要根据具体情况进行探索
在原生质体的收集过程中!离心速度将直接影
响原生质的产量+!+,适宜的离心速度不仅能保证
原生质体不被外力所破坏!同时还能最大程度地得
到高质量的原生质体另外!原生质体没有了细胞
壁的保护!很容易发生破裂!在纯化过程中应尽量减
少搅拌(震荡等外界物理因素的冲击破坏
U` O
是一种亲脂性物质!本身无荧光!只有透
过有活力的原生质膜进入细胞内部!在荧光显微镜
下才能产生荧光!而破碎或者无活力的原生质体则
不能产生荧光因此!可以用它检测细胞膜的完
整性
原生质体的瞬时转化是进一步验证原生质体质
量和活力的重要手段本研究在优化建立苦荞原生
质体制备方法的基础上!在
L2M)I4
!D的介导下利
用双荧光素酶报告基因载体进行瞬时转化!可检测
到高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧荧光素酶!进
一步证明该体系制备的原生质体应用于瞬时表达分
析的可行性本研究构建的双荧光素酶报告基因载
体可用来进行启动子活性分析!其含有的两个
%+G
启动子分别驱动萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶两
个基因的表达!将其中的一个
%+G
启动子替换为待
检测基因的启动子区域!以另一个保留的
%+G
启动
子驱动的荧光素酶作为内参!通过分析转化原生质
体中
U5?<
与
C5?<
的酶活性比值可分析待测基因启
动子的活性!该系统可以有效克服原生质体转化过
程中各样品间的误差本研究制备的原生质体完全
能够满足后续试验的要求!为外源基因遗传转化(原
生质体融合和苦荞再生培养奠定了基础
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