全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：419–430.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0705；http：//www. ahs. ac. cn 419
收稿日期：2015–11–24；修回日期：2016–03–17
基金项目：北京市教委—科学研究与研究生共建项目（201502911110426）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhuyd@cau.edu.cn）
苹果 SUPERMAN 家族基因的组织特异表达及
MdSUP3 的功能分析
许 轲，刘 娜，谢 璇，朱元娣*
（中国农业大学园艺学院，北京 100193）
摘 要：通过半定量 RT-PCR 分析 SUPERMAN 家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.
‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式，通过 MdSUP3 自主启动子驱动
的 GUS 基因表达和 MdSUP3 异位表达分析其功能。结果表明，MdSUP3、MdSUP11 和 MdSUP9a 在所检
测的组织器官中均有表达，MdSUP9b 主要在营养器官中表达，MdSUP5a、MdSUP1b 主要在生殖器官中
表达。MdSUP3 启动子驱动 GUS 基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达 MdSUP3 的转
基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常；与对照相比，转基
因烟草中 ABA 合成酶基因 NtNCED3-2，花青素合成途径的 NtDFR2 和 NtANS1 基因表达显著上升，细胞
分裂素氧化酶基因 NtCKX 和赤霉素氧化酶基因 NtGA2ox4 表达显著下降。异位过量表达删除 C 端 DLELRL
基序的 MdSUP3 基因不影响转基因烟草的生长发育，证明 DLELRL 是基因必不可少的功能域。
关键词：苹果；SUPERMAN 家族；组织特异表达；MdSUP3 基因；异位表达
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0419-12

Expression Analysis of the SUPERMAN Family Genes in Apple（Malus ×
domestica Borkh.）and Function Analysis of MdSUP3
XU Ke，LIU Na，XIE Xuan，and ZHU Yuan-di*
（College of Horticulture Science，China Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract：Semi-quantitative RT-PCR technique were used to reveal the expression patterns of
MdSUPs in leaf buds，young leaves，flower buds，unopened flowers，flowers，bark tissue and young fruits
of Malus × domestica Borkh.‘Fuji’. Expression of GUS driven by MdSUP3 native promoter and ectopic
over-expression of the MdSUP3 gene were adopted to analyze the function of this gene. The results
showed that the expressions of MdSUP3，MdSUP11 and MdSUP9a were detected in all tested tissues.
MdSUP9b mainly expressed in vegetative organs，while MdSUP5a and MdSUP1b mainly expressed in
reproductive organs. The GUS expression was observed mainly in roots，young leaves，young stems and
flower organs in the transgenic Arabidopsis. Over expression of MdSUP3 in tobacco induced
morphological changes，such as dwarfism，shortened internodes，curly leaves，changed flower color and
abnormal floral organs. The expression levels of the NtNCED3-2 related to ABA biosynthesis and NtDFR2

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and NtANS1 related to anthocyanin biosynthesis were significantly increased while NtCKX（cytokinin
oxidase/dehydrogenase）and a gibberelin 2-oxidase gene NtGA2ox4 were significantly decreased in the
transgenic tobacco plants compared to that in the wild types. Over-expression of the MdSUP3 without the
DLELRL motif did not generated morphological changes in transgenic tobacco plants，which indicated that
DLELRL motif was essential for the function of MdSUP3.
Key words：Malus × domestica；SUPERMAN gene family；tissue-specific expression；MdSUP3；
ectopic expression

SUPERMAN 类蛋白能够参与花器官发育、植株生长、形态建成、激素调控及逆境响应（Dinkins
et al.，2002；Jiang et al.，2008a；Nibau et al.，2011）。已研究的 SUPERMAN 类基因中除 TAC1 及
SAZ 外均参与植株花器官的发育，如拟南芥 SUPERMAN 影响花器官发育 ABCDE 模型中 B 类基因
的表达，功能缺失将引起花器官边界消失，影响花器官生长（Bowman et al.，1992；Sakai et al.，1995）；
RBE 基因参与拟南芥花瓣原基的早期发育（Takeda et al.，2004；Krizek et al.，2006）；KNUCKLES
（KNU）基因抑制细胞增殖，调控雌蕊群花器官形态及大小（Payne et al.，2004）；AtZFP2 在雄蕊、
花瓣以及花瓣的离区中表达，参与花器官脱落（Cai & Lashbrook，2008）。LIF、AtZFP12 和 DgSZFP
基因参与植株侧枝发育，异位超表达能够引起植株侧枝显著增加（Dinkins et al.，2003；Nakagawa et
al.，2005；Zhao et al.，2014）。部分 SUPERMAN 类基因参与果实与种子发育，超表达 CsSUP 的拟
南芥角果长和种子数量增加（Zhao et al.，2014），超表达菊花 DgSZFP 使拟南芥的种子增大、质量
增加，大豆 GmZFP1 基因在种子发育后期起重要作用（Huang et al.，2006）。
SUPERMAN 类基因编码的单锌指蛋白是一类转录因子，其 N 端含有一个 Cys2/His2 型锌指结构
CX2CX3FX5LX2HX3H，该区域及其两侧的氨基酸序列为 DNA 结合域，与矮牵牛的 EPF 锌指蛋白结构
相似（Takatsuji et al.，1994；Dathan et al.，2002）；C 端含有富含亮氨酸的序列 L（I）DLXLR（K）
L，类似 EAR-motif，具有转录抑制活性（Ohta et al.，2001；Hiratsu et al.，2002）。模式植物拟南芥
和水稻基因组中分别含有 33 个和 38 个 SUPERMAN 类基因（Englbrecht et al.，2004；Agarwal et al.，
2006），目前已对拟南芥 SUPERMAN（Bowman et al.，1992）、AtZFP1（Chrispeels et al.，2000）、AtZFP10
（Dinkins et al.，2002）、AtZFP11（Dinkins et al.，2003）、RBE（Takeda et al.，2004）、KNU（Payne et
al.，2004）、TAC1（Ren et al.，2004）、JAGGED（Ohno et al.，2004）、AtZFP2 （Cai & Lashbrook，
2008）、AtZFP12（Jiang et al.，2008b）和 SAZ（Jiang et al.，2008a），水稻 STAMENLESS1（Xiao et al.，
2009）、ZOS2-01（刁志娟 等，2011）和 ZOS11-11（李生平 等，2011），矮牵牛 PhSUP1（Nakagawa et
al.，2004）和 LIF（Lateral shoot-Inducing Factor）（Nakagawa et al.，2005）、杨树 PtoSUP1 和 PtoSUP2
（Song et al.，2013），玉米 RAMOSA1（Vollbrecht et al.，2005），大豆 RAMOSA1（Vollbrecht et al.，2005），
陆地棉 GZFP（杨郁文 等，2006），宽叶慈姑 SlSUP（Kazama et al.，2009），烟草 NtSUP（Nibau et al.，
2011），黄瓜 CsSUP（Zhao et al.，2014）和菊花 DgSZFP（Liu et al.，2014），共计 25 个 SUPERMAN
类基因的功能解析。
苹果基因组中分离了 SUPERMAN 类基因 12 个，其中 MdSUP1a 和 MdSUP1b 位于 1 号染色体上，
MdSUP5a 和 MdSUP5b 位于 5 号染色体上，MdSUP9a 和 MdSUP9b 位于 9 号染色体上，MdSUP13a 和
MdSUP13b 位于 13 号染色体上，MdSUP3、MdSUP4、MdSUP11 和 MdSUP12 分别位于 3 号、4 号、
11 号和 12 号染色体上，其蛋白 N 端锌指结构保守序列为 QALGGH，C 端 EAR 基序保守序列为
DLELRL。生物信息学分析显示 MdSUPs 成对出现，分别与矮牵牛 LIF 和 PhSUP1、拟南芥的 AtZFP
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和 SAZ 聚类在一起。其中 MdSUP3 与 LIF 的氨基酸序列相似性高，在一个分类支上，推测具有相似
生物学功能（赵旭勉 等，2012）。本研究中拟通过半定量 RT-PCR 分析 MdSUPs 的表达模式，通过
MdSUP3 自主启动子驱动的 GUS 基因表达和 MdSUP3 异位表达等方法研究基因功能，揭示 MdSUPs
表达模式和 MdSUP3 的功能，为苹果 SUPERMAN 类基因研究及遗传转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
2013 年，在中国农业大学科研基地（北京）15 年生‘富士’苹果树（Malus × domestica Borkh.
‘Fuji’）上分别取休眠叶芽、幼叶、已分化花芽、大蕾期花蕾、已开放花、当年生枝条皮部组织和
花后 56 d 的幼果，用于基因表达分析。选用‘哥伦比亚’型拟南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia
ecotype）和‘W38’烟草（Nicotiana tobacum L.‘Wisconsin 38’）作为转基因试材。样品液氮速冻
并置于–80 ℃冰箱保存，用于 RNA 提取。
总 DNA 提取采用改良的 CTAB 法（Doyle & Doyle，1987）。植物总 RNA 提取采用 SDS–苯酚
法（Verwoerd et al.，1989），提取后 RNA 经 DNaseⅠ（TaKaRa，Japan）消化除去 DNA。通过琼脂
糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，并采用 NanoDrop2000 检测 RNA 纯度和浓度。
取 1 μg RNA 用于反转录合成 cDNA 第一链。反转录过程按照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA
Synthesis Kit（TaKaRa，Japan）的操作说明进行，获得的 cDNA 样品在–20 ℃保存。
1.2 RT-PCR 的引物设计及分析
通过 Primer Premier 5 设计特异引物并通过 DNAMAN 和 Primer BLAST 软件确证引物特异性。
苹果 MdSUPs 半定量 RT-PCR 的引物序列见表 1，烟草激素与花色素相关基因的荧光定量 PCR 引物
序列见表 2。所有引物由三博公司合成。
半定量 RT-PCR 分析：以苹果样本单链 cDNA 为模板，选择 MdActin 为内参基因。通过 MdActin
调整各样本 cDNA 模板用量，进行 MdSUPs 各基因半定量 RT-PCR。PCR 反应体系为 2× Premix Taq
10 μL，正反引物（10 mmol · L-1）各 1 μL，cDNA 0.5 ~ 1.1 μL，ddH2O 补足到 20 μL。RT-PCR 循环
条件为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33 ~ 40 个循环；72 ℃ 5 min。取 5 μL
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表 1 苹果 MdSUPs 半定量 RT-PCR 引物序列
Table 1 Primer sequences of MdSUPs for semi-quantative RT-PCR amplification
基因
Gene
正向引物序列
Forward primer
反向引物序列
Reverse primer
基因登录号
Accession No.
MdSUP1a CATGATGCACATGATCATCATTATG GATACGGAGTCATCTTCCCTGATC HQ418477
MdSUP1b ATCATCATCGTCATCATCATATCCA AGGGATATGGAGTCTTCCCTGAT HQ418478
MdSUP3 CATGGCCTTGGTTGATCAG GGCTCAGGTCCTAGTCTAAGCTC HQ260429
MdSUP4 CAACAATGGAACAAGCACGGT AGGAGGATTTCATCAAACAGA HQ418475
MdSUP5a CATGAGTACTTCTCATCATCATCATCA CAAGCTCAAATTCGTACCCA HQ418469
MdSUP5b TCATCAACATCATCACCAACCT CAATCGAAGTTCCAAATCTAAGTTC HQ418471
MdSUP9a GCCAGGGGTGTTAAGGCC TTAGGGATCATGACCAAGTCGAAG HQ418473
MdSUP9b CTCCTCTGGATGACCATATGAACTATAGAA TTAGGGATCATGACCAAGTCGAAG HQ418474
MdSUP11 ATGGCCTTGGTTTCTCGA GGCTCAGGTCCTAGTCTAAGCTC HM370493
MdSUP12 CAACAATGGAACAAGCACGGT AGGAGGATTTCATCAAACAGA HQ418476
MdSUP13a CATCAACATCATCAGCATCCTC CAATCGAAGTTCCAAATCTAAGTCT HQ418472
MdSUP13b CATGAGTACTTCTCATCATCATCAATA CAAGCTTAAATTTGCACCCC HQ418470）
MdActin CAATGTGCCTGCCATGTATG CCAGCAGCTTCCATTCCAAT AB638619.1
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表 2 烟草激素与花色素相关基因 qRT-PCR 引物序列
Table 2 Primer sequences of genes related to phytohormone and anthocyanidin in Nicotiana tabacum for qRT-PCR
基因 正向引物序列 反向引物序列 基因登录号
Gene Forward primer Reverse primer Accession No.
NtCKX TGGGGAGCGTATGGTTGG ATTGAATGGGCGTTTGGG FJ872120
NtGA2ox4 TGATGACTAACGGGAGGT TAATGATGCCAAAGGTGC KC568201
NtNCED3-1 AGCAGCAATGGCTTTAGATG AGGGGAGTGAGAGACGGG JX101472
NtNCED3-2 AAACCCACTTCCTAAAACA ATTACGGACATAAACCCC JX101473
NtDFR2 ATACCGCCGCTGGTTGTT TCTGCCTTTGGCTGCTCA EF421430
NtANS1 ACTATCCCAAATGCCCCC TGCCGTTACCCACTGTCC JQ866630
NtCHS CGGGGAGAAGAGTTTGGG TTTTTGGTGATGGGGCAG KF927021
NtActin CCAGGTATTGCTGATAGAATGAG CTGAGGGAAGCCAAGATAGAG X69885.1

qRT-PCR 分析：以稀释 4 倍后的烟草花蕾样品的单链 cDNA 为模板，根据试剂盒 SYBR Premix
Ex Taq（TaKaRa，Japan）操作说明进行 qRT-PCR 分析。PCR 反应体系为 2 × SYBR Premix Ex Taq 10
μL，正反引物（10 mmol · L-1）各 0.3 μL，50 × ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 补
足到 20 μL。qRT-PCR 循环条件为 94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。试验结果用 2-ΔΔCT
法对数据进行定量分析。
半定量 RT-PCR 与 qRT-PCR 分析中每一样品设置 3 个生物学重复。
1.3 载体构建
MdSUP3:GUS 载体的构建：依据 GDR 数据库（Jung et al.，2013）中 MdSUP3 基因上游序列设
计特异引物 1305-PRO-MdSUP3-F（ACGCGTCGACATGAAAGAGCCTAAATAAAAAGC）及 1305-
PRO-MdSUP3-R（CATGCCATGGTGCCAAAACCAAACAATTAACC），‘富士’基因组 DNA 为模板
进行 PCR 扩增获得 MdSUP3 基因启动子并将含有该片段的 T 载体与 pCAMBIA1305.1 用 SalⅠ和
NcoⅠ限制性内切酶进行双酶切，酶切回收纯化后的 MdSUP3 基因启动子片段与 pCAMBIA1305.1
载体用 T4 连接酶 16 ℃过夜连接，替代原来载体中的 35S CaMV（花椰菜花叶病毒 Cauliflower mosaic
virus）启动子。
35S:MdSUP3 载体的构建：依据 MdSUP3 基因序列设计特异引物 1305-MdSUP3-F（5′-ATAAAG
ATCTGATGGATTCTAGTCAGGCAA-3′）和 1305-MdSUP3-R （ 5′-ACTGGTCACCTCAGAAGAA
CTTTCTTGTAGTATT-3′），以‘富士’幼叶 cDNA 为模板 PCR 获得 MdSUP3 基因并将含有该片段
的 T 载体与 pCAMBIA1305.1 用 BglⅡ和 BstEⅡ限制性内切酶进行双酶切，将酶切回收纯化后的
MdSUP3 基因片段与 pCAMBIA1305.1 载体用 T4 连接酶 16 ℃过夜连接。
35S:MdSUP3-D（删除 DLELRL 基序的 MdSUP3 基因）载体的构建：依据 MdSUP3 基因序列设
计特异引物 MdSUP3-DLELRL-F（5′-ATAAAGATCTGATGGATTCTAGTCAGGCAA-3′）和 MdSUP3-
DLELRL-R（5′-ACTGGTCACCTCACGAACCAGATAACTG-3′），以‘富士’幼叶 cDNA 为模板 PCR
获得 DLELRL 基序缺失 MdSUP3 基因。酶切和连接与 MdSUP3 基因过表达载体构建相同。
T 载体（pMDTM18-T Vector Cloning Kit）、胶回收试剂（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA
Extraction Kit Ver.4.0）、限制性内切酶 SalⅠ、NcoⅠ、BglⅡ、BstEⅡ和 T4 连接酶（T4 DNA Ligase）
购于 TaKaRa 公司（TaKaRa，Japan）。
1.4 拟南芥的遗传转化和 GUS 基因表达检测
采用蘸花法侵染拟南芥（Clough & Bent，1998，Wiktorek-Smagur et al.，2009）。转基因拟南芥
种子经消毒后播种在 MS + Hgy 10 mg · L-1 培养基上进行筛选，待阳性拟南芥幼苗长至 4 片叶时移栽
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图 1 苹果 MdSUPs 的组织特异性表达分析
1：叶芽；2：幼叶；3：花芽；4：花蕾；5：花；
6：皮部组织；7：幼果。
Fig. 1 Tissue specific expression analysis of MdSUPs
1：Leaf bud；2：Young leaf；3：Flower bud；4：Unopened flower；
5：Flower；6：Bark tissue；7：Young fruit.
至含有草炭︰蛭石 = 1︰1（体积比）的小营养钵中继续培养至结荚期，培养环境为（25 ± 1）℃，光
照 16 h · d-1，强度 30 ~ 40 μmol · m-2 · s-1。
分别在拟南芥幼苗期（种子播种后的 16 d，下同），抽薹期（30 d），盛花期（45 d）和结荚期（60
d）对转基因拟南芥进行 GUS 染色（Jefferson et al.，1987）。
1.5 烟草的遗传转化和转基因烟草的分析
采用叶盘法侵染烟草（王关林和方宏筠，2002）。共培养后烟草叶片置于 MS + IAA 0.2 mg · L-1 +
6-BA 2 mg · L-1 + Hyg 10 mg · L-1 + Cef 500 mg · L-1 的分化培养基中培养，每 2 周继代 1 次。不定芽
再生后，转入 MS + Hyg 10 mg · L-1 + Cef 500 mg · L-1 的生根诱导培养基中培养。培养 1 个月后将生
根的组培苗进行炼苗并移栽至装有蛭石∶田园土∶有机肥 = 1∶1∶1（体积比）的 25 cm × 20 cm 培养
钵中，移至温室，常规管理。温室内培养 2 周后取生理状态一致的叶片做半定量 RT-PCR，剔除目
的基因表达微弱的植株。
在烟草形成顶端花芽并开花后（移栽后 90 d），测定植株高度、节间长度和花器官形态。野生
型与 MdSUP3 超表达转基因烟草于小蕾期（移栽后 100 d）取花蕾用于 RNA 提取。
2 结果与分析
2.1 苹果 SUPERMAN 家族基因的组织特异表达分析
MdSUP3、MdSUP9a 和 MdSUP11 在所有
检测的组织器官中均有表达，MdSUP3 在叶芽、
幼叶、花芽和花蕾中表达量较高，MdSUP9a
在幼叶、开放的花、皮部组织中表达较高，
MdSUP11 除皮部组织表达较低外其他组织均
有较高表达。MdSUP1b 只在幼果中微弱表达，
MdSUP9b 仅在叶芽、幼叶和皮部组织中表达，
MdSUP5a 与 MdSUP13b 仅在花蕾中检测到微
弱表达，MdSUP5b 在叶芽、幼叶、花芽、花蕾、
开放的花、皮部组织中有微弱表达，MdSUP13a
在叶芽、幼叶、花芽、花蕾中有微弱表达（图
1）。MdSUP1a、MdSUP4/12 在循环数 40 时仍
未检测到表达。
MdSUP3 与 LIF 氨基酸序列相似度较高推
测其具有相似生理功能，半定量 RT-PCR 表明
MdSUP3 广泛表达，参与植株营养与生殖生长。
MdSUP3 研究有助于揭示 MdSUPs 在植株生长
发育中的功能。
2.2 苹果 MdSUP3 基因启动子上游调控元件序列分析
通过特异引物 MdSUP3-PRO-F（5′-GCGC AAACAAAAGCCATAATTCT-3′）和 MdSUP3-PRO-R
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图 2 MdSUP3 启动子顺式元件
Fig. 2 cis-elements in the MdSUP3 promoter
（5′-ATGTTCATGTGCCCTCCTAAAG C-3′）
进行 PCR 扩增，分离 MdSUP3 基因开放阅读
框上游 2 180 bp 的序列。
通过 BDGP 网站（http：// www. fruitfly.
org/seq_tools/promoter. html）（Reese，2001）预
测， MdSUP3 启动子的核心区（ predicted
transcription start site）位于 ATG 上游 650 bp
处，识别序列是 TATCAACTATTAAACAAT。
通过 PLANTCARE（http：//bioinformatics. psb.
ugent. be/webtools/ plantcare/html/）（Lescot et al.，
2002）分析 MdSUP3 启动子区域内的顺式作用
元件（图 2），发现 2 个脱落酸响应元件（ABRE），
1 个生长素响应元件（AuxRE），1 个水杨酸响
应元件（TCA- element），1 个干旱响应元件
（MBS），2 个热响应元件（HSE），2 个干旱
脱水响应元件（C-repeat/DRE），3 个逆境胁迫
诱导元件（TC-rich repeats），3 个高转录水平
调控元件（5′ UTR Py- rich stretch），2 个种子
特异表达元件（RY-element），6 个胚乳特异表
达元件（Skn-1-motif），和 1 个胚乳发育元件
（GCN4-motif）。
2.3 转基因拟南芥中 GUS 基因的表达
将 MdSUP3 基因 ATG 上游 2 135 bp 序列
连接至 pCambia1305.1 载体上，构建基因自主
启动子驱动的 GUS 表达载体并通过蘸花法转
到拟南芥中。T0 代转基因拟南芥分别在幼苗
期、抽薹期、盛花期和结荚期进行 GUS 染色分析。结果（图 3）显示，幼苗期在根和叶中检测到
GUS 蛋白（图 3，A）。抽薹期在幼叶、幼茎、腋芽、花序和花芽中检测到 GUS 蛋白，在成熟叶片、
成熟茎及花的其他器官中无染色（图 3，B、C）。在 100 倍显微镜下观察幼嫩花器官，在柱头中检
测到 GUS 蛋白（图 3，D）。盛花期分别在 40 倍和 400 倍显微镜下观察花器官，在柱头、花丝、花
药和萼片中检测到 GUS 蛋白（图 3，E、F）。在结荚期，角果的两端能够检测到 GUS 蛋白（图 3，G）。
MdSUP3 自主启动子驱动的 GUS 基因在幼叶、幼茎、腋芽、花芽及花器官中均有表达，暗示
MdSUP3 基因参与了植株的生长发育过程。
2.4 超表达 MdSUP3 的转基因烟草表型分析
通过农杆菌侵染的叶盘法将 35S:MdSUP3 表达载体转到‘W38’烟草中，经过抗生素 Hyg 抗性
筛选及转基因目的片段 PCR 验证两种方式鉴定再生植株，获取 T0 代转基因烟草。在幼苗期，部分
转基因烟草生长畸形，生长缓慢并最后死亡（图 4，A），其他转基因烟草生长缓慢、叶片卷缩（图
4，B），并且在移栽后依然保持该表型（图 4，C）。
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与野生型相比，转基因烟草显著矮化，节间缩短和叶片卷缩（图 4，F），株高和节间长度分别
为（68 ± 8.0）cm 和（3.4 ± 1.7）cm，而野生型分别为（90 ± 2.1）cm 和（4.3 ± 0.8）cm。转基因烟
草的花序较短且紧簇（图 4，D），花色加深或萼片着红色，50%的植株出现花瓣皱缩、开裂和过度
分化的表型，但未发现边界缺失（图 4，E）。

图 3 转基因拟南芥中的 GUS 组织化学分析
A：幼苗；B：花序；C：茎与叶；D：花蕾；E：柱头、花药和花丝；F：萼片；G：角果。
Fig. 3 Histochemical analysis of the GUS gene in transgenic Arabidopsis
A：Seedling；B：Inflorescence；C：Stem and leaf；D：Flower bud；E：Stigma，filament and anther；F：Sepal；G：Silique.


图 4 野生型（WT）与转基因（35S:MdSUP3）烟草的表型变化
Fig. 4 Morphological changes of transgenic tobacco plants（35S:MdSUP）compared to wild type（WT）
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图 6 MdSUP3-D 转基因烟草生长表型
Fig. 6 Phenotype of transgenic tobacco plants
over-expressed by the MdSUP3-D
图 5 MdSUP3 超表达烟草基因表达变化
Fig. 5 qRT-PCR analysis of expression changes of genes in
transgenic tobacco plants over-expressed by MdSUP3
2.5 MdSUP3 的超表达对烟草激素及花色素相关基因表达量的影响
烟草细胞分裂素降解酶基因（NtCKX）、GA
氧化酶基因（NtGA2ox4）、ABA 合成关键酶基
因（NtNCED3-1 和 NtNCED3-2）、花色素合成
关键酶二氢黄酮醇 4–还原酶基因（NtDFR2）、
花青素苷合成酶基因（NtANS1）和查尔酮合成
酶基因（NtCHS）荧光定量分析表明：MdSUP3
的超表达促进了 NtNCED3-2（P < 0.01），NtDFR2
和 NtANS1（P < 0.05）表达，抑制了 NtCKX 和
NtGA2ox4 的表达（P < 0.01），但对 NtNCED3-1
和 NtCHS 影响不显著（图 5）。转基因植株中
NtNCED3-2 、 NtDFR2 、 NtANS1 、 NtCKX 和
NtGA2ox4 的表达量分别为野生型的 285.87、
1.60、1.79、0.47 和 0.13 倍。MdSUP3 影响激素
合成相关基因表达，促进花色素合成基因表达。
2.6 超表达 MdSUP3-D 转基因烟草表型统计
删除 DLELRL 的 MdSUP3 基因序列
MdSUP3-D 构建超表达载体并通过农杆菌侵染
烟草，获得删除MdSUP3-D超表达转基因烟草。
转基因烟草幼苗期无畸形，无生长缺陷，叶片
无卷曲；花期观察，转基因烟草表型与野生型
无差异，叶片无卷曲，花器官形态正常，无颜
色改变（图 6）。删除 DLELRL 的 MdSUP3 基
因超表达，并未对转基因烟草的生长发育产生
影响，说明删除 DLELRL 序列后 MdSUP3 功
能丧失，确证该基序为 MdSUP3 功能必不可缺
的功能域。
3 讨论
SUPERMAN 类氨基酸保守域序列高度保守，非保守域序列差异较大，导致其功能既有一定的
保守性又有一定的差异性（Englbrecht et al.，2004；Zhao et al.，2014）。本研究中，苹果 SUPERMAN
类基因 MdSUP3 超表达引起烟草植株矮化，叶片缩小、卷缩和花器官畸形，与 SUPERMAN、AtZFP10、
AtZFP11 和 NtSUP 等基因超表达植株的表型相似（Bereterbide et al.，2001；Dinkins et al.，2002，2003；
Nibau et al.，2011），表明 MdSUP3 能够影响细胞分裂和分化，参与植物的生长发育与形态建成。
启动子顺式元件预测发现MdSUP3启动子中含有4个激素响应元件和9个种子或胚乳特异表达元件，
这些元件可能影响 MdSUP3 在植株营养与生殖生长发育中的功能。MdSUP3 与矮牵牛的 LIF 基因的
氨基酸序列相似度高，为 45.6%（赵旭勉 等，2012），两个基因超表达烟草均表现出矮化，花瓣畸
形、不对称生长及颜色加深的表型，表明 MdSUP3 与 LIF 基因生理功能具有相似性。但过量表达
许 轲，刘 娜，谢 璇，朱元娣.
苹果 SUPERMAN 家族基因的组织特异表达及 MdSUP3 的功能分析.
园艺学报，2016，43 (3)：419–430. 427

MdSUP3 的转基因烟草中并未出现 LIF 转基因的烟草侧枝显著增加的表型，说明 MdSUP3 与 LIF 的
基因功能的差异性。该结果与 SlSUP、PhSUP 和 CsSUP 在 SUPERMAN 缺失拟南芥突变体 sup 中超
表达结果类似：SlSUP、PhSUP 和 CsSUP 与拟南芥 SUPERMAN 氨基酸序列相似度较高，且生物信
息学分析将以上基因聚类在一起，但 SlSUP、PhSUP 和 CsSUP 超表达均不能完全恢复 sup 生长缺陷
（Nakagawa et al.，2004；Kazama et al.，2009；Zhao et al.，2014）。
细胞分裂素（CK）能够参与植株花序的分化与生长。细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）是植
物细胞分裂素降解途径中的关键基因，CKX 基因的表达水平能够显著影响植株内源 CK 水平（许智
宏和薛红卫，2012）。MdSUP 超表达烟草中矮化、叶片皱缩、花序较短且紧簇，与 35S:RNAiGhCKX
转基因烟草植株相似（Zeng et al.，2012），暗示 MdSUP3 通过影响植株 CK 代谢影响植株生长。本
研究中 MdSUP3 超表达烟草中 NtCKX 表达受到抑制，仅为野生型的 0.47 倍。表明 MdSUP3 能够通
过调节转基因 NtCKX 基因的表达影响转基因烟草中 CK 水平升高进而导致矮化、叶片皱缩、花序较
短且紧簇的表型。赤霉素（GA）是一种重要的植物激素，参与植株生长发育，影响茎秆生长与节间
伸长，GA 缺失将导致植株矮化。GA2ox、GA3ox 与 GA20ox 是调节内源 GA 水平的关键基因，其中
GA3ox 与 GA20ox 参与 GA 活化而 GA2ox 参与 GA 钝化（许智宏和薛红卫，2012）。烟草 GA2ox
基因受内源 GA 水平的反馈调节，其含量减少将抑制其表达（Gallego-Giraldo et al.，2008）。超表达
SUPERMAN 引起植株矮化，植株中 GA20ox 表达受到抑制（Bereterbide et al.，2001）。AtZFP10 超
表达植株表现出矮化性状，且该性状可通过外施 GA 缓解（Dinkins et al.，2002）。本研究中 MdSUP3
超表达的转基因烟草，GA2ox4 表达受到严重抑制，仅为野生型中的 13%，暗示 MdSUP3 超表达可
能抑制了内源 GA 的合成，进而导致植株矮化。脱落酸（ABA）对植物生长有抑制效应且与 GA 有
拮抗作用（Golldack et al.，2013；Lin et al.，2015），外施 ABA 能够抑制 GA20ox 的表达，降低植
株内 GA 的含量（Zentella et al.，2007），但 SUPERMAN 类基因能否影响 ABA 相关基因表达的未
有报道。本研究中发现转基因烟草中 ABA 合成关键基因 NtNCED3-1 的表达无变化，但 NtNCED3-2
表达显著上调，为野生型的 285.87 倍，推断 MdSUP3 可能通过促进 ABA 合成基因 NCED3-2 表达，
提高内源 ABA 含量进而抑制內源 GA 的合成，使 GA2ox4 的表达受到抑制，导致植株矮化。
植物花色素合成途径中，二氢黄酮醇 4–还原酶基因 DFR 和花青素苷合成酶基因 ANS 是关键酶
（Mato et al.，2001；赵云鹏 等，2003）。烟草中含有两个 DFR 基因（NtDFR1 和 NtDFR2）和两个
ANS 基因（NtANS1 和 NtANS2），其中 NtDFR2、NtANS1 研究较为深入。‘珊西’烟草中 NtDFR2 缺
失直接导致突变体 xwf1 花瓣无花色素合成，花瓣呈白色（Kazama et al.，2013）；NtANS1 基因启动
子具有花瓣特异表达特性，由其驱动的 GUS 基因仅在花瓣表达（Lim et al.，2013）。本研究中 MdSUP3
超表达导致烟草花器官花色加深，转基因烟草中的 NtDFR2 和 NtANS1 基因表达水平分别为野生型
烟草的 1.60 和 1.79 倍，说明 MdSUP3 基因通过促进花色素相关基因的表达，影响花中色素的积累。
植物多种转录因子中含有 EAR 及 ERA-like 基序，如 AUX/IAA（Tiwari et al.，2004）、ERF（Ohta
et al.，2001）、MYB（Kranz et al.，1998）和 SUPERMAN 类蛋白（Hiratsu et al.，2004）。该基序
在转录因子中起到抑制下游基因转录的功能（Hiratsu et al.，2002）。拟南芥 SUPERMAN 基因 C 端
的 DLELRL 序列，是转录抑制的核心区域（Hiratsu et al.，2004）。AtZFP10 和 AtZFP11 基因中删
除 DLELRL 序列后超表达，不会对转基因植株产生影响（Dinkins et al.，2002，2003）。本研究超
表达删除DLELRL基序的MdSUP3基因，转基因植株与野生型无差异，验证了MdSUP3中的DLELRL
序列与其他拟南芥 SUPERMAN 蛋白中的 DLELRL 序列一样，为转录因子的抑制域，是 MdSUP3
功能行使功能必不可少的功能域。
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综上所述，苹果基因组中含有 12 个 SUPERMAN 类基因，具有组织表达特异性。MdSUP3 基因
在根尖、幼叶、幼茎和花等器官中均有表达，参与植株的营养生长与生殖生长。超表达 MdSUP3 基
因导致转基因烟草矮化、节间缩短、叶片卷缩、花序较短且紧簇、花器官颜色加深及畸形，并影响
激素及花色素合成途径中相关基因的表达。DLELRL 基序是 MdSUP3 必不可少的功能域。

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